aula de enzimas 1

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ENZIMAS 
• A partir de 1700: degradação do amido em 
açucares pela saliva – início das pesquisas de 
catálise enzimática 
 
• Em 1850: degradação de açucares em álcool 
por leveduras é catalisada por “fermentos” 
 
• Em 1930: todas as enzimas são proteínas 
(exceto por um pequeno grupo de RNA 
catalítico) 
 
Conceitos Gerais: 
 
•Enzimas são proteínas com atividade catalítica. 
Praticamente todas as reações que caracterizam o 
metabolismo celular são catalisadas por enzimas; 
•Reações espontâneas mas muito lentas são aceleradas 
na catálise enzimática, exemplo a oxidação de sacarose 
a CO2 e H2O (reação exergônica). 
•As enzimas aceleram a velocidade de uma reação, sem 
no entanto participar dela como reagente ou produto; 
• São os catalisadores mais eficientes aumentando a 
velocidade de reação em até 1014 vezes; 
•São extremamente específicas chegando ao ponto de 
distinguir esterioisômeros. 
 
 
 
A atividade catalítica de uma enzima depende de 
sua conformação nativa. A desnaturação ou a 
dissociação das subunidades geralmente torna a 
enzima inativa. A sua degradação em seus 
aminoácidos é sempre destrutiva 
Assim as estruturas primária, secundária, 
terciária e quaternária são essenciais à 
atividade enzimática 
COFATORES ENZIMÁTICOS E COENZIMAS 
 
Cofatores são pequenas moléculas orgânicas ou inorgânicas 
que podem ser necessárias para a função de uma 
enzima. Estes cofatores não estão ligados permanentemente à 
molécula da enzima mas, na ausência deles, a enzima é inativa. 
Duas classes importantes: íons metálicos e coenzimas 
A fração protéica de uma enzima, na ausência do seu cofator, 
é chamada de apoenzima. 
Enzima + Cofator, chamamos de holoenzima. 
Coenzimas são compostos orgânicos, quase sempre 
derivados de vitaminas, que atuam em conjunto com as 
enzimas. Podem atuar segundo 3 modelos: 
• Ligando-se à enzima com afinidade semelhante à do 
substrato. 
• Ligando-se covalentemente em local próximo ou no próprio 
sítio catalítico da apoenzima. 
• Atuando de maneira intermediária aos dois extremos acima 
citados. 
Nomenclatura 
Sufixo “ASE” adicionado ao nome do substrato ou a 
atividade Ex: 
DNA-polimerase = polimerização de nucleotídeos para formar 
DNA 
Urease = hidrólise de uréia 
Pepsina - pepsis = digestão 
Lisozima – lisar= degradar parede de bactérias 
Comitê Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular – 
numeração e nome sistemático: 
ATP: GLICOSE-FOSFOTRANSFERASE = transfere um grupo fosforil 
do ATP para a glicose 
Numeração 2.7.1.1 
Classe Transferase Subclasse Fosfotransferase 
Grupo aceptor (OH-) 
Grupo aceptor do fosforil 
(glicose) 
Classificação das Enzimas: 
 
1. Oxidorredutases: São enzimas que catalisam reações de transferência 
de elétrons, ou seja: reações de oxi-redução. São as Desidrogenases e as 
Oxidases 
2. Transferases: Enzimas que catalisam reações de transferência de 
grupamentos funcionais como grupos amina, fosfato, acil, carboxil, etc. 
Como exemplo temos as Quinases e as Transaminases 
3. Hidrolases: Catalisam reações de hidrólise de ligação covalente. Ex: As 
peptidades 
4. Liases: Catalisam a quebra de ligações covalentes e a remoção de 
moléculas de água, amônia e gás carbônico. As Dehidratases e as 
Descarboxilases são bons exemplos 
5. Isomerases: Catalisam reações de interconversão entre isômeros 
ópticos ou geométricos. As Epimerases são exemplos. 
6. Ligases: Catalisam reações de formação e novas moléculas a partir da 
ligação entre duas já existentes, sempre às custas de energia (ATP). São 
as Sintetases. 
Complexo enzima-substrato 
SÍTIO ATIVO – É a região na superfície da enzima 
onde ocorre a catálise. O SUBSTRATO liga-se ao sítio 
ativo por ligações não-covalentes (interações 
eletrostáticas, pontes hidrogênio, interações de Van 
der Waals e interações hidrofóbicas.) 
Uma das explicações para a elevada especificidade das enzimas é 
que suas estruturas tridimensionais permitem um perfeito encaixe 
com o substrato. 
Dois modelos foram propostos para explicar a especificidade 
enzimática, o modelo chave-fechadura e o modelo encaixe-
induzido. 
substrato 
sítio ativo 
enzima 
Modelo chave-fechadura : Assume um alto grau de similaridade 
entre a forma do substrato e o sítio da enzima 
Modelo encaixe-induzido : Neste modelo os sítios ativos da 
enzima não estão completamente pré-formados e a interação 
inicial do substrato com a enzima induz uma interação 
conformacional na enzima. 
Porque o modelo do ENCAIXE 
INDUZIDO é termodinamicamente mais 
correto?? 
Do que depende a atividade de uma enzima? 
As enzimas alteram a velocidade da reação 
sem alterar o equilíbrio 
Reação enzimática: 
S = Substrato 
E = Enzima 
P = Produto 
ES e EP = complexos transitórios 
A reação pode ser descrita por um diagrama de 
coordenadas que é a variação da Energia Livre com o 
progresso da reação 
• As moléculas devem suplantar a barreira energética 
• O topo da curva é o ponto onde há a mesma probabilidade de 
progressão ou retrocesso – ESTADO DE TRANSIÇÃO 
• Eestado fundamental – Eestado de transição = ENERGIA DE ATIVAÇÃO 
Como esta barreira energética que é a 
Energia de Ativação de um sistema 
pode ser suplantada? 
Conversão de Sacarose em CO2 e água – na célula 
ocorre rapidamente em sucessivas etapas 
Reações com várias etapas tem vários 
INTERMEDIÁRIOS DA REAÇÃO 
E + S ↔ ES ↔ EP ↔ E + P 
INTERMEDIÁRIOS DA REAÇÃO 
A etapa com maior Eativação é a etapa mais lenta e a 
ETAPA LIMITANTE DA VELOCIDADE 
Catalisadores aumentam a velocidade da reação, 
diminuindo a Eativação 
Determinação da velocidade de uma reação 
TEORIA DO ESTADO DE TRANSIÇÃO 
 
Onde k é a constante de Boltzmann e h é a constante de Planck 
A relação mostra que a constante de velocidade k é 
exponencial e inversamente proporcional à ∆G‡ 
,isto é, 
Menor ∆G‡ maior a velocidade da reação 
Aumento da temperatura aumenta a velocidade da 
reação, mas a partir de um máximo inicia-se a 
desnaturação - perda atividade enzimática 
Como ocorre a catálise enzimática? 
Reações químicas entre o substrato e os 
grupos funcionais da enzima: 
• Ligações covalentes transitórias 
• Transferência de grupos químicos entre a 
enzima e o substrato 
• Interações fracas: ligações hidrogênio, 
interações hidrofóbicas e interações 
iônicas 
Principais forças de estabilização 
Na formação do complexo ES há liberação de energia na 
formação das INTERAÇÕES FRACAS 
A ENERGIA DE LIGAÇÃO é a principal energia livre na 
redução da ∆G‡ 
INTERAÇÕES FRACAS são otimizadas no 
ESTADO DE TRANSIÇÃO, principalmente no sítio 
ativo da enzima 
O “perfeito encaixe” só ocorre no estado de 
transição, porque tanto a E quanto o S tem sua 
conformação alterada pelas interações fracas 
necessárias para suplantar a ∆G‡ 
Quais forças estabilizam o complexo 
enzima-substrato? 
 
 
Qual a “fonte” de energia na catálise 
enzimática capaz de suplantar a barreira 
energética do estado de transição? 
Interações fracas formadas no estado de transição 
no complexo ES fornecem uma força propulsora 
substancial para a catálise enzimática 
Para acelerar com um fator de 10, 
uma reação de primeira ordem na 
célula deve ter a ∆G‡ reduzido em 
5,7 kJ/mol 
As interações fracas tem 4-
30 kJ/mol sendo suficientes 
para acelerar a reação com 
elevados fatores 
Fatores termodinâmicos e físicos que contribuem com a ∆G‡: 
• Entropia das moléculas em solução 
• Camada de solvatação 
• Distorção do substrato 
• Necessidade de alinhamento dos 
grupos funcionais 
A ENERGIA DE LIGAÇÃO suplanta todas estas 
barreiras – principalmente as várias interações 
fracas formada no complexo ES localizadas no 
sítio ativo 
ESPECIFICIDADE 
A especificidade deriva de muitas interações fracas 
entre o substrato e a enzima 
Ex: 
Se um substrato tem um grupo OH- que forma ligação 
hidrogênio com um resíduo de glutamina de uma 
enzima, outro composto que não tiver o OH-na mesma 
posição é um S “pobre” 
Alguns mecanismos catalíticos envolvem 
interações transitórias COVALENTES e 
DOAÇÃO DE GRUPOS: 
Catálise ácido-base – grupos doadores ou aceptores de 
prótons em sítios ativos enzimáticos 
Catálise covalente – cadeias laterais R de AA ou cofatores são 
nucleófilos na formação da ligação covalente 
Catálise por íons metálicos – interações iônicas 
CINÉTICA ENZIMÁTICA 
 
Determinação da velocidade da reação enzimática 
e como ela se modifica em resposta a mudanças 
nos parâmetros experimentais 
 
O modelo de Michaelis-Menten é útil para 
explicar a cinética das reações catalisadas por 
enzimas. 
 
Aqui, serão mostradas as etapas necessárias para 
se chegar à equação de Michaelis-Menten e para 
ver como são determinadas as constantes 
cinéticas de uma enzima. 
 
A concentração de substrato [S] altera a velocidade da reação 
Como há modificação da conformação do substrato ao longo 
da reação a V0 (velocidade inicial) é um parâmetro mais 
mensurável 
Como E << S, nos primeiros segundos da reação [S] é 
constante, então V0 é medido 
 
O modelo de Michaelis-Menten considera que uma reação 
enzimática ocorre em dois passos: 
 
 
ETAPA 1. Ligação de um substrato (S) a uma enzima 
(E), formando um complexo intermediário (ES) 
ETAPA 2.Formação do produto (P) a partir do complexo 
ES, com recuperação da forma livre da enzima (E) 
Etapa lenta – a velocidade depende de ES 
A reação do slide anterior está representada no equilíbrio: 
 
onde k1, k2, k3 e k4 são as constantes de velocidade de 
cada etapa. 
 
ou seja, a velocidade de formação do produto será: 
 
eq.1 
 
Porém, no estado inicial, podemos simplificar a reação: 
 
 
A reação 4 (k4) não ocorre nessa situação porque a 
quantidade de P é ainda muito pequena para estabelecer o 
equilíbrio. 
 A velocidade inicial de reação neste caso é dada por: 
 
ATENÇÃO: Como estão duas reações acopladas (o produto da 
primeira é substrato da segunda), na maioria das vezes, estas 
reações ocorrem fora do equilíbrio mesmo na Etapa 1 apesar das 
duas reações (de constantes k1 e k2) estarem acontecendo. Por isso, 
definimos o ESTADO ESTACIONÁRIO (a seguir). 
 
eq.2 
Na análise cinética da reação catalisada por uma enzima, 
consideramos apenas o ESTADO ESTACIONÁRIO, que é aquele 
em que, apesar de estarem mudando as concentrações de S 
(diminuindo) e de P (aumentando), não há variação da 
concentração dos intermediários da reação. 
Velocidade de formação de ES =Velocidade de decomposição de ES 
o intermediário é o complexo ES, e no estado estacionário temos: 
eq.3 
 
A equação 3 pode ser re-arranjada em: 
 
Para simplificar a equação 4, foi definida uma constante, Km, 
conhecida como Constante de Michaelis: 
 
O Km é uma relação de constantes de velocidade e, portanto, é 
uma constante. Se você fizer o raciocínio considerando 
concentrações, Km nunca seria constante! 
 
eq.5 
eq.4 
No numerador, temos duas constantes de velocidade de 
reações de DECOMPOSIÇÃO de ES e no denominador, 
a constante de velocidade da FORMAÇÃO de ES. 
 
Dessa forma, Km pode ser uma medida da AFINIDADE 
da enzima pelo substrato, quando k3 < < k2 
 
Entretanto quando k3 > > k2 ou k3 ~ k2, Km é uma função 
mais complexa de três velocidades. 
 
Substituindo a eq. 5 na eq. 4, teremos: 
 
 
Como toda a enzima que estiver na solução de reação 
(ETOTAL) corresponde à soma das espécies E (enzimas livres) 
e ES (enzimas no complexo com substrato), 
 
 
Substituindo a eq. 7 em 6, temos: 
 
Que pode ser transformada em ... 
Podemos substituir esta equação na da velocidade inicial da 
reação V0= k3.[ES]: 
para que V0= k3[E]TOTAL, é necessário que: 
 
A primeira idéia que vem à cabeça é que isso só será possível se 
Km for igual a ZERO. Mas Km não pode ser zero!!!!!!!! Então, 
devemos raciocinar em termos da relação entre Km e [S] na 
reação. Na verdade V0= k3[E]TOTAL quando [S] for MUITO MAIOR 
que o Km. 
 
 
Quando todas as enzimas estão na forma de complexo ES, 
atingimos a velocidade máxima de reação, ou seja, se [E]TOTAL= 
[ES], então a equação 10, pode ser representada por: 
 
Qual a principal consideração no 
estabelecimento de um estado estacionário 
na reação enzimática? 
 
 
 
O que a constante de Michaelis-Menten 
relaciona e o que ela pode medir? 
Ou seja, Km corresponde à concentração de S necessária 
para se atingir a metade da velocidade máxima! 
Se [S]<<<Km, então a eq. 12 fica: 
 
 
E se [S] >>>> Km, é a mesma situação que vimos antes, e 
ou 
Este gráfico mostra como varia a velocidade inicial de uma 
reação com o aumento da concentração de substrato: 
 
Ou seja, Vmáx e Km podem ser calculados quando V0 é medida 
em função de várias concentrações de substrato. 
 
 
A eq. 12: 
 
 
pode ser representada na forma inversa (eq. 13) que representa 
uma equação do tipo y =ax+ b (reta): 
 
 
A eq. 13 representa uma equação de reta, ou seja, 
uma equação do tipo y=ax+ b: 
 
a inclinação da reta corresponde a Km/Vmáx e o 
intercepto a 1/Vmáx. 
 
O gráfico dos duplos recíprocos (Linewear-Burk) permite a 
determinação precisa de Km e Vmáx já que na extrapolação 
dos dados experimentais, chegamos a uma situação em que 
1/V0= 1/Vmáx quando 1/[S] = 0; ou seja, quando a concentração 
de substrato for muito alta!!!! 
 
Enzimas que catalisam 2 substratos 
Ex: hexocinase 
ATP + glicose → ADP + glicose-6-fosfato 
Há um Km para cada substrato 
Inibição Enzimática: 
 
Os inibidores enzimáticos são compostos que podem 
diminuir a atividade de uma enzima. 
A inibição enzimática pode ser reversível ou 
irreversível; 
Existem 2 tipos de inibição enzimática 
reversível:Competitiva e não-competitiva 
A inibição mista também ocorre – o inibidor pode 
ligar-se tanto ao sítio ativo da enzima quanto ao 
complexo ES 
Inibição Enzimática Reversível Competitiva: 
 
•Quando o inibidor se liga reversivelmente 
ao mesmo sítio de ligação do substrato; 
 
•O efeito é revertido aumentando-se a 
concentração de substrato 
 
•Este tipo de inibição depende das 
concentrações de substrato e de inibidor. 
Inibição Enzimática Reversível Não-Competitiva: 
 
•Quando o inibidor liga-se reversívelmente 
à enzima em um sítio próprio de ligação, 
podendo estar ligado à mesma ao mesmo 
tempo que o substrato; 
 
•Este tipo de inibição depende apenas da 
concentração do inibidor. 
Inibidor Não-competitivo 
Altera Vmax – reduzida pelo fator α 
Km diminui pois [s] necessária para atingir metade da Vmax 
diminue por um fator α 
INIBIÇÃO NÃO COMPETITIVA 
INIBIÇÃO MISTA 
Na inibição enzimática irreversível, há modificação 
covalente e definitiva no sítio de ligação ou no sítio 
catalítico da enzima. 
Inibição irreversível 
INATIVADORES SUICIDAS – Se ligam ao sítio ativo de 
forma irreversível 
Planejamento racional de drogas 
Agentes farmacêuticos 
Específico para determinada Enzima – 
só é ativo quando ligado à enzima 
Poucos efeitos colaterais 
Como é possível reverter a inibição 
competitiva? E a inibição não 
competitiva? 
A CINÉTICA É MELHOR ELUCIDADA QUANDO A 
VELOCIDADE DE CADA ETAPA DA REAÇÃO É 
MEDIDA E A QUANTIFICAÇÃO DASA MUDANÇAS 
ENERGÉTICAS EM CADA ETAPA É REALIZADA 
ESTADO PRÉ ESTACIONÁRIO – INÍCIO DA REAÇÃO 
PESQUISADORES TEM TRABALHADO ESTE 
ASSUNTO E OUTROS MECANISMOS DE 
REAÇÃO E CINÉTICAS, DIFERENTES DA 
PROPOSTA DE MICHAELIS-MENTEN, TEM 
SIDO ENCONTRADAS 
1) Quais os parâmetros que afetam a velocidade da reação enzimática? 
Explique os mecanismos de ação, utilizando equações e gráficos. 
 
2) Estime os valores de Vmax e de Km da reação catalisada por Enzima na 
qual foram obtidos os seguintes dados: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3) A equação de velocidade de uma enzima sujeita á inibição competitiva é : 
 
 V0 = Vmax[S]/αKm + [S] onde α = 1 + ([I]/Ki) e Ki=[E] [I]/[EI] 
 
Iniciando com uma nova definição de enzima total: [Et] = [E] + [ES] + [EI] 
 
Deduza a equação da velocidade acima,Use a dedução de Michaelis-Menten 
como guia 
[S] (M) V0 (μM/min) 
2,5 x 10-6 28 
4,0 x 10-6 40 
1 x 10-5 70 
2 x 10-5 95 
4 x 10-5 112 
1 x 10-4 128 
2 x 10-3 139 
1 x 10-2 140