ENSAIO DE BRADFORD

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ATIVIDADE DO DIA 23/03/2020 – AULA PRÁTICA DE BIOQUIMICA I 
TURMA B SUB. B
MÉTODO DE BRADFORD: É um dos principais métodos utilizados para determinar a concentração de proteínas em uma solução. Esse ensaio foi descrito em um artigo publicado pelo cientista norte-americano William Bradford Shockley no ano de 1976, na qual apresentava um método rápido e sensitivo para quantificação de proteínas em solução. O método se resume em um ensaio colorimétrico utilizando um reagente, no qual a variação de cor obtida na solução é avaliada por espectrofotometria. O reagente de Bradford tem como principal componente o Coomassie brilliant blue. Essa molécula quando no estado catiônico (carregado positivamente) não está estável e desse modo apresenta uma coloração avermelhada, porém quando adquire seu estado aniônico (carregado negativamente) ela se estabiliza, obtendo uma coloração azulada. Quanto mais azulado, mais proteínas apresentam. Quando o reagente de Bradford entra em contato com alguma solução proteica (extrato bruto vegetal), o Comassie atinge seu estado aniônico apresentando a coloração azulada. Para obter a concentração proteica a partir da coloração da solução se utiliza a espectrofotometria, por meio do calculo de absorbância, ou seja, calcula-se a quantidade de luz absorvida pela amostra e para isso é utilizado um aparelho chamado espectrofotômetro. Após adicionarmos o reagente de Bradford a solução proteica, colocamos o resultante no espectrofotômetro e nele será emitida uma fonte de luz composta sobre a amostra, com comprimentos de ondas a 595 nm. O feixe de luz passará pela amostra, parte dele será absorvida, devido à interação com o Comassie e as proteínas, e o restante irá transpassar a amostra. Contudo, para calcular a concentração de proteínas somente com os valores de absorbância da amostra é necessário que se tenha uma amostra referencia, comumente utiliza-se a albumina sérica bovina (BSA). Essa amostra referencia deve ter uma concentração proteica conhecida, no qual assim poderemos utilizá-la para fazer uma correlação entre o grau de concentração e o grau de absorbância e a partir disso podemos desenvolver a curva de calibração.
IMPORTÂNCIA DA CURVA PADRÃO PARA O CALCULO DA CONCENTRAÇÃO PROTEICA: Os dados obtidos no ensaio de Bradford são plotados em uma curva de regressão linear, onde o eixo X equivale à concentração de proteínas e Y representa a absorbância, gerando uma equação na qual o resultado é a concentração de proteínas. Para concluirmos o ensaio devemos substituir no eixo Y a absorbância que obtivemos no espectrofotômetro e assim o resultado da equação será a concentração proteica da nossa amostra.