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TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE GRAM 1. Para que serve a técnica de coloração de Gram? No que ela se baseia? A técnica de coloração de Gram é utilizado pois classifica as bactérias em dois grandes grupos: Gram-positivas e Gram-negativas, diferenciando-as. Entre os fatores que irão diferenciar esses dois tipos, está a coloração das bactérias, a composição e propriedades químicas e físicas das paredes celulares. 2. Antes da aplicação da técnica de coloração de gram é necessário realizar as etapas de preparo de esfregaço fixação. Explique no que consiste e como são realizados esses procedimentos. Por que a etapa de fixação necessária? Preparo do esfregaço: Para fazer uma preparação corada é necessário preparar o esfregaço na lâmina, o que corresponde às etapas que antecedem uma coloração. Deve-se flambar a alça de platina e deixá-la esfriar um pouco próximo ao fogo. Com a utilização da mesma, colocar uma gota de solução salina estéril no centro de uma lâmina limpa e seca, lembrando que, ao abrir e fechar o recipiente de solução salina, deve-se passar a boca de tal nas chamas do Bico de Bunsen, evitando contaminação. Posteriormente, deve-se novamente flambar a alça de platina, esfria-la, e retirar uma colônia de bactérias localizada na placa de petri, lembrando-se de sempre mantê-la próximo ao fogo e manuseá-la com cuidado (o risco de contaminação deve ser considerado sempre). Assim, espalha-se as bactérias na lâmina, homogeneizando a solução salina, tentando obter um esfregaço fino, já que um esfregaço muito grosso dificulta a observação individual das bactérias no microscópio, por uma grande concentração (uma em cima da outra). Em sequência, precisa-se flambar a alça e deixá-la secar. Antes de se fazer agir os corantes para a diferenciação das bactérias, é necessário fixar o esfregaço sobre a lâmina, onde o método mais usado consiste em passar a lâmina com o esfregaço a ser fixado sobre a chama do bico de Bunsen várias vezes, de forma rápida, onde que a chama entra em contato direto com o lado oposto ao esfregaço. A fixação pelo calor é muito importante e fundamenta-se na coagulação das proteínas da estrutura microbiana, que mata o microrganismo e faz com que fique aderido à lâmina, não desprendendo-se facilmente nas etapas da coloração, considerando que se possui um grande manuseio com a lâmina em todo o processo. 3. Descreva as etapas da técnica de coloração de gram explicando o objetivo de de cada etapa e a reação que ocorre na parede celular das bactérias gram-positivas e gram-negativas. Etapa 1: Esfregaço, etapa explicada anteriormente, com o objetivo principal de inserir uma colônia de bactérias sobre a lâmina, juntamente com a solução salina. Etapa 2: Fixação, processo em que se passa a lâmina várias vezes no fogo, de maneira rápida, com o intuito de matar e aderir os microrganismos na lâmina Etapa 3: Adição do corante Cristal Violeta por 2 min, onde que, por sua vez, irá colorir a bactéria (tanto a gram- , como a gram +) em violeta/azul Etapa 4: Adição de Lugol por 2 min, substância constituída por iodo, ao qual formará um complexo com o cristal violeta (Complexo CV-I) no interior da célula, que será muito grande para passar pela parede celular, deixando tanto a gram + com a gram - violetas. O Lugol também é conhecido como o mordente do processo, ou seja, substância associada com a função específica de manter a durabilidade da cor, conferindo maior resistências nas lavagens. Etapa 5: Lavar a lâmina com água, sendo este uma etapa facultativa, querendo somente retirar o excesso de produto. Nota: cuidado para não direcionar a água direto na colônia, pois pode ocorrer modificações nos resultados. Etapa 6: Adição de solução álcool acetona por 30 segundos. ❖ Nas gram +: ocorre a desidratação do peptideoglicano, diminuindo a porosidade e a permeabilidade, se contraindo e mantendo o complexo CV-I dentro da célula, permanecendo violeta ❖ Nas gram -: a solução dissolve a membrana externa, aumentando a porosidade da parede celular, onde o complexo CV-I é removido da célula, deixando-a incolor. Etapa 7: Lavar a lâmina com água, para a retirada de excesso de produto. Etapa 8: Adição do corante Safranina por 30 segundos. ❖ Gram +: ainda possuindo o complexo CV-I, a cor violeta mascara a coloração vermelha, fazendo com que a bactéria permaneça com sua cor arroxeada ❖ Gram -: estando incolor, a célula adquire a cor avermelhada do corante. Etapa 9: Lavar com água, retirando o excesso de corante Etapa 10: Observar no microscópio com a objetiva de imersão (x100), e observar a cor da bactéria, fazendo assim, sua distinção. 4. Qual a classificação da bactéria observada na aula prática? Como você chegou a essa conclusão? A Bactéria a qual observamos, era uma Gram +, considerando que, ao observá-la no microscópio, vemos uma coloração azulada/arroxeada, ou seja, na adição do álcool acetona, sua camada de peptidoglicano diminuiu a permeabilidade e se contraiu, fazendo com que o complexo CV-I, ao qual era responsável pela coloração roxa, ficasse preso na célula, e mascarando o corante avermelhado adicionado nas etapas posteriores. E assim, caso fosse uma gram -, não assumiria tais características, considerando que a mesma iria ter adquirido a cor vermelha. Referências TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, CL. Microbiologia. 10. ed., Porto Alegre: Artmed, 2010.
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