Apostila-Biologia-Molecular

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Núcleo de Aprimoramento Científico 
 
Prof. Dr. Lauro Thiago Turaça 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
APOSTILA BIOLOGIA 
MOLECULAR 
 
 
 
 
 
2017 
 Integração entre os conceitos práticos e 
teóricos para um trabalho em bancada 
 
Resumo 
 
 
Essa apostila foi elaborada com informações que serão úteis durante os seguintes 
cursos do NAC: Fundamentos da Biologia Molecular e Técnicas em Biologia 
Molecular I, II e III. Nela estão informações fundamentais da biologia molecular 
para aplicação da prática do dia a dia laboratorial. Utilize-a sem moderação! 
Bons estudos! 
 
 
 
Ibstruç 
 
 
 
 
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INFORMAÇÕES 
Para mais informações clique sobre as palavras GRIFADAS OU DESTACADAS em azul. 
Através delas o NAC indica alguns links externos, em que você encontrará artigos científicos, 
informações adicionais, aulas, curiosidades, entre outros. Além disso, faça a leitura e assista 
as videoaulas da plataforma do NAC 
 
 
 
Módulo 1 
Introdução a Biologia Molecular 
 
 
DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR 
 
O Dogma Central da Biologia Molecular foi postulado por Francis 
Crick em 1958. Esse modelo mostra que uma proteína pode ser formada 
a partir de um fragmento de DNA (que veremos mais para frente, os 
denominados genes). Dessa forma, Crick mostrou com o ocorre o fluxo de 
informações do código genético. Segundo esse dogma, o fluxo da 
informação genética segue o seguinte sentido: DNA → RNA → 
PROTEÍNAS. Além disso, sabemos também que o contrário, ou seja, o 
fluxo da informação proteína → DNA não é possível. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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A REPLICAÇÃO - DUPLICAÇÃO 
 
A molécula de DNA passa por um processo de duplicação. Esse 
processo é semi-conservativo, pois a dupla fita de DNA precisa se 
separar para ser duplicada, mas as novas moléculas criadas conterão 
uma das fitas do DNA inicial, ou seja: cada DNA criado terá uma fita 
nova e outra antiga (do DNA original), sendo, portanto, um processo 
semi-conservativo (o DNA novo conserva uma das duas fitas do DNA 
original). 
A replicação do DNA se inicia com a quebra das ligações de 
hidrogênio que une as bases nitrogenadas do DNA. Nesse momento, 
outros nucleotídeos aproximam-se de cada fita-molde e inicia o 
pareamento entre A-T e G-C, resultando em duas novas moléculas de 
DNA, que são idênticas à molécula inicial. É desse modo que o DNA é 
duplicado (replicado). 
Há inúmeras enzimas que participam do processo, como a DNA 
polimerase (que promove a ligação dos nucleotídeos), a 
topoisomerase (que tem função de quebrar ligações do DNA e também 
restaurá-las) e a DNA ligase, que liga certos fragmentos de DNA 
 
 
 
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(chamados fragmentos de Okasaki) ao longo da replicação (Para mais 
informações veja o conceito teórico em Fundamentos da Biologia 
Molecular I). 
 
A TRANSCRIÇÃO 
 
A transcrição ocorre quando um RNA se forma a partir do DNA. 
A enzima responsável pela transcrição chama-se RNA Polimerase, que a 
partir de uma das fitas de DNA consegue elaborar a fita de RNA. 
Diferentemente do DNA (que é uma estrutura em forma de fita dupla), o 
RNA tem apenas uma única fita. 
 
A TRADUÇÃO (SÍNTESE DE PROTEÍNAS) 
 
Para entendermos a tradução, nós precisamos saber primeiro 
quais são os tipos de RNA: 
 
1. RNA de transferência ou Trna 
2. RNA mensageiro ou mRNA 
3. RNA ribossômico ou rRNA 
 
O RNA TRANSPORTADOR 
 
É a menor molécula das três e sua função é a de carrear e 
combinar os aminoácidos que constituirão as novas proteínas. Eles se 
combinam com os aminoácidos e reconhecem as bases presentes no RNA 
mensageiro, que deverão ser pareadas com estes. As sequências 
reconhecidas pelo tRNA são chamadas códons, e são grupos de três 
 
 
 
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bases nitrogenadas. As sequências que pareiam com os códons são 
chamadas anticódons. Cada trinca ou códon corresponde a um 
aminoácido, como vimos na vídeo aula anterior. 
 
 
 
O RNA mensageiro 
 
Tem a função de transcrever a informação contida em um 
segmento de DNA. Seu tamanho e peso variam de acordo com o tamanho 
da molécula proteica final. O mRNA é composto por duas extremidades: 
a cauda Poli A e a cauda cap. Seu percurso é sair do núcleo já 
portando as informações necessárias à síntese e dirigir-se ao citoplasma. 
 
 
 
By MRNA_structure_fr.svg: *MRNA_structure.svg: Daylite derivative work: Fdardel (talk) derivative work: Nossedotti 
(MRNA_structure_fr.svg) [Public domain], via Wikimedia Commons 
 
 
 
 
 
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O RNA ribossômico 
 
Este tipo corresponde a cerca de 80% dos tipos de RNA e ele se 
encontra unido a proteínas, formando os ribossomos. Estes últimos, 
quando ligados ao RNA mensageiro são chamados 
de polirribossomos, onde ocorrerá a síntese proteica. 
 
O processo de fabricação de proteínas ("tradução", ou "síntese 
de proteínas", ou então "síntese proteica") ocorre no citoplasma após 
a saída do mRNA do núcleo, que se dirige aos rRNAs. Os ribossomos do 
rRNA terão a função de traduzir em proteínas a mensagem do DNA 
carreada pelo tRNA e transcrita pelo mRNA inicialmente. 
 
 
Por LadyofHats Translation: Nossedotti (Anderson Brito) 
(File:Ribosome_mRNA_translation_en.svg) [Public domain], undefined 
 
 
 
 
 
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Passos da tradução: 
 
1) Saída do mRNA do núcleo portando determinado número de 
códons (aminoácidos) e dirigindo-se ao citoplasma; 
 
2) Já no citoplasma, um ribossomo se liga ao mRNA, num códon 
inicial (há um códon específico que indica o início da leitura). 
Logo chegam tRNAs portando determinados anticódons 
(aminoácidos), que se ligam também ao ribossomo e pareiam 
suas trincas de bases com o mRNA; 
 
3) Ocorre, então, a primeira ligação entre os aminoácidos 
presentes no tRNA e no mRNA (é a chamada ligação 
peptídica). Assim que ela ocorre, o ribossomo se desloca ao 
longo do mRNA e outro tRNA liga-se ao mRNA. Assim segue a 
tradução, com o ribossomo se deslocando a medida em que 
chegam outros aminoácidos e até que surja um códon de 
parada, que indica o fim da tradução; 
 
4) Quando o códon de parada aparece, o tRNA e o ribossomo se 
desligam do primeiro peptídeo formado, que ficará livre no 
citoplasma. Esse peptídeo será usado para inúmeras funções 
da célula e nada impede, também, que outros ribossomos 
surjam recomeçando a síntese de um peptídeo maior, até 
formar uma proteína. 
 
Obs.: Costuma-se chamar peptídeo as moléculas formadas por até 100 
 
 
 
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aminoácidos e apenas quando ultrapassa esse número, é que chamam a molécula de 
proteína. Alguns autores, porém, podem denominar proteínas algumas moléculas com 
menos de 100 aminoácidos. 
 
 
 
Moreira, C. (2010), WikiCiências, 1(9):0093 
 
 
 
 
 
Módulo 2 
Noções básicas de gene 
 
 No módulo 2 você verá os seguintes conceitos que são 
fundamentais para o entendimento das denominações que envolvem as 
propriedades dos genes.Técnicas em Biologia Molecular – Nível 1 
 
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• Exons 
• Introns 
• Splicing Alternativo 
• Promotores, Enhancers e Silenciadores 
• Direções das transcrições 
• Conservação 
 
 
Orientação de gene e transcrição 
 
Por convenção, a orientação do gene é determinada pela cadeia 
de codificação. Assim, o início de um gene é chamado de 
extremidade 5' e o fim de um gene é chamado de 3'. Note na figura a 
seguir que na mesma região existem dois genes que são transcritos 
em sentidos opostos: o gene WRAP53 para a direita e o gene P53 para 
a esquerda. 
 
 
 
 
O que são exons? 
 
 
 
 
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Os exons são partes do DNA que são convertidas em RNA 
mensageiro maduro (mRNA). O processo pelo qual o DNA é usado como 
um modelo para criar mRNA é chamado de transcrição. Este mRNA então 
sofre um processo adicional chamado tradução em que o mRNA é usado 
para sintetizar proteínas, através de outro tipo de molécula chamada 
RNA de transferência (tRNA). 
 
O que são introns? 
 
Introns são partes de genes que não codificam diretamente para 
proteínas. 
 
Onde estão encontrados introns? 
 
Introns são comumente encontrados em eucariotas multicelulares, 
como os seres humanos. Eles são menos comuns em eucariotas unicelulares, 
como leveduras, e ainda mais raras em bactérias. 
 
Como os íntrons são removidos? 
 
Os introns estão presentes na transcrição inicial do RNA, conhecida 
como pré-mRNA. Eles precisam ser removidos para que o mRNA possa 
direcionar a produção de proteínas. O pré-mRNA, portanto, sofre um 
processo, conhecido como splicing, para criar mRNA maduro. É necessário 
que os introns sejam removidos precisamente, caso contrário, pode 
resultar em uma proteína defeituosa. 
 
 
 
 
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Uma ótima maneira de lembrar isso é fazer uma regra de prefixo 
das palavras: 
 
- INtron – INtervenientes (ou seja, sequência que intervém ou deve 
ser retirada da sequência do RNA mensageiro). 
- EXon - sequências EXpressas (codificam e permitem a Expressão 
de proteinas). 
 
Splicing de RNA 
 
O processamento de RNA ocorre em locais de emenda especiais. 
Estes tendem a começar com o dinucleotideo GU na extremidade 5' 
e AG na extremidade final 3'. O processo é realizado por pequenas 
ribonucleoproteínas nucleares (snRNPs). Eles se ligam às extremidades 5 
'e 3' do intron e fazem com que ele forme um loop. O intron é então 
removido da sequência e os dois exons restantes estão ligados entre si. 
 
 
By Qef [Public domain], via Wikimedia Commons 
 
Splicing alternativo 
 
O splicing alternativo refere-se à forma como diferentes 
combinações de exons podem ser unidas. Essa ideia foi apresentada 
 
 
 
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pela primeira vez por Walter Gilbert. Ele propôs que as diferentes 
permutações de exons pudessem produzir diferentes isoformas de 
proteínas. Essas, por sua vez, teriam diferentes atividades químicas e 
biológicas. Observe na imagem a seguir três proteinas diferentes sendo 
formadas pelo mesmo gene. 
 
 
 
 National Human Genome Research Institute 
 
Curiosidades: 
Estudos indicam uma média de 9 exons e 8 introns por gene em 
seres humanos. 
Estudos indicam que o número de introns que os genes de um 
organismo contém é positivamente relacionado à sua complexidade. 
De 30 a 60% dos genes humanos são submetidos a splicing 
alternativo. Isso indica que muitas doenças genéticas estão ligadas a 
alterações genéticas que causam erros de splicing que por sua vez 
causam proteínas defeituosas. 
 
 
 
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Um exemplo de um gene humano que sofre de splicing 
alternativo é o da fibronectina. Mais de 20 diferentes isoformas de 
fibronectina foram descobertas. Todos estes foram produzidos a partir 
de diferentes combinações de exons do gene da fibronectina. 
 
 
 
Promotores 
 
Um promotor é uma região reguladora do DNA localizado 
geralmente na região 5' de um gene, fornecendo um ponto de controle 
para transcrição de genes reguladora. O promotor contém sequências 
de DNA específicas que são reconhecidas por proteínas conhecidas como 
fatores de transcrição. Estes fatores se ligam às sequências do promotor, 
recrutando a RNA polimerase para realizar a transcrição. 
 
Promotores procarióticos 
 
Nos procariotos, o promotor consiste em duas sequências curtas a 
-10 e a -35, ou seja, localizadas a 10 e 35 bases de distância do início 
da transcrição de um gene. 
A sequência em -10 é chamada de caixa Pribnow, ou o elemento 
-10, e geralmente consiste nos seis nucleotídeos TATAAT. A caixa Pribnow 
é absolutamente essencial para começar a transcrição em procariotos. 
A outra sequência em -35 pares de base antes do início da 
transcrição geralmente consiste nos seis nucleotídeos TTGACA. Sua 
presença permite uma taxa de transcrição muito alta. 
 
 
 
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Promotores eucarióticos 
 
Os promotores eucarióticos são muito diversos e são difíceis de se 
caracterizar. Eles geralmente se encontram antes de um gene e podem 
ter elementos regulatórios de várias kilobases (kilo = mil) antes do local 
de início da transcrição. 
Muitos promotores eucarióticos, contêm uma caixa TATA 
(sequência TATAAA), que se liga a uma proteína de ligação TATA e que 
por sua vez auxilia na formação do complexo transcricional da RNA 
polimerase. 
 
 
Enhancers 
 
Em alguns genes eucarióticos, existem regiões que ajudam a 
aumentar a taxa de transcrição. Essas regiões, chamadas 
deintensificadores ou enhancers, não estão necessariamente próximos de 
um gene. Eles podem estar localizados dentro da região de codificação, 
a montante (antes) ou a jusante (depois) de um gene, ou ou até mesmo 
estar a milhares de nucleótidos de distância. 
Veja um exemplo na imagem a seguir que o enhancer, constituído 
por pequenas sequências de DNA chamadas elementos de controle 
distal, interage com proteínas mediadoras e fatores de transcrição. 
 Quando uma proteína de aderência de DNA se liga ao Enhancers, 
a forma do DNA muda, o que permite interações entre 
osativadores e Fatores de transcrição. 
 
 
 
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Na figura ao lado observe como o enhancer permite o 
dobramento da fita de DNA e agrupa a maquinaria de transcrição, 
acentuando a transcrição: 
 
 
 
Clique no link e veja ao estudo de alguns enhancers neste artigo 
da revista Nature: Transcriptional enhancers: from properties to genome-
wide predictions. Aqui você pode visualizar alguns enhancers e suas 
disposições na fita de DNA. 
 
 
 
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Silenciadores 
 
Os silenciadores são sequências de DNA podem ser encontrados 
a montante (no inicio), a jusante (no fim), ou dentro do gene de interesse. 
Quando os repressores se ligam a silenciadores (ver a seguir), eles atuam 
de forma semelhante aos potenciadores e se inclinam para evitar a 
interação da RNA polimerase com os promotores. Isso silencia o gene e, 
portanto, o gene não será expresso na célula. 
 
Repressores 
 
Na genética molecular, um repressoré uma proteína que ao se 
ligar a silenciadores associados a determinado gene inibe sua 
expressão. Um repressor de ligação ao DNA bloqueia a ligação da RNA 
polimerase ao promotor, evitando assim a transcrição dos genes . Um 
repressor ainda pode se ligar a um RNA evitando a tradução do mRNA 
para a proteína. Esse bloqueio de expressão é chamado de repressão. 
 
Veja na figura a seguir a disposição desses elementos em um 
gene. Note que em ambas as regiões 5' ou 3' observamos a presença de 
alguns elementos como os Enhancer e silenciadores. 
 
 
 
 
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Veja abaixo uma Distribuição de algumas regiões importantes 
dentro ou próximas de um gene (uma perspectiva) 
 
 
Curiosidades 
 
Em um estudo recente utilizou um novo oligonucleótido anti-
sense (pequena sequência de DNA que está no sentido contrário de 
uma transcrição) com funções sobre um silenciador. Ela por sua vez 
inibiu a produção uma de proteína mutante que causa uma doença 
conhecida como Huntington e provou ser eficaz e seguro ao tratar 
animais. O primeiro teste da droga em pessoas com a doença está em 
andamento. Os estudos estão sendo coordenados pelo cientista Blair 
R. Leavitt, MD , da Universidade da Colúmbia Britânica. 
 
 
 
 
 
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Módulo 3 
Rastreando genes (plataforma Ensembl) 
 
Na videoaula a seguir veremos uma introdução a uma das 
plataformas de biologia molecular disponíveis na internet. Utilizaremos 
o banco de dados do site ensembl. Com base no que vimos nos módulos 
anteriores vamos rastrear alguns genes nesta plataforma e identificar 
algumas características apresentadas em cada um. Existem muitas 
plataformas online disponíveis atualmente, sendo algumas mais 
específicas e outras mais gerais. A plataforma ensembl é de grande 
utilidade quando precisamos realizar algumas tarefas básicas in silico, 
isto é, de forma computacional, como: 
a. Descobrir a sequência de um gene 
b. Identificar as anotações realizadas por pesquisadores 
em determinado gene 
c. Desenhar um primer 
d. Localizar alterações já descritas em determinado gene 
 
Assista a seguir uma prévia da plataforma na videoaula. Todas 
as ferramentas computacionais são abordadas no curso de Manipulação 
Molecular em Softwares - nível avançado 
 
Após assistir acesse o link a seguir e realize os mesmos 
procedimentos para alguns genes diferentes. Observe e explore todas 
as características de cada gene. Note que para cada um observamos 
regiões e características diferentes. Utilize códigos de genes que você já 
está familiarizado. Como opção disponibilizamos alguns códigos de 
 
 
 
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genes humanos para você utilizar em seus estudos caso não possua: 
 
 
 
 
Módulo 4 
O que são primers 
 
 
No módulo 4 veremos um elemento, conhecido como primer, que é 
fundamental para algumas técnicas em biologia molecular como a PCR 
e o sequenciamento de DNA. 
Para isso a videoaula foi divida com as duas informações básicas 
de: 
 
a. Funções dos primers 
b. Primers e suas características 
 
Como vimos na videoaula, primers ou iniciadores são segmentos 
 
 
 
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ou oligonucleotídeos de ácidos nucléicos necessários à iniciação da 
replicação do DNA. Um iniciador é uma cadeia curta de RNA ou DNA 
(geralmente cerca de 18-22 bases) que serve como ponto de partida 
para a síntese de DNA. É necessário para a replicação do DNA porque 
as enzimas que catalisam este processo, as polimerases de DNA, só 
podem adicionar novos nucleótidos a uma cadeia de DNA existente, que 
no caso, são os primers. A polimerase realiza a replicação no sentido 5' 
--> 3'. 
Muitas técnicas de laboratório in vitro utilizam primers de DNA 
como iniciadores de reações como sequenciamento de DNA e a reação 
em cadeia da polimerase -PCR). Em experimentos, muitas vezes é 
importante usar o primer Sense e antisense com uma temperaturas de 
melting (ou seja, temperatura quando o primer se liga ao DNA) próximas. 
 Veja a seguir que os primers possuem assim como o DNA uma 
orientação 5' -> 3' que indica o sentido da transcrição: 
 
 
By Zephyris (Own work) [CC BY-SA 3.0 
 
 
 
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Em PCR , os iniciadores são utilizados para determinar o fragmento de 
DNA a ser amplificado pelo processo. A extensão de um iniciador pela 
polimerase leva a um aumento exponencial no segmento alvo. 
Vale ressaltar que os primers nem sempre são para síntese de DNA, 
mas podem também serem usados por polimerases virais, por exemplo, 
influenza, para síntese de RNA. 
 
Módulo 5 
PCR convencional e PCR em tempo Real 
 
Após revermos alguns conceitos teóricos vamos abordar algumas 
técnicas que fazem parte da rotina laboratorial no campo da Biologia 
Molecular. Para isso iniciaremos através da videoaula os tópicos a seguir 
que se basearão na Reação em Cadeia da Polimerase -PCR: 
 
 
PCR convencional 
 
• Fundamentos da PCR convencional 
• Componentes da reação 
• Fundamentos da amplificação 
• Temperaturas ótimas 
• Platô 
 
PCR real time 
 
 
 
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(tópico abordado de maneira aprofundada no curso nível 2) 
 
• Fundamentos do PCR real time 
• Exemplos de amplificação 
• Controles negativos 
• Aplicação do PCR real time na descoberta do sexo fetal 
 
 
Módulo 6 
Transcrição reversa in vitro 
 
A transcrição reversa in vitro é uma reação que envolve uma 
ampla família de enzimas chamadas transcriptases reversas que 
desempenham um papel único no fluxo de informações genéticas. Desde 
a sua descoberta, os pesquisadores usaram essas enzimas como 
ferramentas fundamentais em uma ampla gama de aplicações de 
biologia molecular. 
O dogma central original da biologia molecular sustentou que o 
DNA foi transcrito para o RNA, que por sua vez foi traduzido em 
proteína. No entanto, este conceito foi desafiado na década de 1970, 
quando duas equipes científicas, uma liderada por Howard Temin na 
Universidade de Wisconsin e outra liderada por David Baltimore no MIT, 
identificaram de forma independente novas enzimas associadas à 
replicação de vírus de RNA chamados retrovírus. Essas enzimas convertem 
o genoma de RNA viral em uma molécula de DNA complementar (cDNA), 
que então é capaz de se integrar no genoma do hospedeiro. Estas são 
polimerases de DNA dependentes de RNA e são chamadas de 
 
 
 
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transcriptase reversa porque, em contraste com o fluxo de DNA-RNA do 
dogma central, eles transcrevem modelos de RNA para moléculas de 
cDNA. Para um melhor entendimento de como a transcrição reversa 
ocorre assista a vídeo aula a seguir e acesse os links desse módulo para 
estudos complementares. Na vídeo aula a seguir você verá os seguintes 
tópicos: 
 
Fundamentos da transcrição reversa 
Aplicações 
Primers oligo dT e Random primer 
 
No vídeo a seguir observe uma estrutura em 3D da transcriptase 
reversa e seus subdomínios: 
link 
 
No vídeo a seguir observe como age a enzima transcriptase 
reversa. É utilizado como modelo a ação do AZT que é similar a uma 
Timina porémquando é adicionado a reação da transcrição reversa a 
reação pára e a propagação do HIV pára no organismo. AZT é um dos 
tratamentos para portadores do vírus da AIDS porém note que se o 
portador possuir um vírus com a transcriptase reversa resistente ao AZT 
a transcrição reversa não é interrompida e a propagação do HVI 
continua: 
Link 
 
 
 
 
 
 
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Exemplo de Protocolo 
 
Veja a seguir um exemplo de protocolo padrão para realizar uma 
transcrição reversa. Note que o template nesse caso é o RNA ao invés de 
DNA como na PCR. No caso, M-MuLV RT é a transcriptase reversa usada 
nesse caso e os Inhibidor de RNase auxilia na não degradação do RNA 
ao inibir RNAses. 
 
Protocolo 
 
1. Descongele os componentes no gelo e misture, invertendo várias vezes. 
2. Misture os seguintes componentes e incube a 42 ° C ** durante 1 hora. 
 
COMPONENTE VOLUME 
Template RNA Até 1 μg * 
Random primer ou oligo dT 
(60uM) 
2 μl 
Tampão 10X 2 μl 
M-MuLV RT (200 U / μl) 1 μl 
DNTP 10 mM 1 μl 
Inhibidor de RNase (40 
U/μl) 
0,2 μl 
H2O livre de nucleases Para um 
volume total de 20 μl 
* 1 ng-1 μg de RNA total 
** A Transcriptase reversa M-MuLV pode ser utilizada de 37 ° a 42 ° C. 
 
 
 
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3 - Inative a enzima a 65 ° C durante 20 minutos. Para aplicação de PCR 
após a transcrição reversa, o volume de produto de cDNA não deve 
exceder 1/10 do volume de reação de PCR. 
 
Veja uma lista de protocolos diferentes que podem ser 
realizados através do link a seguir: 
Link 
 
VISÃO GERAL DAS APLICAÇÕES 
 
Após a descoberta da ação da Transcriptase reversa diversas 
aplicações começaram a ser utilizadas nos laboratórios de biologia 
molecular. Veja a seguir as diversas aplicações que podem ser usadas a 
transcrição reversa: 
 
Reação em cadeia da polimerase após a transcrição reversa (RT-PCR) 
 
Na RT-PCR, uma população de RNA é convertida em cDNA por 
transcrição reversa (RT) e, em seguida, o cDNA é amplificado pela 
reação em cadeia da polimerase (PCR). O passo de amplificação de 
cDNA oferece oportunidades para estudar mais as espécies originais de 
RNA, mesmo quando elas são limitadas ou expressas em baixa 
abundância. As aplicações comuns de RT-PCR incluem a detecção de 
genes expressos, o exame de variantes de transcrição e a geração de 
modelos de cDNA para clonagem e sequenciamento. 
 
 
 
 
 
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RT-PCR quantitativa (RT-qPCR) 
 
Uma das aplicações mais comuns da RT-PCR quantitativa (RT-qPCR) é 
a análise quantitativa dos níveis de mRNA ao longo do tempo, através de 
células e tecidos, ou após um evento (por exemplo, tratamento 
medicamentoso). Devido a uma maior sensibilidade do que RT-PCR, RT-qPCR 
também é amplamente utilizado para examinar a presença de retrovírus 
(vírus RNA) em amostras de pesquisa. Semelhante ao fluxo de trabalho de 
RT-PCR, o RNA é primeiro convertido em cDNA, que é amplificado pela PCR. 
A principal diferença, no entanto, é que os níveis de cDNA amplificado são 
medidos por fluorescência em tempo real durante a fase exponencial da 
amplificação (assunto aprofundado no curso Técnicas em Biologia Molecular 
II). O nível de amplificação é usado como base para quantificar os alvos 
originais dentro da população de RNA. 
 
Clonagem de cDNA e construção de biblioteca 
 
Uma das primeiras aplicações da transcriptase reversa em biologia 
molecular foi a construção de bibliotecas de cDNA. Uma biblioteca de cDNA 
consiste em clones de cDNA que representam as sequências transcritas dentro 
de uma amostra específica. Portanto, uma biblioteca fornece informações 
sobre a expressão temporal e espacial de genes para um determinado tipo 
de célula, órgão ou estágio de desenvolvimento, por exemplo. 
 
Ampliação rápida de extremidades de cDNA (RACE) 
 
A amplificação rápida de extremidades de cDNA (RACE) é um método 
 
 
 
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baseado em PCR para determinar sequências desconhecidas nas 
extremidades 5 'e 3' de um determinado cDNA. Estes métodos são comumente 
conhecidos como 5 'RACE e 3' RACE, respectivamente. Os objetivos 
experimentais da RACE incluem identificação de regiões não traduzidas de 5 
'e 3', pesquisa de locais de início de transcrição, caracterização de regiões 
promotoras e determinação de sequências completas de cDNA. 
 
Microarrays de expressão de genes 
 
Os microarrays consistem em milhares de câmaras, conhecidas como 
"características" ou "manchas", em bolachas de vidro ou de silício. Cada 
característica contém, imobilizado na sua superfície, cópias idênticas de uma 
seqüência de DNA de cadeia simples chamada "sonda", que representa um 
gene. As sondas se hibridam com alvos de cDNA marcados com fluorescência 
e que são aplicados ao microarray, permitindo uma comparação simultânea 
da expressão gênica entre duas amostras. 
 
As sondas de microarray são geradas a partir de sequências conhecidas do 
genoma ou cDNA de um organismo. Por exemplo, a PCR pode ser utilizada 
para fazer cópias de cada gene conhecido, cujos produtos são então 
desnaturados em DNA de cadeia simples e marcados em um chip como 
sondas. Alternativamente, os oligonucleótidos de 20-60 nucleotídeos podem 
ser sintetizados diretamente em um chip como sondas de microarray. 
 
Seqüenciamento de RNA (RNA-Seq) 
 
O seqüenciamento de RNA, ou RNA-Seq, é comumente realizado para 
 
 
 
Técnicas em Biologia Molecular – Nível 1 
 
Prof. Dr. Lauro Thiago Turaça 
 
obter informações sobre RNAs transcritos do genoma e sua regulamentação. 
Com o advento da sequenciação da próxima geração (NGS), o RNA-Seq 
tornou-se uma abordagem de alto rendimento para a análise de: 
Transcriptoma inteiro (todas as fitas que foram transcritas de 
determinado organismo. 
 
Determinação da expressão gênica. 
 
Descoberta de Variantes de junção e transcrições de fusão e detecção 
de genes de baixa abundância. 
 
Módulo 7 
Sequenciamento de DNA 
 
O sequenciamento de DNA é o processo de leitura dos nucleótidos 
presentes nas moléculas de DNA ou RNA. Existem dois tipos de 
tecnologias de sequenciamento que são usadas atualmente: 
sequenciamento de Sanger e sequenciamento de próxima geração . 
Cada uma dessas tecnologias possui utilidades diferentes no ambiente 
de análise genética de hoje. 
Sanger é o método desenvolvido pelo bioquímico britânico Dr. 
Frederick Sanger na década de 1970. Este método envolve a cópia de 
DNA de cadeia simples com bases quimicamente alteradas chamadas 
didesoxinucleótidos que, quando incorporadas na extremidade 3 'da 
cadeia de crescimento, terminam a cadeia de forma seletiva em A, C, G 
ou T. As cadeias terminadas são então resolvidas por capilar 
Eletroforese. 
 
 
 
Técnicas em Biologia Molecular – Nível 1 
 
Prof. Dr. Lauro Thiago Turaça 
 
A sequenciação de próxima geração (NGS) utiliza sequenciações 
massivamente paralelas para gerar milhares de megabases de 
informações de sequência por dia. As técnicas de próxima geração são 
baseadas em um princípio de "sequenciamento por síntese", onde os 
nucleotídeos incorporados a uma cadeia de DNA fornecem um sinal único. 
Na maioria das tecnologias NGS, o sinal exclusivo é uma molécula 
fluorescente. No entanto, com a tecnologia de sequenciação Ion Torrent 
™ de próxima geração , osinal está na forma de uma mudança de pH, 
eliminando a necessidade de detecção baseada na luz. 
Nesse módulo vamos nos focar na metodologia de Sanger, para 
isso assista a video aula a seguir: 
 
A reação de sequenciamento é um método simples em que 
rodadas sucessivas de desnaturação, anelamento e extensão em um 
termociclador (assim como em um PCR) resultam em uma amplificação 
linear (já que não possui somente um primer por well) de produtos de 
extensão de DNA. Os produtos são então injetados em um capilar para 
separação eletroforética. 
 
Sequenciamento com nucleotídeos marcados 
 
A sequenciamento de DNA fluorescente é realizado com uma 
marcação diferente a cada um dos quatro ddNTPs. Os reagentes 
necessários para uma reação de sequenciamento são: DNA, primer, 
tampão, os quatro dNTPs, os quatro ddNTPs marcados fluorescentemente 
e a Polimerase. Os fragmentos marcados com fluorescência são gerados 
pela incorporação dos ddNTP marcados com corante na sequência. 
 
 
 
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Todos os fragmentos terminados (aqueles que terminam com um ddNTP), 
portanto, contêm um corante na extremidade 3'. Os fragmentos são 
então separados por eletroforese capilar. 
 
Eletroforese capilar 
 
Durante a eletroforese capilar, os produtos da reação de 
sequenciamento do ciclo são injetados eletroquimicamente em capilares 
cheios de polímero. A alta tensão é aplicada para que os fragmentos de 
DNA carregados negativamente se movam através do polímero nos 
capilares em direção ao eletrodo positivo. A eletroforese celular pode 
separar as moléculas de DNA que diferem em peso molecular por 
apenas um nucleotídeo. 
Pouco antes de alcançar o eletrodo positivo, os fragmentos de 
DNA marcados de forma fluorescente, separados por tamanho, se 
movem através do caminho de um raio laser. O raio laser faz com que 
os corantes dos fragmentos fluoresçam. Um dispositivo de detecção 
óptica em um analisador genético detecta o sinal de fluorescência. 
 
Software 
 
O software de coleta de dados do sequenciador converte o sinal 
de fluorescência em dados digitais e registra os dados em um arquivo 
de extensão *.ab1. Como cada corante emite luz em um comprimento de 
onda diferente quando excitado pelo laser, todas as quatro cores e, 
portanto, todas as quatro bases, podem ser detectadas e distinguidas 
em uma injeção capilar.