DOSAGEM DE PROTEÍNAS DO LEITE PELO MÉTODO DE BIURETO - LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA - BQI 101

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Dosagem de Proteínas do Leite 
pelo Método de Biureto 
-Muitos métodos podem ser 
empregados, porém, para a 
escolha da técnica correta. 
Fatores importantes devem 
ser considerados, como: 
 -Natureza da proteína 
(enzima, solubilidade, tamanho, 
localização celular). 
 -Presença de 
interferentes (tipos de 
solventes empregados nas 
etapas iniciais). 
 -Rapidez. 
 -Sensibilidade. 
 -Eficiência. 
Ex.: principais proteínas do leite 
-> caseína, lactoglobulina, lacto 
albumina. 
Método utilizado para medir o 
quanto uma substância química 
absorve a luz, medindo a 
intensidade quando um feixe de 
luz passa através da solução da 
amostra. 
Utiliza o ESPECTROFOTÔMETRO 
-Instrumento capaz de medir e 
comparar a quantidade de luz 
(radiação eletromagnética) 
absorvida, transmitida ou 
refletida por uma determinada 
substância em solução. 
A medição é feita com base em 
dois parâmetros: 
 TRANSMITÂNCIA: é a 
razão entre dois feixes de luz, 
ou seja, é a razão entre P/P0). 
Há uma relação exponencial 
decrescente entre a 
quantidade de luz transmitida 
(Transmitância=T) e a 
concentração de analito (c). 
ABSORBÂNCIA: capac. de 
absorver radiação. Há uma 
relação linear direta entre a 
quantidade de luz absorvida 
(Absorbância=0) e a 
concentração de analito (c). 
 
 
-Estabelece uma relação direta 
entre a absorbância do analito 
em uma solução e a sua 
concentração, quando 
atravessada por uma radiação 
luminosa monocromática 
(lambda).
Onde: 
 K= Absortividade ou 
coeficiente de extinção molar 
do analito. Propriedade 
intrínseca da substância. 
 C= concentração do 
analito -> vai ser calculado com 
o auxílio da curva padrão de 
uma substância conhecida da 
mesma categoria da amostra 
(nesse caso, proteína). 
 l= espessura da 
solução (caminho óptico -> 
distância percorrida pela luz 
dentro da amostra). Valor fixo 
-> é dado pelo tamanho da 
cubeta que o aparelho 
comporta. 
É aí que se baseia a 
primeira parte da aula prática 
-> irá ser construída uma curva 
padrão. 
-O coeficiente de 
extinção molar. 
-Toda construção de reta 
possui um valor de COEFICIENTE 
DE CORRELAÇÃO (r2 -> vai 
indicar o quanto a reta teórica 
explica o resultado prático e 
varia de 0 a 1, sendo 1 
explicando 100% os pontos 
experimentais), que nos 
informa sobre a correlação 
existente entre a variável 
independente (absorbância) e a 
variável dependente 
(concentração). 
 
-A equação da reta construída 
(y=ax+b) permite-nos 
obter a relação das 
concentrações da 
amostra e as 
absorbâncias obtidas 
(lidas no espectrofotômetro). 
-Para que as proteínas do leite 
possam ser detectadas no 
espectrofotômetro, elas serão 
conjugadas com o Reagente de 
Biureto para apresentar 
coloração. 
-Método de Biureto: 
compostos contendo duas ou 
mais ligações peptídicas 
(proteínas) reagem com sais de 
cobre resultando em uma 
solução de coloração violeta. 
Forma-se um COMPLEXO DE 
COORDENAÇÃO. 
Obs.: “lactoproteínas” se 
refere às lactoalbuminas e as 
lactoglobulinas. 
Resumo: proteínas + reagente 
de Biureto = coloração. 
1) Preparar soluções padrão 
para montar a curva de 
calibração de proteína x 
absorbância (1-5g/L caseína). 
2) Preparar o branco para a 
curva de calibração (leitura de 
absorbância do solvente = 
0g/L de caseína) -> como se 
fosse tarar uma balança. 
3) Selecionar o comprimento de 
onda: 
4) Ajustar o equipamento para 
leitura e determinar a 
absorbância de cada solução 
padrão. 
5) Calcular a equação e 
projetá-la graficamente, tendo 
as Concentrações de Proteínas 
na abcissa (x) e as 
Absorbâncias (540 nm) na 
ordenada (y). 
-Após realizar a leitura das 
absorbâncias das amostras do 
leite, esta Curva de calibração 
(equação y=ax+b) será utilizada 
para calcular as concentrações 
das proteínas nas amostras de 
leite de concentrações 
desconhecidas: determinar 
A540 e converter em 
concentração de proteínas 
usando a equação. 
-Verificar se duas variáveis 
independentes estão 
associadas uma com a outra. 
-A regressão linear é utilizada 
para obter a equação da reta 
representativa dos dados 
experimentais y=ax+b, onde: 
 
 
-Para verificar se há 
dependência entre as 
variáveis, calcula-se o 
coeficiente de correlação linear 
“r” 
-Obs.: não esquecer de elevar 
ao quadrado para obter o 
coeficiente. 
ª
-Preparo das amostras de leite 
e determinação da 
concentração de proteínas em 
amostras de leite 
desconhecidas. 
-Separação entre amostra 1 e 
2: 
-Amostra 1: remover a caseína 
por precipitação isoelétrica. 
-O HCl promove a precipitação 
da caseína. Depois de 
precipitado, será feita uma 
filtragem dessa solução com a 
ajuda de um funil e chumaço de 
algodão, que é onde as 
proteínas do precipitado 
ficarão retidas. 
-Apesar de que, na amostra 2, 
mede-se a concentração de 
todas as proteínas presentes 
no leite, não se coloca o leite 
diretamente no 
espectrofotômetro sob o risco 
de perder a linearidade do 
método, isso porque a 
quantidade de proteínas no 
leite é bem grande. 
-Por esse motivo dilui-se o leite 
(1:19). 
-Separadamente, calcular a 
concentração da amostra 1 e 2 
usando os valores de 
absorbância (y = Abs540) 
obtidos pelas leituras no 
espectrofotômetro. 
-Utilizar curva-padrão gerada 
das 5 soluções-padrão: