Métodos Imunodiagnósticos

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO (UFPE)
IMUNOLOGIA E SOROLOGIA
Prof. Paulo José Cunha Miranda
Rômulo Pessoa e Silva
Outubro, 2019
Procedimentos usados em Imunodiagnóstico I – Precipitação, Aglutinação e Imunohemólise 
Imunodiagnóstico
Reagentes não marcados (interação Ag-Ac)
Precipitação
Aglutinação
Imunohemólise
Reagentes marcados 
ELISA 
Radioimunoensaio
Imunofluorescência
Citometria de Fluxo
Western Blotting
amarimmunodiagnostics.com
Imunodiagnóstico
Precipitação ou imunoprecipitação
Baseia-se na interação entre antígenos específicos e anticorpos que podem estar contidos na amostra a ser analisada.
O imunocomplexo formado é insolúvel e possui grande peso molecular, dessa forma ele precipita no meio.
Pode ser empregado para detecção de anticorpos e para a detecção/purificação de antígenos.
Imunodiagnóstico
Precipitação: complexo Ag-Ac
Curva de Heidelberger
Imunodiagnóstico
Precipitação 
Em solução 
Em gel
Imunodiagnóstico
Precipitação em solução 
 Quantidades de Ag solúvel são adicionadas a uma quantidade fixa de soro contendo o Ac. 
A medida que a quantidade de Ag aumenta, a quantidade de precipitado também aumenta até um máximo, para depois diminuir.
Precipitado visível
Concentrações equivalentes de Ag e Ac
Imunodiagnóstico
Precipitação em gel
Imunodifusão simples em tubo
Imunodifusão radial simples
Imunodifusão radial dupla
Imunoeletroforese 
Imunodiagnóstico
Precipitação em gel
Imunodifusão simples em tubo
Ocorre a imobilização de um dos componentes (anticorpo ou antígeno) no meio (gel). Após a solidificação do gel, adiciona-se o outro componente e aguarda-se (por cerca de uma semana) a formação da linha de precipitação na zona de equivalência. 
Antígeno
Anticorpo imobilizado em gel
Imunodiagnóstico
Precipitação em gel
Imunodifusão simples em tubo
Gradiente de Ag vai se formando
Imunodiagnóstico
Precipitação em gel
Imunodifusão radial simples
Pode ser empregada para dosar antígenos ou anticorpos
SlidePlayer
Gel impregnado com um Ac específico (placa de petri).
Perfura-se o gel e adiciona a amostra do paciente.
Controles positivos.
Incubação (48h).
Medição dos halos.
vdocuments.mx
Imunodiagnóstico
Precipitação em gel
Imunodifusão radial simples
Quantificação
Empregam-se soros com concentrações conhecidas de antígeno (curva-padrão).
Relação concentração/diâmetro2
O diâmetro é diretamente proporcional à concentração de Ag ou Ac na amostra. 
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Imunodiagnóstico
Precipitação em gel
Imunodifusão radial simples
Podem ser analisadas várias amostras ao mesmo tempo
produto.mercadolivre.com.br
Imunodiagnóstico
Precipitação em gel
Imunodifusão radial dupla
Detecção de anticorpos
Apenas o gel é adicionado em placa de petri.
Espera-se solidificar e perfura-se o gel, adicionando os antígenos, os controles positivos e a amostra do paciente.
Incubação (48h).
Verificação da formação de linhas (complexo Ag-Ac).
scielo.br
Amostra do paciente
Diferentes antígenos purificados (1 – 6)
Utexas
Linha reagente (Ag-Ac)
researchgate.net
Imunodiagnóstico
Precipitação em gel
Imunodifusão radial dupla
A e B
A
Ac
Oukas.info
Bio-Resource
Imunodiagnóstico
Precipitação em gel
Imunoeletroforese 
Aplicada para a análise das imunoglobulinas no soro 
SlidePlayer
Aplica-se uma corrida eletroforética após a adição da amostra no gel já solidificado.
As proteínas são separadas.
Aplica-se depois em uma canaleta os anticorpos de interesse.
Verificação da formação de linhas (complexo Ag-Ac) após a difusão dupla - incubação.
Canaleta
Imunodiagnóstico
Precipitação em gel
Imunoeletroforese 
pleiad.umdnj.edu
Biolider
São geralmente testes simples, de fácil execução e baixo custo.
Contudo, apresentam falhas de sensibilidade e problemas com a reprodutibilidade.
Apresentam um período de incubação longo (24-72h).
Aplicações: histoplasmose, candidíase, aspergilose, meningite, septicemia, etc.
Imunodiagnóstico
Precipitação
Imunodiagnóstico
Aglutinação
É caracterizada pela formação de agregados visíveis como resultado da interação de anticorpos específicos e partículas insolúveis que contém determinantes antigênicos na superfície.
Utilizada no diagnóstico de doenças causadas por vírus, bactérias, protozoários e fungos; doenças auto-imunes; detecção de hormônios e tipagem de grupos sanguíneos.
Imunodiagnóstico
Aglutinação
Direta – eritrócitos (hemaglutinação), bactérias, fungos.
Indireta ou passiva – adsorção de anticorpos ou antígenos solúveis proteicos ou polissacarídeos na superfície de micropartículas inertes (suportes), como látex ou hemácias fixadas pelo formol. Ex: Coombs indireto. 
Métodos qualitativos – Ex: tipagem sanguínea (aglutinação direta), teste de gravidez (inibição da aglutinação - látex). 
Métodos semi-quantitativos – Ex: diagnóstico da peste (hemaglutinação indireta).
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Criatividade e Ciência
Imunodiagnóstico
Aglutinação
Direta
Tipagem sanguínea
Anti-A ou B
Imunodiagnóstico
Aglutinação
Direta
Teste de Coombs direto (AHAI)
Imunodiagnóstico
Aglutinação
Indireta
Teste de Coombs indireto (AHAI)
Slideplayer
www.microbiologybook.org
Imunodiagnóstico
Aglutinação
Indireta
Hemaglutinação indireta semi-quantitativa:
Toxoplasmose;
 Doença de chagas;
 Peste, etc.
Imunodiagnóstico
Aglutinação
Indireta
Aglutinação do látex 
Ex: Detecção da proteína C reativa, fator reumatoide, etc.
ResearchGate
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Imunodiagnóstico
Inibição da aglutinação - látex
Imunodiagnóstico
Aglutinação
São procedimentos rápidos e confiáveis. 
De fácil execução (leitura visual). 
Baixo custo.
Apresentam boa especificidade e reprodutibilidade.
Sensibilidade é variável (pode ser pequena).
Imunodiagnóstico
Imunohemólise
Fixação do complemento 
Baseia-se na ativação ou não da via clássica do sistema complemento para determinar se uma amostra possui ou não os anticorpos para determinada patologia. Pode ser qualitativa ou semi-quantitativa.
Soro do paciente é incubado para a inativação do complemento provavelmente existente, para que não haja interferência no teste; 
1 O soro inativado é incubado com antígenos específico para os anticorpos pesquisados. 
2 O complemento é inserido para identificar a presença ou não do complexo antígeno-anticorpo. 
3 São então adicionadas hemácias revestidas por anticorpos contra o antígeno. 
4 Caso haja anticorpos no soro, o complemento terá sido fixado previamente e as hemácias não sofrerão hemólise (precipitado vermelho no fundo do tubo após a centrifugação - positivo).
Fixação
Imunodiagnóstico
Imunohemólise
Vantagens do teste de fixação de complemento: 
Baixo custo; 
Boa especificidade;
Boa sensibilidade; 
Desvantagens do teste FC:
Podem ocorrer problemas nos resultados em casos de: perda da atividade do complemento; diluições inadequadas; contaminação em soluções (gerando efeito anticomplementar); sensibilização insuficiente de hemácias; baixa especificidade (dependendo do antígeno adsorvido na hemácia); hemácias fragilizadas; soro não-inativado.
OBRIGADO!!!
romulops12@gmail.com