Macanismos Moleculares da Replicacao

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Humanas / Sociais

Gabriel Fortunato Mancio de Camargo
31/03/2020
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BIOLOGIA MOLECULAR
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO
Prof. Dr. Lourival Antunes de Oliveira Filho
lourival.filho@prof.uniso.br
NA ÚLIMA AULA...
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene.
Sabemos que dentro do núcleo encontra-se o material genético responsável pela reprodução 
celular e garantia da vida. 
Mais que isso, para que tenhamos a continuidade da vida torna-se necessário que façamos 
cópias de nós mesmos.
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene.
As cópias do material hereditário são feitas através da duplicação do DNA, ou seja, de um
processo molecular conhecido como replicação. 
Assim, a replicação é exatamente o processo de duplicação de uma molécula de DNA de 
dupla hélice.
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – Química da síntese de DNA
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene.
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene.
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene.
REPLICAÇÃO SEMICONSERVATIVA
As DNA polimerases não são capazes de sintetizar uma nova fita de DNA sem que antes seja 
sinalizado isso para elas.
3’
5’
5’
3’
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene. Alberts, Bruce. Biologia Molecular da Célula.
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO 
As DNA polimerases não são capazes de sintetizar uma nova fita de DNA sem que antes seja 
sinalizado isso para elas.
3’
5’
5’
3’
DNA polimerase
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene. Alberts, Bruce. Biologia Molecular da Célula.
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO 
As DNA polimerases não são capazes de sintetizar uma nova fita de DNA sem que antes seja 
sinalizado isso para elas.
3’
5’
5’
3’
Primase
Primer
DNA polimerase
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MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO 
3’
5’
5’
3’
Primase
Primer
DNA polimerase
As DNA polimerases não são capazes de sintetizar uma nova fita de DNA sem que antes seja 
sinalizado isso para elas.
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene. Alberts, Bruce. Biologia Molecular da Célula.
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO 
5’
3’
3’
5’
Primase
Primer
DNA polimerase
As DNA polimerases não são capazes de sintetizar uma nova fita de DNA sem que antes seja 
sinalizado isso para elas.
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MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO 
5’
3’
3’
5’
As DNA polimerases não são capazes de sintetizar uma nova fita de DNA sem que antes seja 
sinalizado isso para elas.
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MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO 
5’
3’
3’
5’
5’ 3’
3’ 5’
As DNA polimerases não são capazes de sintetizar uma nova fita de DNA sem que antes seja 
sinalizado isso para elas.
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MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO 
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A DNA-polimerase na fita-líder pode sintetizar o DNA assim que seu molde for exposto, porém, 
a síntese da fita tardia precisa esperar que o deslocamento da forquilha de replicação exponha 
uma extensão considerável do molde antes que este possa ser replicado. 
5’
3’
3’
5’
Primer
DNA polimerase
DNA polimerase
As DNA polimerases não são capazes de sintetizar uma nova fita de DNA sem que antes seja 
sinalizado isso para elas.
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MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO 
3’
5’
DNA polimerase
DNA polimerase
Primase
DNA polimerase
Fragmentos de Okazaki
As DNA polimerases não são capazes de sintetizar uma nova fita de DNA sem que antes seja 
sinalizado isso para elas.
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MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO 
Para completar a replicação do DNA, os iniciadores de RNA, utilizados para a iniciação, 
devem ser removidos e substituídos por DNA. 
Para substituir os iniciadores de RNA por DNA, uma enzima denominada RNase H reconhece 
e remove a maior parte de cada iniciador de RNA. 
Essa enzima degrada especificamente o RNA que está realizando pareamento de bases com 
DNA (por isso, o “H” do nome, que corresponde a “híbrido” em uma molécula híbrida de 
RNA:DNA). 
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MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO 
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MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO 
3’
5’
DNA polimerase
DNA polimerase DNA polimerase
Exonuclease
DNA polimerase
Para completar a replicação do DNA, os iniciadores de RNA, utilizados para a iniciação, 
devem ser removidos e substituídos por DNA. 
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene. Alberts, Bruce. Biologia Molecular da Célula.
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO 
Fonte: PIMENTEL, Márcia Gonçalves, GALLO, Cláudia Vitória Moura, SANTOS-REBOUÇAS, Cíntia Barros. Genética Essencial. Guanabara Koogan, 03/2013. & Google imagens.
A síntese de DNA necessita de dois substratos fundamentais. 
Primeiro, uma nova síntese necessita dos quatro desoxinucleosídeos trifosfatados:
• dGTP, dCTP, dATP e dTTP. 
O segundo substrato essencial para a síntese de DNA é um arranjo particular de DNA de fita 
simples (ssDNA) e DNA dupla-fita (dsDNA) chamado junção iniciador:molde. 
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – Química da síntese de DNA
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene.
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – Química da síntese de DNA
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene.
O DNA é sintetizado pela extensão da extremidade 3’ do iniciador.
As bases químicas da síntese de DNA permitem que a extensão da nova cadeia ocorra apenas 
pela extremidade 3’ do iniciador.
A ligação fosfodiéster é formada em uma reação SN2, na qual o grupo hidroxila da extremidade
3’ da fita do iniciador ataca o grupo α-fosforil do nucleosídeo trifosfatado que sera ́ 
adicionado. 
O outro produto da reação é o pirofosfato, que se origina a partir da liberação dos β e γ-
fosfatos do substrato nucleotídico.
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – Química da síntese de DNA
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene.
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A hidrólise de pirofosfato é a força promotora 
da síntese de DNA
A síntese de DNA é catalisada por uma classe de enzimas chamada DNA-polimerase.
Ao contrário da maioria das enzimas, que possuem um sítio ativo dedicado a uma única reação, 
a DNA-polimerase utiliza um único sítio ativo para catalisar a adição de qualquer um dos 
quatro desoxinucleosídeos trifosfatados. 
Em vez de detectar o nucleotídeo exato que entra no sítio ativo, a DNA-polimerase monitora 
a capacidade de o nucleotídeo a ser incorporado formar um par de bases A:T ou G:C.
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – MECANISMO DA DNA-POLIMERASE
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene.
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Em vez de detectar o nucleotídeo exato que entra no sítio ativo, a DNA-polimerase monitora 
a capacidade de o nucleotídeo a ser incorporado formar um par de bases A:T ou G:C.
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – MECANISMO DA DNA-POLIMERASE
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene.
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As DNA-polimerases apresentam uma capacidade impressionante para distinguir entre 
ribonucleosídeos e desorribonucleosídeos trifosfatados (rNTPs e dNTPs).
Essa discriminação é mediada pela exclusão estérica de rNTPs do sítio ativo da DNA-
polimerase.
Na DNA-polimerase, o sítio de ligação ao nucleotídeo não consegue acomodar uma 2’-OH no 
nucleotídeo que chega. Esse espaço é ocupado por dois aminoácidos que fazem contato com o 
anel do açúcar por meio de ligações de van der Waals. 
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – MECANISMO DA DNA-POLIMERASE
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene.
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A troca desses aminoácidos por outros com cadeias 
laterais menores (p. ex., trocando-se um resíduo de 
glutamato por uma alanina) resulta em uma DNA-
polimerase com capacidade reduzida de 
discriminação entre dNTPs e rNTPs.
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Os nucleotídeos que apresentam alguns, mas não todos, os requerimentos 
para serem usados pela DNA-polimerase podem inibir a síntese de DNA 
pela terminação do alongamento. Esses nucleotídeos representam uma 
classe importante de fármacos usados para tratar câncer e infecções
virais.
As DNA-polimerases assemelham-se a uma mão que segura a junção iniciador:molde
A compreensão do mecanismo molecular de como as DNA-polimerases catalisam a síntese de 
DNA surgiu de estudos da estrutura atômica de várias DNA-polimerases ligadas às junções
iniciador:molde.
Essas estruturas revelaram que o substrato de DNA se encaixa em uma grande fenda que se 
assemelha a uma mão direita parcialmente fechada.
Com base na analogia com a mão, os três domínios da polimerase são chamados de polegar, 
dedos e palma.
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – MECANISMO DA DNA-POLIMERASE
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene.
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O domínio da palma é composto por uma folha β e contém os elementos principais do sítio
catalítico. 
Particularmente, essa região da DNA-polimerase liga-se a dois íons metálicos divalentes (em 
geral, Mg2+ ou Zn2+) que alteram o ambiente químico em torno do dNTP corretamente 
pareado e a 3’-OH do iniciador.
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – MECANISMO DA DNA-POLIMERASE
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene.
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Além de seu papel na catálise, o domínio de palma também verifica a precisão do pareamento 
entre nucleotídeos recém-adicionados. 
Essa região da polimerase efetua inúmeros contatos por ligações de hidrogênio com pares de 
bases na fenda menor do DNA recém-sintetizado. 
Esses contatos não são base-específicos, mas são formados apenas se os nucleotídeos
recentemente adicionados (quaisquer que eles sejam) estiverem corretamente pareados.
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – MECANISMO DA DNA-POLIMERASE
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene.
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Quais são as funções dos dedos e do polegar? 
Os dedos também são importantes para a catálise. 
Vários resíduos localizados nos dedos ligam-se ao dNTP que sera ́ incorporado. 
Uma vez que o par de bases correto entre o dNTP e o molde é formado, o domínio dos dedos 
desloca-se, envolvendo o dNTP.
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – MECANISMO DA DNA-POLIMERASE
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene.
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O domínio dos dedos também se associa à região do molde, levando a uma volta de quase 90°
do esqueleto de fosfodiéster entre a primeira e a segunda bases do molde. 
Essa conformação do molde serve para expor apenas a primeira base do molde, após o 
iniciador, no sítio catalítico e evita qualquer dúvida a respeito da base que efetuará o 
pareamento com o próximo nucleotídeo a ser adicionado
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – MECANISMO DA DNA-POLIMERASE
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene.
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Ao contrário dos dedos e da palma, o domínio do polegar não está intimamente envolvido na 
catálise. Em vez disso, o polegar interage com o DNA recém-sintetizado.
Isso tem dois objetivos:
• Primeiro, manter a posição correta do iniciador e do sítio ativo. 
• Segundo, o polegar auxilia na manutenção da forte associação entre a DNA-polimerase e 
seu substrato.
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – MECANISMO DA DNA-POLIMERASE
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EM REUSMO: uma série ordenada de eventos ocorre cada vez que a DNA- -polimerase 
adiciona um nucleotídeo na cadeia de DNA em crescimento.
• O nucleotídeo a ser incorporado pareia com a próxima base disponível do molde.
• Essa interação faz os dedos da polimerase se fecharem em torno do dNTP pareado. 
• Essa conformação da enzima posiciona os íons metálicos catalíticos essenciais à catálise, 
ocorrendo a formação da próxima ligação fosfodiéster.
• A ligação do nucleotídeo pareado ao iniciador leva à reabertura dos dedos e à
movimentação da junção iniciador:molde em um par de bases.
• A polimerase está, então, pronta para o próximo ciclo de adição. 
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – MECANISMO DA DNA-POLIMERASE
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene.
As DNA-polimerases são enzimas processivas
A catálise pela DNA-polimerase é rápida. As DNA-polimerases são capazes de adicionar cerca 
de 1.000 nucleotídeos/s a uma fita de iniciador. Essa alta velocidade de síntese de DNA deve-se 
em grande parte à natureza processiva da DNA-polimerase.
A processividade é uma característica das enzimas que atuam sobre substratos poliméricos.
Nos caso das DNA-polimerases, o grau de processividade é definido como o número médio de 
nucleotídeos adicionados cada vez que a enzima se liga à junção iniciador:molde. 
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – MECANISMO DA DNA-POLIMERASE
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene.
O aumento da processividade é
facilitado pela capacidade de as 
DNA-polimerases deslizarem ao 
longo do molde de DNA.
Cada vez que um nucleotídeo é adicionado à fita do iniciador, o DNA libera-se parcialmente da 
polimerase. (As ligações de hidrogênio com a fenda menor são rompidas, mas as interações
eletrostáticas com o polegar são mantidas.) 
O DNA, então, é rapidamente religado à polimerase, mas agora em uma posição alterada em 1 
pb, utilizando o mesmo mecanismo não específico por sequência. 
Aumentos adicionais na processividade são alcançados por meio de interações entre a DNA-
polimerase e proteínas acessórias
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – MECANISMO DA DNA-POLIMERASE
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Exonucleases realizam uma revisão de leitura no DNA recém-sintetizado
Um sistema baseado apenas na geometria do pareamento de bases e na complementaridade 
entre as bases é incapaz de alcançar o extraordinário nível de precisão observado na síntese de 
DNA de uma célula (aproximadamente um erro a cada 10^10 pb adicionados). 
A principal limitação na precisão da DNA-polimerase é a oscilação ocasional (aproximadamente 
1:10^5 vezes) das bases para a forma tautomérica “incorreta” (imino ou enol).
Essas formas alternadas das bases permitem que pares de bases incorretos sejam posicionados 
corretamente para a catálise.
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – MECANISMO DA DNA-POLIMERASE
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene.
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – MECANISMO DA DNA-POLIMERASE
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Quando o nucleotídeo
retorna a seu estado 
“correto”, o nucleotídeo
incorporado é mal-pareado
com o molde e deve ser 
eliminado.
A remoção dos nucleotídeos malpareados é mediada por um tipo de nuclease que foi 
originalmente identificada no mesmo polipeptídeo que a DNA-polimerase. 
Chamadas de exonucleases de revisão de leitura, essas enzimas degradam o DNA a partir de 
uma extremidade 3’ de DNA.
(As nucleases capazes de degradar o DNA apenas a partir de uma extremidade são chamadas 
exonucleases; as nucleases capazes de clivar no meio de uma fita de DNA são chamadas 
endonucleases.) 
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – MECANISMO DA DNA-POLIMERASE
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene.
A remoção dos nucleotídeos malpareados é mediada por um tipo de nuclease que foi 
originalmente identificada no mesmo polipeptídeo que a DNA-polimerase. 
Chamadas de exonucleases de revisão de leitura, essas enzimas degradam o DNA a partir de 
uma extremidade 3’ de DNA.
(As nucleases capazes de degradar o DNA apenas a partir de uma extremidade são chamadas 
exonucleases; as nucleases capazes de clivar no meio de uma fita de DNA são chamadas 
endonucleases.) 
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – MECANISMO DA DNA-POLIMERASE
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Inicialmente, a presença de uma exonuclease 3’ no 
mesmo polipeptídeo que uma DNA-polimerase fez 
pouco sentido. Por que haveria necessidade de a 
DNA-polimerase degradar o DNA que ela havia 
recém-sintetizado? 
Resposta = preferência em degradar o DNA com 
pareamento de bases incorreto
LEMBRE-SE: A remoção de nucleotídeos malpareados é facilitada pela capacidade reduzida de 
a DNA-polimerase adicionar um nucleotídeo adjacente a um iniciador contendo um par de 
bases incorreto. 
O DNA malpareado altera a geometria entre a 3’-OH e o nucleotídeo a ser incorporado, 
devido a interações fracas com a região da palma. 
Assim, quando um nucleotídeo malpareado é adicionado, ele diminui a velocidade de adição
de novos nucleotídeos e aumenta a velocidade da atividade da exonuclease de revisão de 
leitura.
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – MECANISMO DA DNA-POLIMERASE
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene.
Como o DNA sabe que deve se soltar da região da palma e se ligar no sítio da exonuclease?
Quando um par de bases malpareado está presente no sítio ativo da polimerase, a junção
iniciador:molde é desestabilizada, criando vários pares de bases de DNA não pareado. 
O sítio ativo da DNA-polimerase liga-se muito mal a esse molde malpareado, mas o sítio ativo 
da exonuclease possui uma afinidade 10 vezes maior por extremidades 3’ de fita simples. 
Portanto, a extremidade 3’ recém-despareada move-se do sítio ativo da polimerase para o sítio
ativo da exonuclease.
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – MECANISMO DA DNA-POLIMERASE
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene.
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene.
Essencialmente, as exonucleases de revisão de leitura funcionam como a “tecla de deletar” de 
um teclado, removendo apenas os erros mais recentes. 
A presença da exonuclease de revisão de leitura aumenta muito a precisão da síntese de DNA. 
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – MECANISMO DA DNA-POLIMERASE
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene.
Em média, a DNA-polimerase insere um nucleotídeo incorreto a cada 10^5 nucleotídeos
adicionados.
Com a exonuclease o pareamento incorreto diminui para um a cada 10^7 nucleotídeos.
O nível adicional de precisão é fornecido pelo sistema de reparo de maus pareamentos pós-
replicação.
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – MECANISMO DA DNA-POLIMERASE
Fonte: WATSON,
James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene.
Ambas as fitas do DNA são sintetizadas juntas na forquilha de replicação
Até agora nós estávamos vendo a síntese como se ela gerasse apenas uma fita nova de DNA.
Entretanto, na célula, ambas as fitas do dúplex de DNA são replicadas ao mesmo tempo.
Isso requer a separação das duas fitas da dupla-hélice, formando dois moldes de DNA.
A junção entre as duas fitas-molde recém-separadas e o dúplex de DNA não replicado é
conhecida como forquilha de replicação
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – Forquilha de replicação
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene.
A forquilha de replicação desloca-se continuamente em direção à região do dúplex de DNA 
não replicado, deixando em seu trajeto dois moldes de ssDNA que coordenam, cada um, a 
síntese de uma fita de DNA complementar.
A natureza antiparalela do DNA é uma dificuldade à replicação simultânea dos dois moldes 
expostos pela forquilha de replicação. 
Como o DNA é sintetizado apenas pelo alongamento da extremidade 3’, apenas um dos dois 
moldes expostos pode ser replicado de forma contínua à medida que a forquilha de replicação
se movimenta. 
Sobre essa fita-molde, a polimerase simplesmente “segue” a forquilha de replicação. 
A fita de DNA recém-sintetizada, coordenada por esse molde, é conhecida como fita-líder.
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – Forquilha de replicação
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene.
A síntese da nova fita de DNA coordenada pelo outro molde de ssDNA é mais problemática. 
Esse molde faz a DNA-polimerase se deslocar em direção oposta à forquilha de replicação. 
A fita de DNA sintetizada a partir desse molde é chamada fita tardia, ou fita retardada.
Os pequenos fragmentos de DNA recém-sintetizados, formados na fita tardia, são chamados 
fragmentos de Okazaki e variam de 1.000 a 2.000 nucleotídeos de comprimento nas bactérias, 
e de 100 a 400 nucleotídeos nos eucariotos. 
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A iniciação de uma nova fita de DNA requer um iniciador de RNA.
Como descrito anteriormente, TODAS as DNA-polimerases necessitam de um iniciador com 
uma extremidade 3’-OH livre. 
ESSE INICIADOR NÃO É FORMADO DE DNA!
ELE É UMA PEQUENA FITA SIMPLES DE RNA!
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Por que RNA e não DNA?
ENTÃO, COMO INICIA A SÍNTESE DE NOVAS FITAS DE DNA?
Para realizar isso, a célula aproveita-se da habilidade das RNA-polimerases em fazer o que as 
DNA-polimerases não conseguem: iniciar novas cadeias de RNA de novo.
A primase é uma RNA-polimerase especializada em sintetizar pequenos iniciadores de RNA 
(com 5 a 10 nucleotídeos) sobre um molde de ssDNA.
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Embora ambas as fitas, líder e tardia, necessitem da primase para iniciar a síntese de DNA, a 
frequência de funcionamento da primase sobre as duas fitas é bastante diferente.
Cada fita-líder necessita apenas de um único iniciador de RNA. 
Em contrapartida, a síntese descontínua da fita tardia requer a síntese de um novo iniciador 
para cada fragmento de Okazaki.
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Ao contrário das RNA-polimerases envolvidas na síntese de RNA mensageiro (mRNA), RNA 
ribossômico (rRNA) e RNA transportador (tRNA), a primase não necessita de uma sequência
de DNA estendida para iniciar a síntese de RNA. 
Em vez disso, as primases preferem iniciar a síntese de RNA usando um molde de ssDNA
contendo um trímero específico (GTA, no caso da primase de Escherichia coli). 
Corroborando essa preferência, a análise da sequência do genoma de E. coli mostra que a 
sequência-alvo GTA para a primase de E. coli está super-representada nas porções do genoma 
que servirão de molde para a síntese da fita tardia de DNA.
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Os iniciadores de RNA devem ser removidos para finalizar a replicação do DNA.
Para completar a replicação do DNA, os iniciadores de RNA, utilizados para a iniciação, devem 
ser removidos e substituídos por DNA. 
A remoção dos iniciadores de RNA pode ser considerada um evento de reparo do DNA.
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Para substituir os iniciadores de RNA por DNA, uma enzima denominada RNase H reconhece e 
remove a maior parte de cada iniciador de RNA. 
Essa enzima degrada especificamente o RNA que está realizando pareamento de bases com 
DNA (por isso, o “H” do nome, que corresponde a “híbrido” em uma molécula híbrida de 
RNA:DNA).
A RNase H remove todo o iniciador de RNA, exceto o ribonucleotídeo diretamente ligado à
extremidade do DNA. 
Isso ocorre porque a RNase H só consegue clivar ligações entre dois ribonucleotídeos. O 
ribonucleotídeo final é removido por uma exonuclease 5’ que degrada RNA ou DNA a partir de 
suas extremidades 5’.
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A remoção do iniciador de RNA deixa uma 
lacuna no DNA dupla-fita que funciona como 
um substrato ideal para a DNA-polimerase –
uma junção iniciador:molde
A DNA-polimerase preenche essa lacuna 
por meio do pareamento de cada 
nucleotídeo, deixando uma molécula de 
DNA completa, exceto por uma quebra no 
esqueleto fosfodiéster entre a extremidade 
3’-OH e o 5’-fosfato da fita reparada. Essa 
“quebra” no DNA é reparada por uma 
enzima chamada DNA-ligase. 
As DNA-helicases desenrolam a dupla-hélice à frente da forquilha de replicação.
As DNA-polimerases em geral não são eficientes em promover a separação das duas fitas do 
dúplex de DNA. 
Portanto, na forquilha de replicação, uma terceira classe de enzimas, denominadas DNA-
helicases, catalisa a separação das duas fitas do dúplex de DNA.
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Essas enzimas ligam-se ao ssDNA e deslocam-se unidirecionalmente sobre este, utilizando a 
energia da hidrólise de nucleosídeos trifosfatados (normalmente ATP) para deslocar qualquer 
fita de DNA que esteja anelada ao ssDNA.
Em geral, as DNA-helicases que atuam na forquilha de replicação são proteínas hexaméricas
que assumem o formato de anel.
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Proteínas de ligação ao DNA de fita simples estabilizam o ssDNA antes da replicação.
Após a passagem das DNA-helicases,
a ssDNA recém-gerada deve permanecer livre de 
pareamentos para ser utilizada como molde na síntese de DNA. 
Para estabilizar as fitas separadas, as proteínas de ligação ao ssDNA (SSBs, ssDNA-binding
proteins) ligam-se rapidamente a essas fitas.
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A ligação cooperativa assegura que o ssDNA seja rapidamente coberto por SSB à medida que 
ele é liberado da DNA-helicase. 
Uma vez coberto com SSB, o ssDNA é mantido alongado, o que facilita sua utilização como 
molde para a síntese do DNA ou para a síntese do iniciador de RNA.
As topoisomerases removem as supertorções produzidas pelo desenrolamento do DNA na 
forquilha de replicação.
À medida que as fitas do DNA são separadas na forquilha de replicação, o dsDNA em frente à
forquilha torna-se progressivamente supertorcido .
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Na verdade, para que o DNA à frente da forquilha de replicação permaneça relaxado, uma 
laçada do DNA deve ser removida a cada cerca de 10 pb de DNA desenrolado. 
Se não existisse um mecanismo para aliviar o excesso de superenrolamentos, a maquinaria de 
replicação giraria como uma manivela até parar, em função do aumento de pressão no DNA 
existente antes da forquilha.
As supertorções introduzidas pela ação da DNA-helicase são removidas por topoisomerases
que atuam sobre o dsDNA não replicado em frente à forquilha de replicação
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – Forquilha de replicação
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Dessa maneira, as 
topoisomerases atuam como 
“relaxadoras” que 
rapidamente dissipam o 
excesso das supertorções
provocadas pelo 
desenrolamento do DNA.
Enzimas da forquilha de replicação expandem a amplitude de substratos da DNA-polimerase.
A DNA-polimerase, por si só, pode estender de forma eficiente apenas iniciadores com uma 
extremidade 3’-OH anelados a moldes de ssDNA. 
A adição da primase, da DNA-helicase e da topoisomerase amplia, consideravelmente, os 
possíveis substratos para a DNA-polimerase. 
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – Forquilha de replicação
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As DNA-polimerases são especializadas em diferentes funções na célula.
A importante função das DNA-polimerases na replicação eficiente e precisa do genoma exige 
que as células apresentem diversas DNA-polimerases especializadas.
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – Especializações das DNA-Polimerases
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Por exemplo, E. coli tem pelo menos cinco DNA-polimerases, que são distinguidas por suas 
propriedades enzimáticas, composição de subunidades e abundância.
A DNA-polimerase III (DNA Pol III) é a principal enzima envolvida na replicação do 
cromossomo. 
Como todo o genoma de E. coli, com 4,6 Mb, é replicado por duas forquilhas de replicação, a 
DNA Pol III deve ser altamente processiva. 
Para suprir essa necessidade, a DNA Pol III é, em geral, encontrada como parte de um 
complexo maior, que confere uma processividade muito alta – um complexo conhecido como 
holoenzima DNA Pol III.
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As células eucarióticas também possuem múltiplas DNA-polimerases; uma célula normal 
apresenta mais de 15.
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Os grampos deslizantes aumentam significativamente a processividade da DNA-polimerase.
A alta processividade na forquilha de replicação assegura a rápida duplicação dos 
cromossomos. Como foi discutido, as DNA-polimerases da forquilha de replicação sintetizam 
milhares a milhões de pares de bases sem se liberarem do molde. 
Na ausência de outras proteínas, porém, as DNA-polimerases que atuam na forquilha de 
replicação são capazes de sintetizar apenas 20 a 100 pb, antes de serem liberadas do molde. 
COMO A PROCESSIVIDADE DESSAS ENZIMAS AUMENTA DE MANEIRA TÃO DRÁSTICA NA 
FORQUILHA DE REPLICAÇÃO?
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – Especializações das DNA-Polimerases
Fonte: WATSON, James D., BAKER, Tania A., BELL, Stephen P., GANN, Alexander, LEVINE, Michael, LOSICK, Richa. Biologia Molecular do Gene.
Um evento essencial para a alta processividade das DNA-polimerases que atuam na forquilha 
de replicação é sua associação a proteínas chamadas grampos deslizantes de DNA. 
Essas proteínas são compostas por múltiplas subunidades idênticas que se unem em formato 
de “rosquinha”. 
O orifício no centro do grampo é grande o bastante para circundar a dupla-hélice do DNA e 
deixar espaço para uma ou duas camadas de moléculas de água entre o DNA e a proteína.
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – Especializações das DNA-Polimerases
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Como a associação com o grampo deslizante altera a processividade da DNA-polimerase?
• Na ausência do grampo deslizante, uma DNA-polimerase dissocia-se e afasta-se do molde de 
DNA em média uma vez a cada 20 a 100 pb sintetizados. 
• Na presença do grampo deslizante, a DNA-polimerase ainda desprende seu sítio ativo da 
extremidade 3’-OH do DNA frequentemente, mas a associação com o grampo impede que 
ela se difunda para longe do DNA 
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – Especializações das DNA-Polimerases
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Uma vez liberados de uma DNA-polimerase, os grampos deslizantes não são imediatamente 
removidos do DNA replicado. 
Em vez disso, outras proteínas que atuam no sítio de síntese recente de DNA interagem com as 
proteínas do grampo. 
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Os grampos deslizantes são abertos e posicionados no DNA por carregadores do grampo
O grampo deslizante é um anel fechado em solução, mas deve se abrir para envolver a dupla-
hélice de DNA. 
Uma classe especial de complexos proteicos, denominada carregadores do grampo deslizante, 
catalisa a abertura e a colocação dos grampos deslizantes no DNA. 
Essas enzimas acoplam a ligação e a hidrólise do ATP ao posicionamento do grampo deslizante 
em torno das junções iniciador:molde no DNA 
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Na forquilha de replicação, as fitas líder e tardia são sintetizadas simultaneamente. 
A síntese simultânea tem a vantagem de limitar a quantidade de ssDNA presente na célula
durante a replicação do DNA.
A exposição do ssDNA pode levar a quebras e consequente mutações no DNA.
É fundamental limitar o período em que o DNA está
no estado de fita simples. 
Para coordenar a replicação de ambas as fitas do DNA, diversas DNA-polimerases atuam na 
forquilha de replicação.
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – Síntese de DNA na forquilha de replicação
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Em E. coli, a ação coordenada dessas polimerases é facilitada pela ligação física entre elas em 
um grande complexo multiproteico chamado “holoenzima DNA Pol III”
Holoenzima é um nome genérico para um complexo multiproteico no qual a atividade de uma 
enzima central está associada a componentes adicionais que aumentam a função. 
A holoenzima DNA Pol III inclui três cópias do “núcleo” da enzima DNA Pol III e uma cópia do 
fixador do grampo deslizante de cinco subunidades. 
Embora presente em apenas uma cópia na holoenzima, o carregador do grampo deslizante 
inclui três cópias de proteína τ, e cada uma delas liga-se a uma enzima central DNA Pol III 
MECANISMOS MOLECULARES DA REPLICAÇÃO – Síntese de DNA na forquilha de replicação
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Como as múltiplas DNA-polimerases permanecem ligadas na forquilha de replicação
enquanto sintetizam DNA nos moldes das fitas líder e tardia? 
Um modelo para explicar isso propõe que a maquinaria de replicação explora a flexibilidade do 
DNA e da proteína τ.
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UFAA, por hoje acabou!
BIOLOGIA MOLECULAR
MUITO OBRIGADO!
Perguntas?
Prof. Dr. Lourival Antunes de Oliveira Filho
lourival.filho@prof.uniso.br