viabilidade celular

Prévia do material em texto

Bioensaios celulares: 
Princípios e Aplicações
Letícia Veras Costa Lotufo
Laboratório de Oncologia Experimental
Departamento de Fisiologia e Farmacologia, 
UFC
lvcosta@secrel.com.br 
PROGRAMA:
•  11/02
– aula 1 - Princípios básicos – Ensaios de 
citotoxicidade
– aula 2 –Alvos celulares - Ciclo celular
•  12/02
– aula 3 – Alvos celulares - Citoesqueleto 
– aula 4 - Morte celular: apoptose versus 
necrose
Cultura de células
•  Cultura de células é o processo pelo qual células são 
mantidas vivas e em crescimento fora de seu tecido 
original em condições controladas
•  Usos:
–  biologia celular
–  farmacologia
–  bioengenharia
–  produção em larga escala de materiais biológicos
Aplicações do cultivo celular
Cultura
de

células

Porque
fazer?

Síntese
de

proteínas


Escala

comercial

Produção
de

anticorpos

monoclonais

Terapia
gênica

Cultura
de

cels.

embrionárias

Cultura

primária

Células
tronco

Estudo
do

câncer

Biologia

celular

Histórico
• Descoberta:
– 1907: Ross Granville Harrison (Embriologista - 
John Hopkins Medical School)
“…Ele dissecou o tubo medular de um 
embrião de sapo de cerca de meio 
centímetro e o mergulho em linfa fresca 
de sapo, que logo coagulou.” (Peres & 
Curi, 2005). Assim começou a cultura de 
tecidos…
Trabalho publicado: Harrison, R.G. 
Proceedings of the Society for 
Experimental Biology and Medicine, 4: 
140-13, 1907.
Histórico:
•  Trecho do Trabalho de Harrison 
(1907):
•  “Quando se tomam as precauções assépticas 
adequadas, os tecidos sobrevivem nessas 
condições por um semana e, em alguns casos, 
foram mantios espécimes vivos durante 
aproximadamente quatro semanas.”
Histórico
•  Alexis Carrel (Rockefeller Institute for Medical 
Research) – buscava formas de prolongar o tempo 
de vida das células em cultura.
1912 – Prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina
Descobriu que a troca de meio onde eram 
mantidas as células favorecia o 
prolongamento do tempo de vidadas células.
Carrel, A. Journal of Experimental Medicine, 
15: 516-528, 1912.
Histórico
•  George Gey (John Hopkins Medical 
School) – 1952
– Henrietta Lacks –cancer de útero
– Células HeLa – crescimento 
rápido
– Contaminação generalizada 
Histórico
• Hayflick and Moorhead (1961)
• 25 linhagens de fibroblastos derivadas de 
fetos
• Características que distinguem as linhagens
• Cultivo celular como uma importante 
ferramenta para o entendimento de processos 
biológico
Trabalho publicado: “The serial cultivation of human diploid cells 
strains”. Experimental cell Research, 25(3): 585-621.
HARRY EAGLE (1955) -Nutrition
Needs
of 
Mammalian
Cells 
 in 
Tissue

Culture.
Science,
September
16,
1955,
122
(3168):
501–504 
•  Realizou uma análise sistemática dos nutrientes necessários 
ao crescimento de células animais em cultura;
•  Estudou o crescimento de duas linhagens de células:
•  células HeLa
•  células L 
•  O meio em que cultivou estas células continha:
•  Mistura de sais
•  Carbohidratos
•  Aminoácidos
•  Vitaminas suplementadas com soro de proteínas
Aminoácidos Vitaminas Sais Outros Proteínas (necessárias em meios sem 
soro, quimicamente definidos) 
Arginina 
Cistina 
Glutamina 
Histidina 
Isoleucina 
Leucina 
Lisina 
Metionina 
Fenilalanina 
Treonina 
Triptofano 
Tirosina 
Valina 
Biotina 
Colina 
Folato 
Nicotinamida 
Pantotenato 
Piridoxal 
Tiamina 
Riboflavina 
NaCl 
KCl 
NaH2PO4 
NaHCO3 
CaCl2 
MgCl2 
Glicose 
Penicilina 
Estreptomicina 
Vermelho de fenol 
Soro 
Insulina 
Transferrina 
Factores específicos de crescimento 
 
Algumas
células
não
crescem
nem
se
diferenciam
se
a
placa

não

estiver
coberta
com
componentes
específicos
da
matriz
extracelular


Vantagens:
•  Estudo do comportamento da células em condições 
controladas - sem a influência animal
•  Uniformidade da amostra 
•  Reprodutibilidade dos experimentos
•  Exposição a fármacos em concentrações definidas 
(Farmacocinética)
•  Redução da utilização de animais – Princípios éticos 
(3Rs)
Desvantagens:
•  Gasto elevado de material; 
•  Condição de crescimento da cultura; 
•  Instabilidade de cultura celular;
•  Perda de características;
•  Dificuldade de extrapolação para o modelo de 
organismo intacto.
Limitações:
•  Necessidade de operadores experientes (com 
conhecimentos da técnica em condições assépticas, 
etc);
•  Perda de características fenotípicas;
•  Necessidade do uso de marcadores devido à perda 
de características fenotípicas;
•  Instabilidade das células (sobretudo em linhagens 
celulares imortais).
Inimigos da culturas de células:
•  
-As células são muito vulneráveis a contaminações 
– TÉCNICAS ASSÉPTICAS 
•  Microorganismos crescem 10-50 vezes mais rápido 
que as células de mamífero, e são mais tolerantes a 
variações de temperatura, pH e disponibilidade de 
nutrientes.
•  Microorganismos desenvolvem resistência aos 
antibióticos
 
Fatores que aumentam a 
probabilidade de contaminação:
•  Descongelamento do nitrogênio líquido 
•  Utilização de enzimas para obtenção de culturas 
primárias 
•  Culturas primárias podm vir contaminadas por 
microorganismos 
•  Diluição excessiva das células 
 
Equipamentos necessários:
Câmara de de fluxo laminar – sistema que permite 
remoção de partíclas do ar, proteção contra 
contaminação cruzada
Fluxos laminares
Equipamentos necessários: 
Incubadora
•  Manutenção da temperatura a 37°C
•  5% de CO2 mantém pH do meio
Técnicas Básicas:
•  Aquisição das linhagens
– Linhagens permanentes e cultura primária
•  Congelamento e descongelamento
– N2 líquido
– Uso de crioprotetor – DMSO
• Manutenção das células
– Meio de cultura, Temperatura, pH, 
Umidade
Linhagens permanentes

(imortais ou transformadas)
•  Capacidade ilimitada de crescimento 
em cultura
• Origem:
– Derivadas de células tumorais 
– Transfecção com oncogenes
– Carcinógeno
Cultura primária
•  Preparadas diretamente das células 
obtidas de um tecido de um 
organismo, com ou sem etapa inicial 
de desagregação
•  Crescimento finito em cultura
•  Podem ou não proliferar
Evolução de uma linhagem 
celular
Subcultivo ou Repicagem
Transferência
do
conteúdo
de
um
frasco
para
dois
novos

frascos

–
troca
de
meio

Células
aderidas
–
necessidade
de
um
agente
desagregador


(tripsina)

Contagem de células
volume/quadrante
=
1mm
x
1mm
x
0,1mm

Câmara
de
Neubauer
  Exclusão
por
azul
de
tripan

  Determinar
o
número
de
células

(viáveis):

No.
de
células
viávéis
x
104
cels./mL

No.
de
quadrantes

Viabilidade celular - Exclusão por 
Azul de Tripan 
Azul de Tripan 
Inviável 
Viável 
Tripan Contagem Amostra 
Cinética de crescimento celular
•  Condições para crescimento:
–  alimento
–  estímulo
–  ambiente
fase
lag

fase
log

plateau

declínio

tempo

nú
m
er
o

de

c
él
ul
as


Avaliação da citotoxicidade
•  Citotoxicidade é a capacidade de se ser tóxico à células
•  Métodos colorimétricos ou fluororimétricos:
–  MTT / XTT
–  SRB
–  Alamar Blue
–  Calceína AM
–  EthD
•  Citostático x citotóxico
•  Tempo e concentração
-  Rápido
  Sensível
  Confiável
  Seguro
  Eficiente
  Custo-benefício
Exigências de um teste de 
citoxicidade in vitro:
Princípios do método:
•  O MTT (ou XTT) são metabolizados pelas 
células viáveis pruduzindo formazan – Leitura 
colorimétrica
•   no. células viáveis –  metabolização 
 coloração
•  Não é um bom método para discriminar entre 
atividade citostática e citocida
•  XTT e MTT –possuem solulibidade diferente
•  MTT-metabolização mais eficiente
Citoplasma

meio
extra‐celular

Berridge
&
Tan,
1993

Doadores
de
e‐

NADH2

NADPH

FADH

+

Succinato

Avaliação da atividade antiproliferativa em 
células tumorais 

Formazam 
Incubação
das
células

com
as
amostras













(fator
de
diluição
2)

>
[

]
=
100
mcg/mL

0h
 24h48h
 72h

Leitura
da

absorbância

diluição
(1/2)

branco

C
‐

100
mcg/mL

0
 100
50
25
12,5
6,25
3,13
1,56

[
mcg/mL]

Va
lo
re
s

de

a
bs
or
bâ
nc
ia


Princípios do método
•  Alamar blue – convertido na forma 
reduzida pelas enzimas mitocondriais
•  Forma reduzida – detecção colorimétrica 
e fluororimétrica
•  Reagente estável, solúvel em água, 
• Minimamente tóxico – permite 
monitoramente contínuo das culturas
Azul
 Róseo

Hidroresofurin

Incolor


 
Redução
do
AB
reduzido
em
um
produto
não
fluorescente


 
Alamar
Blue
fluoresce
dentro
da
célula


ALAMAR
BLUE
é
reduzido
em
resposta
a
uma
‘redução
química’
do
meio

devido
ao
crescimento
celular
ou
por
ação
de
enzimas
mitocondriais.

 
Removeram
“meio
reduzido”
(cultura
de
24‐48h)
>>>
+
AB/24h












































































>>>
AB
estável
e
não
produziu
fluorescência

 
Meio
com
células
mostrou
altos
valores
de
fluorescência
(~47RFU)

 
Fluorescência
própria
das
células
~
5RFU

Presença
de
células
é
essencial
para
redução
do
AB

 
Alamar
Blue
fluoresce
dentro
da
célula


‐ 
Fluorescência
primária
no
citoplasma

Assim...
AB
captado
>>
Reduzido
no

citoplasma
>>
Excretado
para
o
meio

Citoplasma
com
fluorescência
constante


Pontos
brilhantes
(mitocôndrias???)


Núcleos
fluorescentes


RESAZURINA

RESOFURINA

HIDRORESOFURINA

Çélulas
viáveis

Sinal
fraco

Células
mortas

Alto
sinal
de
fluorescência


ALAMAR
BLUE
depende
do
“status”
de
oxi‐redução


Presença
de
células
>>>
Redução
do
meio
ou
do
AB



Fluorescência
encontrada
no
núcleo
e
citoplasma


Diaforases:
Resazurina
>>>>>>>>>>>
Resofurina


Células
de
mamíferos,
bactérias
(mitocôndrias
ou
citoplasma)

PRECAUÇÕES
IMPORTANTES:

‐ 
Observar
reatividade
cruzada
do
AB
com
compostos
testados

‐ 
Otimizar
culturas
celulares
>>>
Evitar
redução
excessiva
do
AB

VANTAGENS:

‐ 
Melhor
para
determinar
pontos
específicos
de
viabilidade
(CI50)

‐ 
Menos
laborioso

‐ 
Mais
barato
que
a
maioria
dos
outros
testes
por
HTS



















5g
de
resazurina
‐
400L
de
solução




















Conc.
final
de
10%
no
meio
de
cultura

Contagem

Incubação
com
as

amostras
Alamar
Blue


Absorbância
em
570nm

e
595nm

Cultura
de
células

Teste de citotoxicidade in vitro 
Ensaio do alamar blue 
Células
plaqueadas
e
drogas
diluídas

usando
o
HTS
(High
throughput
screening)


 
LOE


Resultados
SULFORODAMINA B

Descrito por Skehan et al., 1990. New colorimetric 
cytotoxicity assay for anticancer-drug screening. J. 
Natl. Cancer Inst. 82(13): 1107-1112.
Princípio do método
•  Corante róseo carregado negativamente 
(aminoxantina) tomado por aminoácidos básicos
•   no. de células -  tomada do corante
•  Método sensível e rápido – utiliza menos células
•  Permite descriminar atividade citostática de 
citocida
Método
10% TCA 
0,4% SRB 
1% AA 
Absorbância 
Placa TimeZero 
tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br 
tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br 
tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br 
tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br 
tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br 
tz tz tz b r tz tz tz br tz tz tz br 
tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br 
tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br 
Cell 1 Cell 2 Cell 2 
tz – TimeZero br – Branco 
Placa Test/Drug (uma para cada cell) 
t t t c t t t c t t t 
t t t c t t t c t t t 
t t t c t t t c t t t 
t t t c t t t c t t t 
t t t c t t t c t t t 
t t t c t t t c t t t 
t t t s t t t s t t t ds 
t t t s t t t s t t t ds 
Test 1 Test 2 Drug 
D – Drug t – Test c – Control 
S – Standard ds – Drug - St andard. 
Resultados
Controle

Controle‐positivo

Placa
tempo
zero

Atividade
citostática

0
a
100%

Atividade
citocida

0
a
‐100%

GI50

Alguns trabalhos 
comparativos…
Objetivos
•  Comparar a performance do Alamar blue e 
do MTT como teste de citoxicidade
•  117 compostos testados em HepG2
Resultados
Resultados
Conclusões
•  Os ensaios são comparáveis
•  Ambos são baseados em transformações 
enzimáticos – falsos positivos ou negativos
•  Importância da observação morfológica 
para confirmação da citotoxicidade
Alguns trabalhos 
comparativos…
Objetivos
•  Comparação SRB e MTT
•  2 linhagens HT29 (cancer coloretal) e 
11B (carcinoma de células 
esquamosas)
•  6 substâncias com # mecanismos
•  
Resultados
Conclusões
•  SRB – melhor linearidade
•  Resultados comparáveis
•  SRB – placas podem ser guardadas por 
várias semanas
Até já…