Microbiologia de Processos

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1. Introdução
As especiarias ou condimentos são conhecidos e utilizados desde tempos remotos, utilizados na culinária para proporcionar sabores diferentes nas comidas, suas características favorecem o sabor dos alimentos, o desejo de comer e desta forma estimula o apetite, segundo Germano & Germano¹ as especiarias são usadas na prática culinária, para conferir sabor e aroma, não tendo, a maior parte dela, qualquer valor nutritivo, entretanto, quando estes produtos apresentam baixa qualidade higiênico-sanitária pode estabelecer um perigo à saúde dos consumidores.
Os condimentos, do ponto de vista microbiológico são importantes pois em contato com a umidade e temperaturas adequadas podem sofrer ataques de bolores, também podem conter grande número de microrganismos que ocasionalmente causariam a deterioração nos alimentos, por outro lado alguns, apresentam atividade antimicrobiana podendo ajudar a preservação de alimentos, e outros ainda estimulam o metabolismo microbiano, assim a alteração e/ou formação de toxinas seria mais rápida.²
	FRANCO & BERGAMO³ afirmam que, embora estes “temperos prontos” contenham elementos desfavoráveis a proliferação microbiana, mesmo reduzindo os níveis de contaminação podem assumir papel importantes, uma vez que estes “temperos prontos” são destinados principalmente a alimentos perecíveis, como as carnes, que são meios propícios ao desenvolvimento de microrganismos. Se a qualidade microbiológica do “tempero pronto” utilizado for insatisfatória, o alimento ao qual foi adicionado poderá ser o causador de toxinfecções alimentares, ou mesmo deteriorar-se antes do previsto.
Estes elementos desfavoráveis são a quantidade de sal contida no tempero pronto e os óleos essenciais provenientes de iguarias como alho, cebola, orégano entre outros. Em estudos envolvendo 32 óleos essenciais extraídos de condimentos, demonstrou-se que os óleos de pimenta-da-jamaica, canela, cravo, cebola, alho, orégano, segurelha e tomilho foram, em ordem decrescente, os maiores inibidores de oito gêneros de levedura. (CONNER et al., 1984a, b)4.
Porém, tanto as condições sanitárias das plantações influem nos níveis de contaminação, assim como os cuidados na colheita. Por outro lado, o armazenamento em galpões velhos, úmidos, mal ventilados, com paredes cobertas de bolor, propiciam a multiplicação das espécies contaminantes e/ou a invasão por novas espécies a partir do ambiente. A perda de qualidade das especiarias traduz-se por diminuição das propriedades sensoriais como cor, odor e sabor. As propriedades antimicrobianas dos condimentos e de seus óleos essenciais têm sido estudadas principalmente com relação ao efeito inibidor de microrganismos patogênicos presentes em alimentos. Portanto todos os parâmetros de qualidade na produção de temperos prontos deve ser considerado afinal apesar da ação dos óleos essenciais naturais presente, não é suficiente para um alimento longe de contaminações e dentro dos padrões legais.
2. Metodologia
	No laboratório de Microbiologia de Processos da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS) foi analisada uma amostra de tempero completo caseiro obtido em um mercado do bairro Feira V na cidade de Feira de Santana, no mês de Março. A amostra foi utilizada para contagem de Coliformes totais e termotolerantes, E. coli, bolores e leveduras, Stafilococcos coagulase positiva, mesófilos e psicrotróficos totais, Bacillus cereus e ausência ou presença de Salmonela. Estas verificações foram comparadas com a RDC n°12 de 2001, para avaliação microbiológica da amostra e verificação de sua qualidade, a mesma foi submetida a testes de verificação. 
	A amostra indicativa escolhida para análise foi identificada e no início de cada procedimento foi traçado um plano de trabalho semanal, sendo efetuados registros das análises e qualquer outra observação antes e após os experimentos. 
	Os cuidados pessoais são de grande importância para a obtenção de resultados satisfatórios, portanto utilizou-se jaleco, as mãos foram lavadas de acordo com um procedimento operacional padronizado (POP) como também a utilização de sanificante nas mãos ao entrar no laboratório e sempre que necessário como em eventuais saídas do laboratório.
	Alguns cuidados especiais foram tomados na colheita da amostra para a análise microbiológica do tempero, todo o material utilizado para a retirada da amostra encontrava-se estéril sendo toda operação efetuada próxima a um bico de Bunsen com a chama a meia altura. 
	No preparo das diluições sucessivas foram utilizados diversos diluentes. Para a diluição inicial foram retiradas assepticamente porções de 25 g da amostra colocando-se em erlenmeyer esterilizado contendo 225 mL do diluente escolhido e foi homogeneizado por alguns minutos em velocidade reduzida para não danificar as células microbianas que poderiam existir. 
2.1 Materiais
· Tubos de ensaio;
· Placas de Petri;
· Alças de Drigalski;
· Espátula;
· Bicos de Bunsen;
· Micro Pipetas;
· Etiquetas;
· Erlenmyer;
· Balança.
2.2 Reagentes
· Meios de cultura;
· Ágar.
2.3 Procedimentos microbiológicos 
 A amostra foi submetida às análises microbiológicas de acordo com a metodologia recomendada pela American Public Health Association (APHA, 2001). A avaliação dos resultados foram comparados aos padrões microbiológicos de referência, descritos na RDC nº 12 de 2001, do Ministério da Saúde (BRASIL, 2001).
2.3.1 Teste Presuntivo
	O teste presuntivo visou detectar a presença de microrganismos fermentadores de lactose, os grupos coliformes.
 O teste baseou-se na utilização de um meio de cultura rico em nutrientes, que facilitou o rápido crescimento dos microrganismos. O método ofereceu como fonte de carbono apenas lactose, a qual é fermentada pelos coliformes com produção de ácidos e gás, sendo evidenciado no tubo de ensaio.
2.3.2 Determinação do NMP de coliformes totais e termotolerantes (Teste confirmativo) 
	O método utilizou como meio o Caldo VBBL (verde brilhante bile lactose 2%), que inibiu o crescimento bacteriano Gram + através dos inibidores bile e verde brilhante, e tem como único carboidrato a lactose. Assim, a produção de gás nos tubos, nas condições do teste podem indicar o desenvolvimento de bactérias Gram – que fermentaram a lactose (os coliformes) .
2.3.3 Determinação de E. coli
	O teste baseou-se na técnica de diluições sucessivas e plaqueamento por incorporação do meio de cultura. Fez-se utilização dos meios positivos de cultura seletivo “caldo E.C.” sendo repicadas em placas para ágar EMB contendo Leosina Azul de Metileno e incubou-se a 35/24h. A positividade do teste é observada caso haja produção de colônias típicas de E.coli, ou seja, 2 a 3 mm de diâmetro, com brilho metálico esverdeado ou com o centro escuro abrangendo praticamente toda a colônia.
2.3.4 Contagem de Bolores e Leveduras 
e Estafilococus coagulase positiva
	Utilizou-se a técnica de plaqueamento de superfície para essas analises. 
	Para a contagem de bolores e leveduras utilizou-se o PDA ( potato dextrose ágar acidificado) para inibição das bactérias sensíveis a acidez.
	Já para a contagem de Estafilococus coagulase positiva utilizou-se o meio ágar BAIRD PARKER.
	Para verificar a positividade do teste de e S.aureus observa-se se há presença de colônias pretas com halos esbranquiçados com transparência ao redor. 
 
2.3.5 Contagem de Mesófilos e Psicrotróficos
	Para a análise de mesófilos utilizou-se a técnica de plaqueamento em profundidade através da adição do ágar PCA (Plate Count Agar) nas placas contendo a amostra diluída, incubando-as a 35°C/ 24-48h. 
	Para a análise dos psicrotróficos utilizou-se a técnica de plaquamento em superfície. Diluições decimais da amostra de tempero completo caseiro 
plaqueadas em ágar PCA (Plate Count Agar) sendo estas incubadas a 10°C/ 7-10 dias para contagem de bactérias psicrotróficas.
2.3.6 Contagem de Bacillus cereus
 	Através do método de plaqueamento de superfície com utilização do meio ágar MYP (Monitol gema de ovo polimixina) fez-se análise do B.cereus. Analisando a presença de colônias rugosas, secas e com a coloração rosada até purpura, rodeada pelo halo branco.
2.3.7 Análise de detecção de Salmonela
 	
	Para detecção de Salmonela utilizou-se o pré-enriquecimento em meio de cultura FDA/BAM (caldo lactosado 35°C/24h) para que fosse feito um enriquecimento seletivo com o caldo tetrationato (TT) e o caldo RV para permitir um maior crescimento de Salmonela, sendo aplicado então um plaqueamento diferencial em ágar XLD (xilose lisina desoxicolato) e ágar HE (entérico hectoen). O uso de dois caldos diferentes é devido à característica que estes apresentam, como a capacidade de inibir algumas cepas de Salmonela que sejam sensíveis a estes caldos e também inibem outros microrganismos.
	
3. Resultados e discussões
Na Tabela 1 estão apresentados os resultados provenientes das análises microbiológicas com relação à contagem de coliformes totais e termotolerantes, E. coli, bolores e leveduras, Stafilococcus coagulase Positiva, Mesófilos e Psicrotróficos totais, Bacillus cereus e ausência ou presença de Salmonela.A RDC n° 12, diante da categoria na qual o produto escolhido se encaixa (Anexo 1.3 – Especiarias, Temperos, Condimentos e molhos preparados e similares) só fornece parâmetros comparativos que possibilitem a análise microbiológica para Coliforme a 45°C/g e Salmonella.
Tabela 1 – Resultados das análises microbiológicas da amostra de Tempero completo
	Amostra
	Coliformes totais e termotolerantes
(NMP/g)
	E. Coli
(UFC/g)
	Bolores e Leveduras
(UFC/g)
	S.Coagulase Positiva
(UFC/g)
	Mesófilo e
Psicrotróficos 
 (UFC/g)
	Bacillus Cereus
(UFC/g)
	Salmonella 
	
	
Tempero
Completo
	 75
>3,0
	Negativo
	Negativo
	2,65 x 105
	3,5x103
3,5x104
	5,85x103
	Ausência
	
 UFC/g – Unidade formadora de colônia por grama de produto
 NMP/g – Número mais provável por grama de produto
3.1 Coliformes totais e termotolerantes
Coliformes são bactérias gram-negativas não esporuladas na forma de bastonetes curtos, anaeróbios facultativo e que fermentam a lactose com formação de ácido e gás a 35°C. São microrganismos típicos da microflora fecal, podendo a maioria deles também ser encontrados em outros locais.
Na análise feita detectou-se a presença de coliformes de acordo com a tabela abaixo:
	Diluição
	NMP/g
	Limite NMP
	1
	0, 1
	0,01
	
75
	Inferior
	Superior
	N° de tubos positivos
	
	
	
	3
	1
	1 
	
	14
	230
A RDC N°12 estabelece a tolerância para amostra indicativa de até 10². Portanto os resultados obtidos para coliformes totais e termotolerantes são considerados aceitáveis. 
3.2 Escherichia coli
É do grupo coliforme considerada como sendo de origem unicamente fecal. Por esse motivo o teste de coliformes torna-se mais seletivo para E.coli. É empregado como indicador de contaminação fecal, ou seja, de condições higiênico-sanitárias inadequadas. Assim, sua presença indica possibilidade de ocorrem outros microrganismos entéricos na amostra. 
Na análise realizada nos tubos com diluições 10-1, 10-2, 10-3, o resultado foi 0-0-0, o que significa uma quantidade de coliformes < 3 NPM/g de amostra, havendo então uma quantidade mínima de grupos coliformes não indicando impróprio o consumo do tempero completo.
3.3 Bolores e leveduras
Bolores são fungos filamentosos, multicelulares, obtém sua alimentação de matéria orgânica inanimada ou nutrem-se como parasitas. Podem estar presente no solo, no ar, na água e em matéria orgânica em decomposição. Alguns desses fungos são prejudiciais, existindo ainda os grupos produtores de micotoxinas como aflatoxinas.
Leveduras são fungos não filamentosos que estão bem difundidos na natureza sendo disseminados por insetos vetores, pelo vento e pelas correntes aéreas.
A presença de fungos filamentosos e leveduras viáveis e em índice elevado nos alimentos pode fornecer informações como condições higiênicas deficientes de equipamentos, multiplicação do produto em decorrência de falhas no processamento e/ou estocagem e matéria prima com contaminação excessiva.
Os resultados obtidos para bolores e leveduras foram negativos em todas as diluições. Através desses resultados pode-se confirmar a ausência dos fungos filamentosos e leveduras, pois estes são capazes de se desenvolver em produtos com atividade aquosa baixa 0,80 e 0,88. Entretanto, algumas leveduras osmofílicas e fungos filamentosos xerofílicos são capazes de multiplicarem-se em produtos com menores atividade de água. Se estes estivessem presentes na amostra haveria desenvolvimento. 
Como essa análise se baseia na RDC n° 12, diante da categoria na qual o produto escolhido se encaixa (Anexo 1.3 – Especiarias, Temperos, Condimentos e molhos preparados e similares) não são fornecido parâmetros comparativos que possibilitem a análise microbiológica.
3.4 Estafilococus coagulase positiva
O gênero Estafilococcus é uma espécie curva, Gram+ não esporogênica, imóveis, catalase positiva e podem desenvolver-se na presença ou ausência de oxigênio, podem ter acesso a qualquer tipo de alimento, pois seu reservatório principal é o homem e os outros animais. A maioria das estirpes de S. aureus produz pigmento dourado e coagulam o plasma sanguíneo do coelho (são coagulase +).
Em geral, as cepas de S. aureus multiplicam-se com mais facilidade na presença de oxigênio. Para se desenvolver com maior rapidez, necessita de micronutrientes como aminoácidos e vitaminas, todas as espécies são mesófilas e podem ser inibidas facilmente pela presença de uma flora competitiva. Apresenta sensibilidade à acidez do substrato, tolera concentrações do cloreto de sódio relativamente altas e baixas atividades de água. É importante lembrar que S.aureus é capaz de sobreviver por períodos de tempo bastante prolongados tanto em alimentos desidratados como em alimentos congelados, voltando a desenvolver-se normalmente após a reidratação ou descongelamento do produto.
A diferenciação do S.aureus coagulase positiva das outras espécies e subespécies é bastante importante no estudo do envolvimento desses microrganismos com as gastroenterites provocadas por alimento, pois se trata da espécie que mais tem se envolvido com surtos comprovados de intoxicações alimentares.
A presença de S. aureus nos alimentos é interpretada, em geral, como indicativo de contaminação a partir da pele, da boca e das fossas nasais de manipuladores de alimentos, bem como da limpeza e sanificação inadequada dos materiais e dos equipamentos.
Dos resultados obtidos a partir da diluição 10-3 foi de 2,65 x105, não foi necessária a utilização das demais diluições, pois a diluição citada acima apresentou números de colônias características. 
A RDC n°12 não nos fornece parâmetros comparativos que nos permitam a analise dos dados.
3.5 Mesófilos e Psicrotróficos
Mesófilos são microrganismos capazes de se desenvolverem em uma temperatura de 30 a 35° C. 
A contagem padrão de bactérias aeróbias mesófilas detecta em um alimento o número de bactérias aeróbias ou facultativas e mesófilas presente tanto na forma vegetativa quanto esporulada. Indica qualidade higiênica dos alimentos fornecendo também ideia de seu tempo útil de conservação, sua presença em grande número indica que as matérias primas estão excessivamente contaminadas, que a limpeza e desinfecção das superfícies estão sendo executadas de forma inadequada, como também a higiene inadequada na produção, condições inadequadas de tempo/temperatura durante a produção ou conservação dos alimentos ou uma combinação destas circunstâncias.
Para análise dos resultados foram considerados para contagem, somente as placas que apresentaram entre 30 e 300 colônias, o resultado obtido a partir do plaqueamento de profundidade da placa com diluição 10-2 foi o seguinte:
3,5 x 103 UFC/g de amostra.
Psicrotróficos são microrganismos capazes de se desenvolver em temperaturas de refrigeração. Ambos são indicadores de deterioração. A degradação causada por essas bactérias é de natureza proteolítica e lipolítica, originando a aparição de diversos aromas estranhos, a formaçãode coágulos e a digestão de proteína. O resultado foi obtido a partir da analise do plaqueamento em superfície, através da placa com diluição 10-3 , obtendo o seguinte resultado :
3,5 x 104 UFC/g de amostra.
3.6 Bacillus cereus
B. cereus incluída na família Bacillaceae, é largamente disseminado no ambiente, sendo o solo seu reservatório natural e principal habitat, a partir do qual contamina alimentos diversos, principalmente vegetais, como cereais e as farinhas e amido resultantes de seu processamento, condimentos, especiarias, etc. (Banwart, 1979)
Bacillus cereus causa processos patológicos apenas quando o alimento contaminado contém número elevado de células, geralmente acima de 107 UFC/g (ICMSF, 1978) ou entre 106 -109 UFC /g (Banwart, 1979).
O controle de B. cereus em alimentos fundamenta-se na prevenção de seu desenvolvimento, uma vez que é difícil, se não impossível, impedir por completo a sua presença nas matérias primas. Nestas condições, é fundamental que, particularmente nos alimentos preparados e prontos para o consumo, a multiplicação intensa da bactéria seja inibida, quer pela refrigeração adequada ou pela manutenção dos alimentos acima de 55°C. 
Nenhum produto que ofereça condições para proliferação deste patógeno deverá ser mantido por períodos superiores a 2-3 h em temperaturas na faixa de 15° a 60º C, que propiciam condições de desenvolvimento. Os alimentos de baixa acidez, submetidos à esterilização comercial, não oferecem riscos quanto à presença desta bactéria, uma vez que a resistência térmica de seus esporos é relativamente baixa.
A sua presença pode indicar contaminação de matérias primas bem como condições inadequadas de conservação, com relação a temperatura.
Para obtenção do resultado foi analisada a placa com diluição 10-1 obtendo-se um valor de 5,85 X 103.
Pode-se observar como característica do crescimento que o meio contendo o B. cereus apresentou colônias rugosas, secas e com uma coloração rosada, rodeadas por um halo branco. O ágar foi totalmente consumido pelo Bacillus dando a coloração rosa, isso ocorre devido a hidrólise que o Bacillus provocou ao meio tornando-o transparente.
3.7 Salmonela
São bacilos Gram- , aeróbios ou anaeróbios facultativos, pertencentes a família Enterobacteriaceae. Encontra-se muito difundidos na natureza, tendo como reservatório principal o trato intestinal de pessoas e de animais. A intoxicação direta ocorre pela ingestão de um elevado numero de bacilos pequenos. A temperatura ótima de crescimento encontra-se na faixa de 35° a 37° C, se bem que podem multiplicar-se desde as temperaturas de refrigeração de alguns alimentos, em torno de 5° C, a temperaturas bastante elevadas com 47° C sendo que seu crescimento em temperaturas inferiores a 10° C se torna consideravelmente lento. Os alimentos também podem ser contaminados por Salmonelas no contato de manipuladores com os alimentos, com as mãos ou com objetos de uso culinário. A água contaminada também serve como veículo de disseminação deste microrganismo. Os alimentos crus de origem animal são maiores fontes de Salmonela spp. O risco de uma salmonelose começa quando estes alimentos são introduzidos na cozinha, se as técnicas de manipulação e higiene não são adequadas, o manipulador ao entrar em contato com os alimentos crus contaminados poderá servir como agente disseminador desses microrganismos aos equipamentos, utensílios e os alimentos prontos para o consumo, provocando contaminação cruzada. Presume-se que todas as espécies de cepas de Salmonelas são patogênicas para o homem.
De acordo com o procedimento realizado pode-se observar a ausência da Salmonela. Estando assim em conformidade com a Legislação vigente do país. No que tange a ausência de Salmonela spp/ 25 g apresentando então concordância em relação ao Anexo 1.3 da RDC n° 12 (Brasil, 2001). 
4. Conclusão
Considerando a escassez de literatura para Temperos Prontos, este trabalho possibilitou a conclusão de que existe a necessidade de se empreender esforços para se estabelecer padrões de qualidades para manipulação de alimentos. Os condimentos apresentam baixa taxa de contaminações por microrganismos apesar de não apresentar componentes químicos na sua composição, isso se dá pela ação dos óleos essenciais presentes no tempero como alho, cebola, coentro, manjericão e também pela alta taxa de sal. Essas ações antimicrobianas presente no alimento analisado são importantes, pois temperos prontos são adicionados a outras preparações que se estiverem contaminadas acabam por contaminar outros alimentos, elevando a carga microbiana deste. Os problemas relacionados a este alimento pronto é que como a sua preparação é caseira e não segue padrões de qualidade aplicados numa indústria e o comercio informal em que este se encontra, segue uma larga escala de consumidores que utilizam o produto, mas são leigos quanto ao conhecimento de tal risco.
5. Referências bibliográficas
-ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS– ABNT. Coletânea de Normas e Planos de Amostragem, v. 2, p. 1-50, 1985.
- APHA, American Public Health Association. Compendium of Methods for microbiological Examination of Foods. 4.ed. Washington: APHA, 2001. 
- BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução – RDC Nº 12, de 02 de janeiro de 2001. Regulamento técnico sobre padrões microbiológicos para alimentos.
- 4 CONNER, D. E.; BEUCHAT, L. R. Effects of essential oils from plants on growth of food spoilage yeasts. Journal Food Science, Chicago, v. 49, p. 429-434, 1984a.  
- 3 FRANCO, B. D. G. M., BERGAMO, N. T. Análise microbiológica de misturas prontas destinadas ao tempero de alimentos (“Temperos Prontos”). Rev. Microbiol., v.20, p.272-7, 1989.
- 1 GERMANO, P. M. L.; GERMANO, M. I. S.; Higiene e vigilância sanitária de alimentos. São Paulo: Varela, 2001.
- 2 INTERNATIONAL COMMISSION ON MICROBIOLOGICAL SPECIFICATIONS FOR FOODS. Microbial ecology of foods. New York. Academic Press, 1980. v.2
- PELZAR,J.M. E.C.S.Chan;NOEL,R. Microbiologia Conceitos e Aplicações. Volume 1, 2º edição. São Paulo:Makron Books.1997.
- SIQUEIRA, Regina Silva de. Manual de Microbiologia de Alimentos; Embrapa. Centro Nacional de Pesquisa de Tecnologia Agroindustrial de Alimentos. Rio de Janeiro-RJ.Brasília: Embrapa-SP;Rio de Janeiro:Embrapa-CTAA.
- SILVA, João Andrade. Tópicos de Tecnologia e Alimentos. São Paulo. Livraria Varela, 2000.
- TRABULSI,L.R.Microbiologia.Rio de Janeiro. São Paulo: Livraria Atheneu.1986.
- ROITMAN, Isac. TRAVASSOS,L.R. AZEVEDO,J.L. Tratado de Microbiologia de Alimentos. São Paulo: Monole,1987.