AULA BIOPROCESSOS 5 CINÉTICA MICROBIANA REV 01

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CINÉTICA DE PROCESSOSICA
FERMENTATIVOS
Crescimento microbiano, Consumo de substrato e Formação de produto
Luiz André Schlittler., DSc
Professor Coordenador
SENAI CETIQT
Curdo de Engenharia Química
Objetivos da Cinética de
Processos Fermentativos
Medir taxas de transformação;
Estudar a influência de fatores nessas taxas;
Correlacionar, por meio de equações empíricas ou modelos matemáticos, as taxas de transformações com os fatores que nelas influenciam;
Aplicar as equações obtidas na otimização e no controle do processo.
2
A Célula Bacteriana
Gram -
Gram +
Microrganismos procariontes;
Mecanismo de reprodução assexual: divisão binária;
Podem apresentar motilidade;
Esporulação: forma latente de vida (altamente desidratada);
Dimensão característica  1m;
Densidade  1,05 a 1,1 g/cm3;
• Massa  10-12 g.
O método da coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de bactérias Gram + de reterem o Corante Cristal Violeta no citoplasma durante um tratamento com etanol-acetona enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram - não o fazem, sendo coradas, após remoção do cristal violeta, em rosa com Fucsina Básica.
microrganismos eucariontes, fungos verdadeiros não filamentosos
imóveis e não fotossintéticos;
podem formar pseudo-micélio;
forma mais comum de reprodução assexual: gemulação (brotamento);
divisão binária (cissiparidade) é rara, podendo ser encontrada no gênero
Schizosaccharomyces;
esporulação: diferenciação sexual;
dimensão característica  3 a 5 m;
densidade  1,05 a 1,10 g/cm3 ;
• massa  10-11 g.
ascosporos
gemulação
As Leveduras
BOLORES (eucariotos) e ACTINOMICETOS (procariotos) predominantemente crescem pelo processo de alongamento de cadeia (hifas).
A hifa é uma estrutura de ramificação tubular, possuindo um diâmetro de 2 a 10
m, podendo ou não ser dividida em células individuais, através de septos.
O conjunto das hifas é denominado micélio.
Nos fungos, as células podem ser multinucleadas e podem conter uma variedade de organelas.
Os actinomicetos, incluindo os dos gêneros Actinomyces, Streptomyces e Nocardia são considerados bactérias filamentosas “gram positivas” e, portanto, seres procariotos, não possuindo membrana nuclear. Suas hifas são de diâmetro menor do que as hifas de bolores (cerca de 1m) e, como conseqüência mais frágeis.
Microrganismos
Filamentosos
Estrutura filamentosa
de Actinomicetos
Micélio de Aspergillus nidulans
e desenvolvimento de conidiosporos
CÉLULA COMO AGENTE DE BIOPROCESSOS:
CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS
 VIABILIDADE  sobrevivência celular;
 POTÊNCIA	
especialização	para
realizar	determinada
máxima	de
função	com	alta	tolerância	(ou	capacidade expressão do produto de interesse);
 ESTABILIDADE
	manutenção	da	integridade	genética	e
fisiológica da célula;
 INOCUIDADE  nenhuma ou reduzida patogenicidade.
TRANSPORTE PASSIVO : é impulsionado por gradientes de concentração, não havendo gasto de energia (ATP). Podem ocorrer de 2 modos: Através da bicamada ou por difusão facilitada. transportam moléculas polares, como amino-ácidos, açúcares e vitaminas por uniporte, simporte ou antiporte.
TRANSPORTE ATIVO : Há hidrólise de ATP para produção de energia. Emprego de carreadores (permeases). Bombas iônicas (de Na+ e K+ ATPase, de H+, de Ca2+ ATPase, de H+ e K+ ATPase).
As proteínas envolvidas no transporte podem ser classificadas de acordo com a seguinte nomenclatura:
UNIPORTE: transporta uma única espécie;
SIMPORTE: transporta duas espécies na mesma direção;
ANTIPORTE: transporta duas espécies em direções opostas.
TRANSPORTE MOLECULAR
TIPOS DE TRANSPORTES ATRAVÉS DA
MEMBRANA CITOPLASMÁTICA
C
CS
S
S
S S
S S
S
S S
S
S S S
S
meio externo
meio intracelular
Membrana citoplasmática
ENERGIA
transporte ativo
C
CS
S
S
S
S
S
S	S
S S
S
S
S
S
meio
externo
meio intracelular
Membrana citoplasmática
difusão facilitada
difusão simples
S S
S
S	S S S
S
meio externo
meio intracelular
Membrana
citoplasmática
S
S
S
S
S
S
transporte passivo
memb
part
TP
d
ca  cc  Pca  cc 
J	
Dmemb .K
Modelo de Transporte Passivo
O fluxo mássico por difusão molecular segue a Lei de Fick:
Fluxo mássico por g de massa seca:
acel: área específica da superfície da célula	
rTP* : fluxo difusivo por grama de células	
J	*  P.a	c	 c 
TP	cel	a	c
JTP: fluxo difusivo ( mol . m-2 .s-1 )
Dmemb: coeficiente de difusão na bicamada lipídica (m 2 . s-1)
Kpart: coeficiente de partição (razão da sol. do componente na camada lipídica e a sol. do componente em água)
dmemb : espessura da membrana ( m )
P: coeficient e de permeabilidade ( m . s-1 )
c: concentração do componente na fase abiótica ( mol . m3 )
c: concentração do componente no citossol ( mol . m3)
Modelo de Difusão Facilitada
membrana
CS	S
fase abiótica
fase
citossólica
Ca  Sa  CS a  CS c  Cc  Sc
K2
K1
C: carreador (permease)
S: substrato
CS: complexo carreador/substrato
memb
DF
K S
d
DCS  C
total
2	1 K S
J	
JDF : taxa total de transporte por difusão facilitada DCS : difusividade do complexo carreador : substrato dmemb: espessura da membrana citoplasmática
O mecanismo de transporte é equivalente ao mecanismo de Michaelis-Menten (M-M) das reações catalisadas enzimaticamente. A constante de M-M foi substituída pela difusividade multiplicada pela metade da quantidade total de carreador, que é a quantidade efetiva de carreador disponível para o transporte em qualquer tempo. A outra metade sendo complexada com o substrato.
a
c
K1 : const. de velocidade da formação / dissociação carreador : substrato
Fonte: Stephanopoulos; Aristidou & Nielsen (1998).
10
Microrganismos requerem substrato para 3 funções principais:
Síntese de novo material celular;
Síntese de produtos extracelulares (secretados);
Fornecimento de energia necessária para:
reações anabólicas (endoergônicas);
reações de reciclo de material intracelular (turnover)
ANABOLISMO
(Biossíntese)
Nutrientes
Fonte de
Energia
Produtos
Energia
Crescimento
Energia
Movimento, Transporte, etc.
CATABOLISMO
Componentes Celulares
Representação Esquemática do Metabolismo Microbiano
Enzimas extracelulares
Processos endoergônicos
Processos exoergônicos
AÇÚCAR
Transporte e Fosforilação
pool da hexose fosfato
CO2
GLICÓLISE E VIA DAS PENTOSES-FOSFATO
ATP NADH NADPH
Piruvato
Produtos
Metabólicos
Metabolismo
Fermentativo
NADH
NADH
CICLO TCA
CO2
O2
NADH
H2O
Fosforilação Oxidativa
ESQUEMA GERAL DA SÍNTESE CELULAR A PARTIR DE AÇÚCARES
Metabólitos Precursores
CATABOLISMO
ANABOLISMO
Blocos de Construção
Macromoléculas
ENERGIA
Biossíntese
NADPH ATP
Polimerização
CRESCIMENTO: aumento
ordenado de todos os constituintes de uma célula (efetua-se a todo momento). Está relacionado ao aumento da MASSA CELULAR.
no	instante
celular.
MULTIPLICAÇÃO:	só	se
da
Está
apresenta divisão relacionada
ao	aumento	do
NÚMERO DE CÉLULAS.
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
10
massa ou número de células
5
tempo
crescimento
multiplicação
0
No entanto, como a probabilidade de existirem células se multiplicando a todo instante é muito grande, considerar-se-á o crescimento como o aumento do material celular, expresso em termos de massa ou número de células.
Crescimento microbiano
CÉLULAS
CÉLULAS
20
21
22
N0
N0 . 21
N0 . 22
2n
N0 . 2n
após n gerações
após n gerações
Concentração de células após um período de tempo “t” de crescimento exponencial (Nt).
Concentração de células no início da fase de crescimento exponencial.
Nt = N0 . 2n
n = log Nt – log N0
 log 2
 n = número de gerações ocorridas durante o período “t” de crescimento exponencial.
CRESCIMENTO EXPONENCIAL
-Velocidades Instantâneas de consumo de substrato (rs), de crescimento celular (rx) e de formação de produto (rp).
rx = dx/dt
rs = -ds/dt
rp = dp/dt-Velocidades Específicas de consumo de substrato (µs), de crescimento celular (µx) e de formação de produto (µp).
µx = (1/x) / (dx/dt)
 µs = (1/x) / (-ds/dt)
µp = (1/x) / (dp/dt)
Parâmetros de Transformação
Fases do crescimento celular e
Determinação de X e td no cultivo em Batelada
a	fase
exponencial	do
Considerando
crescimento:
t=0  X=Xo t=t  X=X
X	t
Xo
0
 dLnX  dt
o
x
Xo
ext
	X  X
Ln	X	  t
Definindo td como o tempo de duplicação da massa celular:
X 2  2 X1		t2  t1  td
x 	x
d
t
	
 Ln2  0,693
A Equação de Monod
	Microrganismo	T(oC)	m (h-1)
	Bactérias	37	0,6 – 1,0
	Leveduras (*)	30	0,3 – 0,5
	Fungos filamentosos	28	0,1 – 0,3
Determinação dos parâmetros cinéticos Ks e m
Taxa específica máxima de crescimento para diferentes microrganismos
(*) em cultivo aeróbio
coeficiente angular
coeficiente linear
S
 KS  S 
  max 
LINEARIZAÇÃO
1	1	KS	1
S
max	max



Quando:
KS
S
1
S
1
1  	1

 	KS
max
max
1  o	

	MICRORGANISMO	SUBSTRATO	max
(h-1)	YX/S
(g/g)
	KS
(g/L)
	Escherichia coli	glicose	0,500	0,50	0,005
	Escherichia coli	glicerol	0,300	0,50	0,60
	Acetogenium kivui	glicose	0,790	0,28	0,18
	Zymomonas mobilis	glicose	0,190	0,02	0,19
	Clostridium butyricum	glicerol	0,580	0,045	-
	Pseudomonas cepacia	fenol	0,320	0,740	0,001
	Pseudomonas cepacia	oxigênio	0,320	0,520	-
	Saccharomyces cerevisiae	glicose (A)	0,25	0,500	0,4-0,5
	Saccharomyces cerevisiae	etanol	0,1-0,2	0,7-0,8	0,1-0,2
	Saccharomyces cerevisiae	glicose (AN)	0,0-0,1	0,05-0,1	0,4-0,5
	Trichosporon cutaneum	glicose	0,37	0,87	0,20
	Trichosporon cutaneum	oxigênio	0,37	2,8	4,6.10-5
	Trichoderma reesei	glicose	0,12	0,50	0,1-0,2
	Trichoderma reesei	celulose	0,04	0,28	-
	Penicilium chrysogenum	glicose	0,12	0,48	0,1-0,2
VALORES DE PARÂMETROS CINÉTICOS
PARA DIFERENTES MICRORGANISMOS E SUBSTRATOS
Crescimento de Micro-organismo Filamentoso
R
pellets  forma esférica
dt
dR  K cte
A massa micelial é dada por:
M = volume de esfera x densidade
M  4 R3
3
1/ 3
	M 
R   3	
 4
3
dt	3	dt	dt
 4R2 dR
dM  4 dR




 4
2 / 3
M	
 4K  3
dt
dM
dt
dM	412 / 3 K 32 / 3 M 2 / 3
  K 361/ 3

dM	M 2 / 3
dt

M

M
M
 dM	
o
2 / 3
t
	dt
0
3

3 




M 	M
1/ 3
o
t 
Como Mo é usualmente muito menor do que M, a equação mostra uma dependência cúbica da massa micelial M com o tempo.
Modelos Cinéticos de Bioprocessos
c
c
R	j
V	Xc
j

dt	
1	1
	V	Xr			c
R	f		X	j





	c	
d  1
Quanto ao número de componentes usados na representação celular:
Modelos não-estruturados: o material celular é representado por uma única variável, por exemplo, a massa celular ou o número de células;
Modelos estruturados: as células são descritas com maiores detalhes, considerando, por exemplo, os componentes intracelulares (RNA, proteínas, ATP, aminoácidos etc), permitindo descrever o estado das células e sua adaptação às mudanças ambientais.
c: densidade celular;
X: concentração da massa celular;
rfj: taxa de formação do componente j;
VR: volume do meio de cultivo;
cj: moles de j/unidade de volume celular;
X: massa de células adicionada ao biorreator.
dt	KS  S
dX 	m S
dt
dt
YX / S
dS  	1	dX
dP dt
dt 
  dX   X
Modelo não-estruturado: 	Modelo estruturado:
CLASSIFICAÇÃO DA CINÉTICA MICROBIANA
Classificação de GADEN: Relaciona a cinética de crescimento celular com a formação de produto.
Produção associada ao crescimento
Produção semi-associada ao crescimento
Produção não associada ao crescimento
CLASSIFICAÇÃO DA CINÉTICA MICROBIANA
Classificação de DEINDORFER: Relaciona a cinética de consumo de substrato com a formação de produto.
Simples: Processo em que o substrato é convertido em produto através de razões estequiométricas fixas, sem que haja acumulo de intermediários. 
Simultâneo: Processo em que o substrato é convertido em diferentes produtos através de razões estequiométricas variáveis, sem acúmulo de intermediários.
Consecutivo: Também chamado de sequencial, é o processo em que o substrato é convertido em produto final, de maneira efetiva, após o acúmulo de determinada quantidade de intermediário(s).
Em Etapas: Também chamado de sucessivo, é o processo em na presença de diferentes substratos, que o agente esgota primeiro uma fonte de substrato para após consumir a outra. No mundo da microbiologia, isso é chamado de consumo preferencial
VARIÁVEIS DE RESPOSTA IMPORTANTES PARA SE AVALIAR O DESEMPENHO DE PROCESSOS FERMENTATIVOS
YP/S; YX/S; YP/X
[g/g]
Produtividade:
Q
P
g / L.h
 P t
Fatores de Rendimento:
Definem a viabilidade técnica e econômica de Bioprocessos
Y
: g de células / gmol denitrato consumido
: g de células / gmol de oxigênio consumido
:	g decélulas / g de substrato inicial
X / NO3
YX / O
2
YX / ATP : g de células / gmol de ATP consumido YX / Kcal : g de células / Kcal de calor evolvido
YX / S
o

Outras Definições de Fatores de Rendimento para o CRESCIMENTO
:	g de produto / g de substrato inicial
:	g de CO2	produzido / g de substrato consumido
:	g de CO2	produzido / g de O2 consumido
:	g de ATP produzido / g de substrato consumido
YP / S
o
YCO / S
2
YCO / O
2	2
YATP / S
Outras Definições de Fatores de Rendimento para a PRODUÇÃO
Definição dos Fatores de Rendimento	para o Crescimento e a
Formação de Produto e suas Relações com as Taxas Específicas
Y
 X	
S
X / S
Y
 P 
S
P / S
Y
 P
X
P / X
Y
X / S
 dX / dt 
-dS / dt
Y
P / S
 dP/ dt	
-dS / dt
Y
P / X
 dP / dt dX / dt
YX / S	 
rS
Y
 rp
P / S
rx
Y
 rp
P / X
YP / S  YP / X  YX / S
rx
rS
	MICRORGANISMO	SUBSTRATO	max
(h-1)	YX/S
(g/g)
	KS
(g/L)
	Escherichia coli	glicose	0,500	0,50	0,005
	Escherichia coli	glicerol	0,300	0,50	0,60
	Acetogenium kivui	glicose	0,790	0,28	0,18
	Zymomonas mobilis	glicose	0,190	0,02	0,19
	Clostridium butyricum	glicerol	0,580	0,045	-
	Pseudomonas cepacia	fenol	0,320	0,740	0,001
	Pseudomonas cepacia	oxigênio	0,320	0,520	-
	Saccharomyces cerevisiae	glicose (A)	0,25	0,500	0,4-0,5
	Saccharomyces cerevisiae	etanol	0,1-0,2	0,7-0,8	0,1-0,2
	Saccharomyces cerevisiae	glicose (AN)	0,0-0,1	0,05-0,1	0,4-0,5
	Trichosporon cutaneum	glicose	0,37	0,87	0,20
	Trichosporon cutaneum	oxigênio	0,37	2,8	4,6.10-5
	Trichoderma reesei	glicose	0,12	0,50	0,1-0,2
	Trichoderma reesei	celulose	0,04	0,28	-
	Penicilium chrysogenum	glicose	0,12	0,48	0,1-0,2
VALORES DE PARÂMETROS CINÉTICOS
PARA DIFERENTES MICRORGANISMOS E SUBSTRATOS
Coeficiente de manutenção energética (m)

total
S
 X	
 Y
X / S
total
 	dX / dt	
X / S
 dS / dt 
 Y
ou
dt G	 dt m
 dS 	 dS 
dt total
dS 
 dt G
 dS 
Substrato ligado ao crescimento celular (que vai ser incorporado à massa celular). Destinado à síntese de novas células.
Plasticidade celular (biomassa)
 dt m
 dS 
Substrato usado somente para manter a célula em um estado viável e não para produzir material celular ou produto. Substrato ligado à manutenção endógena. Metabolismo basal (motilidade, transporteosmótico e turnover de macromoléculas). Manutenção de gradientes e potencial elétrico no transporte de nutrientes, ciclos fúteis (incorporação e retirada sequencial de radicais, por exemplo fosfato na síntese de F6P – 1,6FBP – F6P)
=
29