AULA 3- EXTRAÇÃO DE DNA - CÉLULAS VEGETAIS E ANIMAIS

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EXTRAÇÃO DE ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO 
CÉLULAS VEGETAIS E ANIMAIS
Células Vegetais
 
 
BANANA 
Nome científico: Musa spp. Família: Musaceae 
Nomes populares: Banana
 Origem: provavelmente Ásia 
 MORANGO
Nome científico:  Fragaria vesca
Família: Rosaceae
 Nome Popular: Morango, morangueiro, morango- silvestre, morangueiro-bravo, fragária, frutilha
Origem: Europa e Américas
Material Experimental
Banana / Morango
Saco plástico
Detergente
Sal
Vidraria transparente (cálice, Becker, Enlermeyer ou equivalente)
Bastão de vidro
Álcool gelado
Água morna
Coador ou filtro
Faca / colher
Procedimento experimental
Colocar o material em um saco plástico e macerá-lo com as mãos.
Após verificar que o material está bem macerado, acrescentar à mistura: 02 colheres de detergente, 01 pitada de sal e 25ml de água morna
Misturar o material no próprio saco plástico, por 5 minutos.
Filtrar/coar o material em um frasco.
Acrescentar ao filtrado, álcool etílico gelado, delicadamente sobre as bordas do frasco.
Observar o DNA se precipitando sobre a superfície do material biológico. 
CÉLULAS ANIMAIS
EQUIPAMENTOS E Materiais UTILIZADOS:
- Raspado de mucosa bucal.
- Swab.
- Recipiente contendo sacarose a 3%.
- Tubos de ensaio.
- Suporte para tubos de ensaio.
- Recipiente para banho de gelo.
- Papel alumínio.
- Reagentes:
 # Etanol a 95%, detergente incolor, água destilada, cloreto de sódio.
Procedimento técnico
Higienizar a boca, fazendo bochechos com água.
Raspar mucosa com auxílio de um swab (nos dois lados bucais).
Em um recipiente, colocar uma porção de solução de sacarose a 3% e, logo em seguida, bochechar esta solução por 2 minutos.
Recolher o volume obtido do bochecho e colocar no recipiente anterior, mergulhando o swab usado na raspagem.
Transferir 5,0ml do volume anterior para um tubo de ensaio e adicionar 01 pitada de cloreto de sódio, homogeinizando o material com auxílio de papel alumínio.
Adicional 500µl de detergente neutro a 25% e homogeinizar vagarosamente.
Incubar em banho-maria a 55ºC por 10 minutos.
Resfriar em banho de gelo, por 10 minutos aproximadamente.
Colocar no tubo de ensaio, delicadamente, 5,0ml de álcool etílico gelado a 95% e observar.
OBSERVAÇÕES
A proteinase K é indispensável no material sanguíneo devido digerir proteínas e eliminar a contaminação das preparações de ácido nucleico, além de inativar as nucleases que poderiam degradar o DNA ou o RNA durante a purificação.
Extração de DNA:
Na área de preparo de amostras.
Separe a amostra em fragmentos que possam ser testados de forma independente
Utiliza os métodos mais simples de extração, para evitar manipulação e possível contaminação
Se tem quantidade suficiente de DNA ao final, faça sempre a eletroforese de uma pequena alíquota em gel de agarose para verificar a qualidade do DNA.
Elimine o efeito de eventuais contaminantes que poderiam interferir com a eficiência da reação diluindo a amostra, e consequentemente, os contaminantes. Isso é possível, visto que 100 moléculas alvo já são suficientes para amplificação. 
Extração de DNA
Leucócitos, células de raspados epiteliais, lavado brônquico, pedaço de tecido, etc
Solução de lise tamponada, contendo EDTA e um detergente, como Triton, por ex.
Centrifugação 
1.400 g
4oC
Remova o sobrenadante
Conserve o “pellet”
Digestão com Proteinase K
Ressuspenda
 gentilmente o pellet
 em solução de 
digestão com
proteinase K
Incube a 37oC por no mínimo 2h 
ou 55oC por 1h
O DNA, nessa fase, se desprenderá das proteínas ligadas a ele, uma vez que estas são digeridas pela proteinase K 
Profa Dra Katia Karina
Após digestão com proteinase K, inative a enzima por aquecimento a 95-100oC por alguns minutos, e o DNA já está pronto para ser usado.
Passos adicionais de purificação com fenol/clorofórmio seguida de precipitação com etanol, podem ser usados, mas não são necessários.
O DNA pode também ser ulteriormente purificado com resinas que ligam DNA. 
Após eluir o DNA da resina, alguns resíduos de resina podem persistir, o que interefere com algumas reações enzimáticas envolvendo DNA. Centrifugue antes de pipetar, para não pipetar resíduos de resina.
Lise das células pode ser feita de vários modos:
- fervura por alguns minutos
- solução hipotônica (lise osmótica)
- “freeze-thaw”
- detergente: triton, nonidet 40, SDS
- enzima: lisozima
EDTA: quelante de Ca2+ e Mg2+, inibe a ação de DNAses 
Material Parafinado:
1) Cortes de 5 a 10 m de espessura (3 a 5)
(Lâmina perfeitamente limpa - passar etanol 100% - uma lâmina para cada novo bloco)
Confirme a presença do tecido de interesse no último corte.
2) Retire o excesso de parafina em cada corte, com cotonete estéril ou algo similar, visualizando-o sobre uma lâmina limpa.
3) Transfira o restante do material para tubo Eppendorf - 1,5 mL
4) Adicione 1 mL de xileno, agite vigorosamente por 30 min, à temperatura ambiente (TA)
5) Centrifugue a 14.000 rpm - 3 min - TA. Remova o sobrenadante.
6) Repita os procedimentos de 4 e 5 por mais 2 vezes.
Continuação:
7) Lave 2 vezes com etanol (95 - 100%) para remover xileno
8) Faça a digestão da amostra com proteinase K (200 g/mL) em 200 L de tampão de digestão. Incube a 37oC por 24 a 72 h, ou a 50oC por 3 - 4 h, sob leve agitação, acrescentando proteinase K (20 g/mL) até obter uma solução bem homogênea.
9) Centrifugue a 14.000 rpm por 5 min - TA. Transfira o
 sobrenadante para outro tubo - aí está seu DNA.
	Quantifique
Analise através de eletroforese em gel de agarose.
QUESTÕES A SEREM ESCLARECIDAS
Para que o uso do detergente?
Para que o uso do sal?
Por que o uso de álcool gelado?
Qual a função da proteinase K?
Porque avaliar leucócitos e desprezar os eritrócitos?
Pode ser avaliado somente células vivas? Justifique sua resposta.