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Aulas práticas de Microbiologia – UNIVALI 
1 
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ 
ESCOLA DE CIÊNCIAS DA SAÚDE 
Curso: BIOMEDICINA 
Disciplina: Estágio em Processamento de Amostras Biológicas 
Prof. Alexandre Bella Cruz 
 
 
1 - Laboratório de microbiologia 
 Além do conteúdo teórico, a disciplina de microbiologia tem como objetivo o aprendizado 
de técnicas, representados por uma série de operações executadas segundo normas 
padronizadas, possibilitando o conhecimento e a manipulação de micro-organismos. 
 As técnicas microbiológicas básicas e essenciais podem ser resumidas em: 
a) Observação microscópica: observação de micro-organismos em condições adequadas à 
visualização em microscópio; 
b) Cultivo artificial: multiplicação dos micro-organismos fora de seu habitat natural, utilizando 
meios de cultivo; 
c) Esterilização: eliminação das formas vivas nos meios de cultivo, utensílios e instrumentos; 
d) Prática asséptica: prevenção do contato do material em estudo, com formas microbianas 
indesejáveis. 
Os laboratórios de Microbiologia são locais especiais, capazes de promover a 
disseminação de agentes causadores de doenças infecciosas nas pessoas que neles trabalham 
ou com quem estas entram em contato. 
Qualquer micro-organismo, por mais inócuo que seja, interage com o meio e com as outras 
formas de vida que o envolvem. Devido ao fato que esta interação pode ser indesejável ou 
mesmo perigosa, há necessidade de se observar algumas regras ou normas durante as 
operações laboratoriais com micro-organismos. 
As normas e comportamentos devem ser seguidas para evitar a propagação de 
contaminações cruzadas, susceptíveis de perturbar o sucesso das experiências laboratoriais. 
 
Nível de segurança 1 e 2 
 No laboratório, o nível do risco associado ao contato dependerá do micro-organismo 
propriamente dito, seu tipo e quantidades, das formas de vida e do tipo de contato que é 
estabelecido, bem como, da duração desse contato. 
 Levando-se em conta principalmente a segurança dos laboratoristas (estudantes, técnicos 
e professores), consideram-se geralmente quatro níveis de segurança biológica, que são 
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dependentes da periculosidade para o homem ou para o ambiente onde os micro-organismos 
são manipulados. 
 Para os trabalhos que serão desenvolvidos no laboratório durante a execução das práticas, 
serão aplicados os níveis de segurança 1 e 2, adequados para ensino e treino para graduação 
universitária. Em condições normais, o nível 1 de segurança biológica, não requer mais que a 
pele do próprio operador como barreira de contenção, porque os micro-organismos utilizados 
não representam risco especial para o homem, quando manipulados de acordo com boas 
práticas laboratoriais, nem para o ambiente. Por outro lado, quando necessário, poderá ser 
empregado experimentos com micro-organismos do nível 2, havendo necessidade do emprego 
de equipamentos de proteção individual (EPI)*, como luvas e óculos de proteção para a execução 
de procedimentos que produzam borrifos (aerossóis) de micro-organismos. 
 Lembramos que um micro-organismo normalmente não associado a doenças humanas 
poderá, contudo, ser lesivo em situações particulares, como a imunodeficiência ou outras. 
 (*) Observação: EPI deverão ser providenciados pelo próprio acadêmico (jaleco, óculos 
de proteção e luvas), não são fornecidos pela Instituição. 
 
Normas para o uso do laboratório de microbiologia 
Além do risco para o estudante, técnico ou professor, associado à manipulação de micro-
organismos, as experiências que serão realizadas, provavelmente se constituem em novidade 
para boa parte dos estudantes, ressalta-se que geralmente possuem experiência laboratorial 
limitada e rotinas de boas práticas laboratoriais não estabelecidas. Por isso é importante prevenir. 
É preciso proteger a saúde do próprio estudante e de terceiros, que também poderão ser alvo 
de práticas menos adequadas. O sucesso das experiências dependerá do grau de rigor com que 
as mesmas forem executadas e dos baixos níveis de contaminações cruzadas que for possível 
manter. 
É boa prática observar, cumprir e fazer cumprir as regras, procedimentos e 
comportamentos abaixo descritos: 
Acesso: O acesso ao laboratório de microbiologia é restrito às pessoas qualificadas para 
o efeito, que incluem os estudantes apenas durante os períodos de aulas previstos, salvo em 
situações especiais, como no caso de monitoria, estudantes de graduação e pós-graduação 
envolvidos em projetos de pesquisa. 
Uniforme (jaleco): O uso de jaleco de mangas compridas, limpo e devidamente ajustado 
ao corpo é indispensável (obrigatório) nas atividades em laboratório. O jaleco protege o 
operador e o seu vestuário de eventuais acidentes. Idealmente o jaleco deverá ser usado apenas 
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no laboratório de microbiologia, sendo vestido à entrada e despido à saída. Desta forma, além 
de proteger o operador, o jaleco minimiza o transporte de micro-organismos exteriores para o 
laboratório, permitindo a manutenção de uma baixa carga contaminante e evita a propagação 
indesejável no exterior dos micro-organismos manipulados no laboratório. 
O jaleco deverá ser de mangas compridas, e preferencialmente confeccionado em tecido 
de algodão. 
O uso do jaleco 
Tradicional acessório de profissionais da saúde e pesquisadores, o jaleco branco é, para 
os que não são da área, apenas um utensílio que identifica o campo com o qual o usuário trabalha. 
Assim, muitos o vestem e admiram fora do ambiente hospitalar ou do laboratório, por ser uma 
marca que transmite respeito e agrega valor à pessoa que o usa. 
Contudo, a explicação para o uso do jaleco é mais que meramente estética. Esse 
acessório é um modo de proteção que o profissional tem para não se expor tanto aos riscos de 
contaminação e infecção que seu local de trabalho oferece. A função é semelhante à de uma 
luva, por exemplo, e, dessa maneira, o jaleco torna-se, entre outras coisas, um vetor para 
transmissão de doenças. 
Cabelos: Os cabelos compridos sempre deverão ser amarrados e não é permitido o uso 
de peças de vestuário soltas, como jalecos desabotoados, lenços de pescoço ou gravatas soltas. 
Além da movimentação excessiva de ar que provocam, a sua eventual inflamação nos bicos de 
gás poderá ter consequências desastrosas. 
Mãos: À entrada e à saída do laboratório é preciso lavar bem as mãos com água e sabão, 
para minimizar as contaminações cruzadas. Dependente do tipo de micro-organismo a manipular, 
o uso de luvas impermeáveis, máscaras ou outras proteções (EPI), poderá ser exigível. Mesmo 
quando normalmente não recomendado, o uso de luvas poderá ser necessário em situações de 
solução de continuidade na pele das mãos do laboratorista. 
Boca: É expressamente proibido comer, beber, fumar, manipular lentes de contato ou 
aplicar cosméticos durante a execução de experiências no laboratório. Usar sempre que possível, 
pipetadores mecânicos, evitando ao máximo pipetar com a boca. É aconselhável adquirir o hábito 
de manter as mãos longe da boca. 
Bancada de trabalho: O local de trabalho deverá estar sempre devidamente limpo, para 
o que se impõe proceder à desinfecção da bancada antes de iniciar os trabalhos, para não 
permitir a contaminação das próprias experiências com micro-organismos de sessões anteriores, 
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e depois das manipulações terminadas para minimizar a propagação dos micro-organismos com 
que se empregou. 
Livros e cadernos: Só é permitido levar para a bancada o material de apoio estritamente 
indispensável à execução do trabalho, como o protocolo experimental, um bloco de notas ou um 
caderno e um lápis. Todos os demais pertences do laboratorista, como pastas, casacos, entre 
outros, deverão ser acondicionados em local próprio, antes de iniciada a experimentação. 
Materiais: Todo o equipamento e materialde laboratório, utilizado durante o experimento, 
deverá ser reposto no local indicado depois de concluída a sua utilização. O material 
contaminado, como placas, tubos, lâminas, pipetas, ponteiras etc., deverão ser colocados em 
local próprio para descontaminação (frasco de vidro, ou outro material com desinfetante). 
Acidentes: Qualquer acidente deverá imediatamente reportado ao responsável pela 
sessão de trabalho (professor e/ou técnico). Líquidos ou outro material infectado, 
inadvertidamente transferido para fora dos contentores a que se destinam, deverão ser de 
imediatamente desinfectados com o apoio do responsável. 
Planejamento: Não iniciar qualquer experiência sem o conveniente planejamento. O 
conhecimento e compreensão prévios dos procedimentos experimentais, formulários para 
registro dos resultados e a efetiva disponibilidade de todos os recursos materiais necessários, 
constituem elementos importantes para o sucesso das experiências. O tempo "perdido" num 
planejamento inicial é largamente compensado pelo nível da aprendizagem conseguido e pela 
prevenção da necessidade de repetição de experiências eventualmente bloqueadas. 
 
Materiais de Laboratório de Microbiologia 
 Para a realização de ensaios microbiológicos com maior agilidade, precisão e 
consequentemente confiáveis, diversos materiais podem ser utilizados, como os apresentados 
nas figuras a seguir. 
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Figura 1 - Materiais utilizados em Laboratório de Microbiologia 
 
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Preencher com o nome e utilidade correspondente às figuras apresentadas na página seguinte: 
 
Nome do material 
 
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2 - Meios de cultura 
 
A sobrevivência e a manutenção da vida dos micro-organismos (viabilidade) depende do 
fornecimento adequado de nutrientes e condições convenientes para o seu crescimento. Quanto 
aos nutrientes, grande parte dos micro-organismos apenas necessitam de substâncias solúveis 
de baixo peso molecular, usualmente originadas pela degradação enzimática de outros 
nutrientes mais complexos. Uma solução contendo estes nutrientes é designada como meio de 
cultura. 
Em geral, os meios de cultura são líquidos, semi-sólidos ou sólidos. Um meio líquido sem 
agente solidificante é designado por caldo nutritivo. Um caldo nutritivo suplementado com um 
agente solidificante, usualmente o ágar, origina um meio sólido ou semi-sólido. O ágar é um 
extrato de algas marinhas do gênero Gelidium, que possui um carboidrato complexo contendo 
majoritariamente galactose e ácido galacturônico, praticamente sem valor nutritivo. Foi 
introduzido na microbiologia por Robert Koch, e até hoje vem sendo utilizado devido às suas 
características. 
O ágar é muito adequado como agente solidificante porque se liquefaz a 100 0C e solidifica 
a 40 0C, e devido a estas propriedades, os micro-organismos, em especial os patogênicos, 
podem ser cultivados à temperatura em torno de 37 0C sem receio de liquefação do meio 
solidificado. Um meio de cultura bem solidificado exige uma concentração de ágar entre 1,5 e 
1,8%. Concentrações inferiores a 1% resulta num meio semi-sólido. 
A grande vantagem e utilidade do meio sólido reside no fato da existência de uma 
superfície consistentemente firme (“sólida”), em que os micro-organismos podem crescer, 
adequada à utilização de técnicas especiais para o isolamento de colônias separadas. Cada 
colônia é formada por um conjunto de células resultantes da multiplicação de uma única célula e 
representa o crescimento de uma espécie microbiana única. Uma colônia bem definida e isolada 
constitui uma cultura pura. Além disso, o ágar quando ainda líquido à temperatura elevada, pode 
ser distribuído em tubos de ensaio que, depois de arrefecidos e solidificado o meio, servem para 
a cultura em profundidade, para teste da produção de gás, ou em meio inclinado para cultura em 
rampa, para teste de características ou preservação de culturas. 
No preparo de um meio de cultura é necessário conhecer as exigências nutricionais dos 
micro-organismos. São considerados componentes essenciais do meio de cultura: 
 
a) Fonte de energia — no caso de micro-organismos quimiotróficos, esta exigência é satisfeita 
pela presença de compostos orgânicos ou inorgânicos específicos a ser oxidados, como por 
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exemplo o enxofre ou o amônio. Para os fotossintetizantes, há a necessidade de luz, que deve 
ser fornecida pelo ambiente. 
 
b) Fonte de carbono — para micro-organismos heterotróficos, há a necessidade da presença de 
compostos orgânicos, enquanto que para os autotróficos é necessário CO2, que pode ser suprido 
pelo ambiente. 
 
c) Fonte de nitrogênio — proteínas, aminoácidos, nitrato, amônio ou N2. 
 
d) Fatores de crescimento — vitaminas. 
 
e) Fonte de minerais — P, K, S, Ca, Fe, Mg, Mn, Zn, Cu etc. 
 
f) Água. 
 
Alguns nutrientes, como as substâncias termolábeis (vitaminas, açúcares, aminoácidos e 
antimicrobianos), exigem cuidados especiais. Eles devem ser esterilizados por filtração, sendo 
adicionados aos meios após a autoclavagem e resfriamento acima do ponto de solidificação do 
meio. 
Para além das necessidades nutritivas, vários outros fatores ambientais precisam ser 
controlados para o sucesso da cultura dos micro-organismos, como o pH, a temperatura, o 
ambiente gasoso ou a pressão osmótica. 
 Os meios de cultura ainda podem ser Naturais — aqueles que já existem prontos na 
natureza (Ex.: leite, sangue, caldo de frutas, caldo de cana e outros) ou Artificiais — aqueles que 
são elaborados (Ex.: ágar nutriente), bem como podem apresentar composições diferentes. 
Portanto, de acordo à sua composição, podem ser classificados como: 
 
a) Sintéticos — meios que têm a composição química definida, elaborados a partir de substâncias 
puras. Ex.: meios utilizados no cultivo de quimioautotróficos como por exemplo Nitrosomonas. 
 
b) Complexos — são aqueles que não apresentam uma composição química definida, como os 
que contêm extrato de carne ou extrato de levedura, sangue, leite, ovos e outros. 
 
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Devido ao fato dos micro-organismos apresentarem diferenças intrínsecas, bem como 
quanto à exigência nutricional, ambiente etc., os meios de cultura podem ser classificados quanto 
à finalidade: 
 
a) Meios gerais ou básicos — são aqueles que permitem o crescimento de um grande número 
de espécies microbianas dentro de um grupo: ágar nutriente para bactérias e ágar Sabouraud 
ou ágar Batata Dextrose para fungos. 
 
b) Meios enriquecidos — são meios de cultivos adicionados de misturas complexas e naturais 
como leite, sangue, soro e extratos de tecidos animais ou vegetais, que permitem o crescimento 
de micro-organismos nutricionalmente mais exigentes (fastidiosos). Ex.: ágar sangue para 
isolamento e cultivo das bactérias dos gêneros Neisseria, Staphylococcus e Streptococcus. 
 
c) Meios seletivos — são aqueles que possuem uma composição ou uma ou mais condições que 
seleciona o tipo de micro-organismo que vai crescer. São muito utéis no isolamento e na 
identificação. Ex.: meio ágar Baird-Parker para Staphylococcus aureus, meio ágar SS para os 
gêneros Salmonella e Shigella. 
 
d) Meios indicadores ou diferenciais — são aqueles que destacam (indicam) determinada(s) 
característica(s) metabólica(s) do micro-organismo. São também muito utéis no isolamento e na 
identificação. Ex.: meio ágar Teague (EMB) e ágar MacConkey, para bactérias entéricas, meio 
ágar Ramback para Salmonella sp.e) Meios de enriquecimento — São aqueles que permitem o desenvolvimento diferenciado de 
micro-organismos, favorecendo o crescimento de um grupo em detrimento de outros. Caldo 
Selenito-Cistina e Caldo Tetrationato que, por exemplo, favorece o crescimento de espécies do 
gênero Salmonella. 
 
f) Meios de dosagem — são empregados na dosagem de substâncias, tais como vitaminas, 
antimicrobianos, aminoácidos e desinfetantes. 
 
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g) Meios de transporte, estocagem ou manutenção — mantêm a viabilidade dos micro-
organismos por mais tempo. Por exemplo, a presença de glicose no meio de cultivo faz com que 
o micro-organismo se multiplique mais rapidamente, exaurindo toda a fonte de energia. A 
mudança do tipo de açúcar permitirá um crescimento mais lento, e a cultura sobreviverá mais 
tempo. 
 
 A seguir, é apresentado alguns meios de cultura e seus respectivos usos. 
 
Exemplos de Meios de Cultivo e seus usos 
 
Ágar Baird-Parker 
 Para o isolamento e a diferenciação de Estafilococos em alimentos e insumos farmacêuticos. 
 Forma de ação: Este meio contém cloreto de lítio e telurito para a inibição da microbiota 
acompanhante e por outro lado o piruvato e a glicocola atuam favorecendo seletivamente o crescimento 
de Estafilococos. Também devido a presença de gema de ovo adicionada ao meio, as colônias de 
Estafilococos evidenciam duas características para diagnóstico: lipólise e proteólise, produzindo halos 
característicos e também devido a redução do telurito a teluro desenvolvendo colônias negras. 
 
Ágar Batata Dextrose 
 Para o cultivo, isolamento e contagem de bolores e leveduras de alimentos e outros produtos. 
 Forma de ação: A dextrose e infusão de batata promovem o crescimento de bolores e leveduras 
enquanto que o pH mais baixo 3,5 (deve ser ajustado com adição de ácido tartárico 10% após a 
esterilização do meio) inibe parcialmente o crescimento de bactérias acompanhantes. 
 
Ágar Citrato (Seg. Simmons) 
 Meio de ensaio sintético para a identificação de micro-organismos, especialmente Enterobactérias 
e certos fungos, baseado no emprego do citrato como única fonte de carbono. 
 Forma de ação: A degradação do citrato pelos micro-organismos produz alcalinização do meio o 
que se manifesta pela mudança de cor de verde para azul escuro devido a presença do indicador de pH 
azul de bromotimol. 
 
Ágar Columbia 
 Este meio completo apresenta grande qualidade, é utilizado para o cultivo de micro-organismos 
em geral, inclusive exigentes, e também como base para a preparação de diversos meios de cultivos 
especiais como: ágar sangue, ágar sangue cozido (chocolate), ágar acriflavina ceftazidina (ágar AC), ágar 
negro de fumo (ágar CSM), entre muitos outros. 
 
Ágar Fenilalanina 
 Empregado para verificação da desaminação da fenilalamina. 
 Forma de ação: A fenilalamina pode ser desaminada levando a produção de ácido fenil pirúvico 
por sua atividade enzimática na presença de oxigênio. Após período de incubação o reagente cloreto 
férrico é adicionado na superfície do meio de cultivo e em caso de resultado positivo (desaminação) ocorre 
a formação de coloração verde. 
 
Ágar Ferro Três Açúcares (TSI): Lactose, Sacarose e Glicose 
 Meio nutritivo para a identificação de bactérias intestinais Gram-negativas. 
 Forma de ação: A degradação do açúcar com formação de ácido se manifesta pela mudança de 
cor do indicador vermelho de fenol que vira de alaranjado-avermelhado para amarelo, ou para vermelho 
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intenso, no caso de alcalinização do meio. O tiossulfato de sódio é reduzido por alguns micro-organismos 
a ácido sulfídrico, o qual reage com sal férrico produzindo sulfeto de ferro de coloração negra. 
 
Ágar Kligler (Ágar Ferro Dois Açúcares): Lactose e Glicose 
 Meio nutritivo para a identificação de bactérias intestinais Gram-negativas. 
 Forma de ação: Idem Ágar Ferro Três Açúcares (TSI) 
 
Ágar Lisina Ferro (LIA) 
 Meio para o ensaio para verificação simultânea de lisinadescarboxilase (LD) e da formação de 
ácido sulfídrico para a identificação de Enterobactérias, sobretudo para Salmonellas e Arizona. 
 Forma de ação: A lisina pode ser descarboxilada por micro-organismos LD-positivos, que a 
transformam na amina cadaverina. Esta produz mudança de cor para violeta devido a presença do 
indicador de pH púrpura de bromocresol. Uma vez que a descarboxilação ocorre apenas em meio ácido 
(pH inferior 6,0), é necessário que se produza previamente a acidificação do meio de cultivo por 
fermentação da glicose. Por este motivo, este meio de cultivo deve ser utilizado apenas para diferenciação 
de cultivos que fermentam a glicose. 
 Os micro-organismos LD-negativos, porém fermentadores de glicose, produzem mudança de cor 
para amarelo da totalidade do meio de cultivo. A incubação prolongada pode ocasionar alcalinização na 
zona da superfície do meio de cultivo e consequentemente produz mudança de cor para violeta. A 
formação de ácido sulfídrico produz coloração negra devido ao sulfeto de ferro produzido. 
 
Ágar MacConkey 
 Meio seletivo para o isolamento de Salmonellas, Shigellas e bactérias coliformes (Escherichia coli, 
Enterobacter sp. etc.), a partir de fezes, urina, alimentos e águas residuais etc. 
 Forma de ação: Os sais biliares e o violeta cristal, inibem consideravelmente a microbiota Gram-
positiva. A lactose, junto com o indicador de pH vermelho neutro, serve para a comprovação da 
degradação do referido açúcar (colônia apresenta coloração rosada). 
 
Ágar Mueller-Hinton 
 Para o ensaio da sensibilidade ou para ensaios de resistência de agentes patógenos frente à 
antimicrobianos. 
 Forma de ação: A composição deste meio de cultivo garante, por um lado, condições favoráveis 
de crescimento e por outro lado, conta com a ausência, muito considerável, de antagonistas das 
sulfamidas. 
 
Ágar Nutriente 
 Meio de cultivo universal para o cultivo de micro-organismos pouco exigentes 
 
Ágar Sangue 
 Para o cultivo e isolamento de micro-organismos patogênicos exigentes. 
 Com adição de 0,2g/L de Azida sódica, pode ser usado como meio seletivo para o isolamento de 
cocos Gram-positivos de bacilos Gram-negativos. 
 Forma de ação: Sua abundante base nutritiva, oferece condições ótimas de crescimento a todos 
os micro-organismos presentes. O pH 6,8 é especialmente favorável para a conservação dos eritrócitos 
e para a formação de halos hemolíticos claros contribuindo para a determinação de das formas de 
hemólise. 
 
Ágar SS (Ágar para Salmonella e Shigella) 
 Para o isolamento de Salmonellas e Shigellas a partir de fezes, alimentos e outros materiais 
biológicos. 
 Forma de ação: O verde brilhante, a bilis de boi e a elevada concentração de tiossulfato e citrato 
inibe consideravelmente a microbiota acompanhante. Com o tiossulfato e íons de ferro observa-se a 
formação de sulfeto pelo escurecimento das correspondentes colônias. As colônias de Coliformes ficam 
evidentes pela demonstração da degradação da lactose a ácido devido ao indicador de pH vermelho 
neutro (colônia apresenta coloração rosada). 
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Caldo de Infusão de Cérebro e Coração (BHI) 
 Para o cultivo de diversos micro-organismos patogênicos exigentes. 
 
Caldo Lactose 
 Meio de cultivo isento de substâncias inibidoras para o ensaio prévio orientativo (presuntivo) de 
bactérias Coliformes, especialmente Escherichia coli. 
 
Sulfeto Indol Motilidade (SIM) 
 Meio de cultivo de ensaio para comprovar a formação de sulfeto, formação de indol e a motilidade, 
para o diagnóstico de Enterobactérias. 
 Forma de ação: O reconhecimento da presença de ácido sulfídrico ocorre pelo escurecimento da 
área de crescimento microbiano. A demonstração do indol ocorre pela adição do reativo de Kovacs, que 
reage formando um anel ou capa vermelha no caso da produção de indol pelo micro-organismo. 
 Com relação à motilidade, deve-se verificar se existe turbidez difusa do meio de cultivo ao redor 
do canalda punção. No caso de não haver motilidade, o crescimento microbiano pode ser observado 
somente ao longo do canal da punção. 
 
 
Esterilização 
 Para os ensaios microbiológicos há necessidade de se usar meios de cultura estéreis, 
portanto a esterilização é ponto chave para o sucesso do trabalho em microbiologia. Para 
trabalhar em condições de esterilidade é fundamental o uso de material estéril e a aplicação de 
técnicas adequadas. A esterilização é processo pelo qual são eliminadas todas as formas de vida 
de qualquer meio ou material. As principais técnicas para a esterilização de rotina no laboratório 
de microbiologia são apresentadas no quadro abaixo. 
 
Quadro 1 - Principais técnicas para esterilização de rotina em laboratório de microbiologia. 
Calor 
Calor seco (ar quente): 
160 0C a 180 0C durante 30 minutos a 3 horas; 
Emprego: Materiais de vidro, metais, alguns tipos de plásticos. 
 
Calor úmido (vapor): 
Circulação de vapor a 100 0C; 
Esterilização intermitente (Emprego: soluções termolábeis); 
Autoclave: Vapor sob pressão, temperaturas acima dos 100 0C (121 0C) 
(Emprego: meios de cultura, soluções termoestáveis). 
Filtração 
Membranas filtrantes com poros de 0,05 m a 0,8 m 
Emprego: Remoção de micro-organismos de soluções termo-lábeis por 
filtração. 
Produtos 
químicos 
Óxido de etileno 
Emprego: Materiais de plástico. 
 
Beta-propiolactona 
Emprego: Tecidos vivos, materiais biológicos. 
Radiações 
Ultra-violeta 
Emprego: Superfícies (Capela de Fluxo Laminar, Ambientes). 
 
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Exercício: Abaixo são apresentadas algumas questões para auto avaliação. 
 
1) Quanto a consistência, como os meios de cultira podem ser classificados? 
 
 
2) O que é ágar? 
 
 
3) Qual a importância do ágar em um meio de cultura? 
 
 
4) O que é colônia microbiana ou unidade formadora de colônia? 
 
 
5) Quanto à composição, qual a diferença dos meios de cultura complexos e sintéticos? 
 
 
6) Qual meio de cultura você utilizaria para identificar um determinado micro-organismo? 
 
 
7) Qual meio de cultura você utilizaria para isolar uma determinada cultura microbiana de outra? 
 
 
8) Qual o tipo de meio de cultura que você utilizaria para recuperar células microbianas injuriadas? 
 
 
9) O que significa esterelização? 
 
 
10) Como você faria para esterilizar um meio de cultivo que deve possuir substâncias termolábeis? 
Aulas práticas de Microbiologia – UNIVALI 
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3 - Métodos de inoculação, isolamento e 
contagem de micro-organismos 
 
 Em microbiologia, frequentemente há necessidade da determinação do número de micro-
organismos num determinado volume, para caracterização da população presente numa certa 
amostra, ou para avaliação do crescimento do micro-organismo em consideração. Para tanto, 
vários métodos podem ser usados, dependendo do tipo de micro-organismo, dos recursos 
laboratoriais disponíveis e do objetivo do estudo. Independentemente do método utilizado para 
a contagem, existe a necessidade da inoculação (semeadura) da amostra em análise em meio 
de cultivo. 
 A escolha da técnica de inoculação para o cultivo de micro-organismos varia de acordo 
com o tipo de meio de cultura e a finalidade do cultivo. Independente da técnica, algumas regras 
devem ser seguidas nas inoculações para a obtenção de bons resultados: 
 Agulhas e alças de níquel-cromo ou platina, e pipetas ou ponteiras devem ser esterilizadas. 
No caso específico das agulhas e alças, a esterilização deve ser feita por flambagem antes e 
após qualquer procedimento. Tome cuidado para arrefecê-las (esfriá-las) antes da coleta do 
micro-organismo. 
 Os recipientes devem sempre ser abertos próximos à chama do bico de Bunsen. 
 Deve-se evitar ao máximo que as tampas dos tubos e placas fiquem sob a bancada 
durante o cultivo. 
 
1 Isolamento de colônias em meio sólido 
a) Inoculação por estriagem 
 A técnica conhecida como estriagem é das mais frequentemente empregadas em 
microbiologia para o isolamento de colônias, dada a facilidade da sua execução. 
 Existem várias técnicas de estriagem, todas elas dando excelentes resultados se 
executadas corretamente. O objetivo da estriagem é o de produzir colônias bem separadas umas 
das outras a partir de uma suspensão de células concentrada. As células ficam muito juntas no 
inicio da estriagem, dando colônias confluentes, mas à medida que a estriagem continua, cada 
vez menos células permanecem na alça ocasionando que se depositem cada vez mais afastadas 
umas das outras no meio de cultura, formando colônias cada vez mais separadas (Figura 2). 
Uma boa placa de estriagem resulta de vários movimentos contínuos ou descontínuos (com 
esterilização à chama e arrefecimento) da alça ao longo da placa. 
Aulas práticas de Microbiologia – UNIVALI 
15 
 Para garantir uma correta inoculação em superfície, deve-se evitar ao máximo perfurar ou 
rasgar o ágar, pois isto poderá levar ao acúmulo de bactérias neste setor do meio, além de alterar 
as condições de crescimento bacteriano. 
 
b) Inoculação por espalhamento (em superfície) 
 Para a obtenção de colônias isoladas (individualizadas), pode-se aplicar uma alíquota de 
cultura microbiana (bactéria ou levedura) líquida ou suspensão de bactérias sobre a superfície 
de um meio com ágar numa placa de Petri, e espalhar uniformemente (estender o inóculo) com 
auxílio de uma alça de Drigalski (vareta de vidro dobrada em forma de L ou triangular) ou com o 
auxílio de pequenas esferas de vidro esterilizadas, de tal maneira que as células microbianas 
presentes fiquem uniformemente afastadas umas das outras. 
 Para o sucesso no isolamento de colônias pela técnica do espalhamento é necessário que 
o número de células microbianas viáveis presentes seja discreto e não muito elevado. Para uma 
placa de Petri de 9 cm de diâmetro é adequado utilizar um número de células da ordem da 
centena. Se o número total da suspensão a usar não é conhecido, deverá ser efetuado diluições 
prévias do inóculo. 
 
c) Inoculação por incorporação 
 Além da inoculação de uma determinada amostra em meio de cultivo já sólidificado, 
também é possível sua inoculação por incorporação, tanto em meio líquido como aqueles com 
adição de ágar (fundido) ("em profundidade"). 
 Para meios de cultivo líquidos ou sólidos fundidos, a inoculação pode ser realizada com 
auxílio de agulhas, alças ou pipetas ou ponteiras, seguido de homogeneização do meio por 
simples agitação no caso tubos de ensaio ou frascos de cultura de células, ou no caso de placas 
de Petri, através de movimentos rotatórios em forma de 8, em velocidade uniforme antes do meio 
solidificar, e com cuidado para que não ocorra o transbordamento do meio, no caso de placa de 
Petri. Especificamente com relação à inoculação por incorporação em placa de Petri, a técnica é 
conhecida por inoculação “pour-plate”. 
 A seguir são apresentadas as técnicas de inoculação de micro-organismos. 
 
 
 
 
Aulas práticas de Microbiologia – UNIVALI 
16 
Meio de cultivo sólido (placa de Petri – técnica do esgotamento) - Figura 2 
Divida a placa de Petri em três partes, fazendo linhas com a caneta na base (parte de baixo) da 
placa; 
- Mergulhe a alça de platina (ou níquel-cromo) esterilizada na cultura bacteriana; 
- Faça estrias em cada divisão, respeitando as linhas e utilizando da melhor forma possível toda 
a superfície da placa. 
 
Meio de cultivo líquido - Figura 3a 
- Mergulhe a alça de platina (ou níquel-cromo) esterilizada na cultura bacteriana; 
- Mergulhe e agite a alça carregada de bactérias no tubo com o meio de cultivo. 
 
Meio de cultivo semi-sólido - Figura 3b 
- Mergulhe a agulha de platina (ou níquel-cromo) esterilizada na cultura bacteriana. 
- Faça uma punção com a agulha carregada com bactérias no meio de cultivo semi-sólido. 
 
Meio de cultivo sólido (ágar inclinado) - Figura 3c 
- Mergulhe a alça de platina (ou níquel-cromo) esterilizadana cultura bacteriana. 
- Encoste levemente a alça na parte mais baixa do plano inclinado e suba fazendo estrias na 
superfície do ágar. 
 
Figura 2 - Representações de inoculação e diferentes tipos de estriagem em ágar. 
 
 
 
 
 a B 
 
Aulas práticas de Microbiologia – UNIVALI 
17 
 
Figura 3 - Representação de diferentes tipos de inoculação em tubo: inoculação em meio líquido 
(a); inoculação em meio semi-sólido (b); inoculação em meio sólido inclinado (c). 
 
 
 
 
2 Contagem de micro-organismos 
 
a) Contagem direta ou Avaliação direta 
 O método mais simples e rápido é executado por diluição da amostra e contagem direta 
dos micro-organismos ao microscópio. 
 Dada população de micro-organismos a ser quantificada deverá ser diluída de forma 
apropriada e contar o número total de micro-organismos num determinado volume da diluição. 
Existem lâminas para microscopia que contém câmaras de contagem de volumes conhecidos 
(por exemplo câmara de Neubauer). Estas câmaras permitem a determinação da concentração 
de micro-organismos na amostra de partida por cálculos realizados a partir do número de micro-
organismos observados na superfície delimitada. 
 Mesmo sendo um processo prático, porém não é aplicável a fungos ou bolores, por 
exemplo, onde é difícil identificar células individuais ao microscópio. Para estas situações, outras 
medidas indiretas são aplicáveis. A pesagem da matéria seca (após eliminação do meio de 
cultura ou solvente) constitui um indicador da massa presente na amostra, por exemplo. 
 A avaliação da capacidade de uma suspensão de micro-organismos em dispersar e 
absorver a luz incidente é, dentro de certos limites, proporcional à concentração da matéria 
insolúvel em suspensão. Utilizando fotocolorímetros, espectrofotômetros ou turbidímetros 
apropriados é possível construir curvas de absorção, de dispersão ou reflexão da luz em função 
da concentração de determinado micro-organismo em suspensão. Dada uma amostra problema, 
Aulas práticas de Microbiologia – UNIVALI 
18 
o seu comportamento face a um raio de luz incidente permite posicionar o resultado observado 
na curva padrão e assim determinar a sua concentração relativa. 
 Qualquer um dos métodos citados permitem determinar o número de micro-organismos 
numa unidade de volume da amostra em estudo, mas não fornece indicações sobre as 
concentrações de micro-organismos viáveis ou cultiváveis. 
 
b) Contagem de viáveis 
 Os métodos de contagem após crescimento permitem a avaliação das populações de 
micro-organismos viáveis e baseiam-se na capacidade de desenvolvimento de uma cultura (ou 
colônia), a partir de uma única célula. A partir da amostra em estudo procede-se a diluições 
sucessivas, inoculação de meios de cultura apropriados e avaliação do número de micro-
organismos cultiváveis. 
 Quando se pretende determinar o número de micro-organismos presentes em uma 
determinada amostra (material biológico clínico, alimento ou água, por exemplo, usa-se a 
chamada técnica de contagem em placa. Estas contagens são efetuadas por incorporação de 
um volume conhecido da amostra (frequentemente diluída), em ágar nutritivo adequado e 
conveniente incubação. Da mesma forma o espalhamento uniforme de um volume conhecido da 
amostra na superfície de um ágar sólido origina a formação de colônias discretas, cada uma 
delas proveniente de um micro-organismo que se posicionou nesse local. A concentração de 
micro-organismos presentes na amostra inicial é calculada a partir do número total de colônias 
que se desenvolveu na placa, das diluições efetuadas e do volume de diluição incorporado ou 
espalhado sobre o ágar. 
 Quando a concentração de micro-organismos na amostra em estudo é baixa, as 
contagens de micro-organismos são efetuadas após conveniente concentração da amostra, que 
poderá ser conseguido através de filtração de um volume conhecido da amostra por filtros 
esterilizantes (que retém as bactérias presentes) e inoculação do filtro sobre superfície de ágar 
nutritivo. Nos locais do filtro em que foram retidas bactérias haverá o desenvolvimento de uma 
colônia e o número total de colônias corresponderá ao número de bactérias cultiváveis presentes 
no volume de amostra filtrado. 
 As contagens podem também ser efetuadas por crescimento microbiológico em meio 
líquido. Para tanto há que proceder a múltiplas diluições sequenciais da amostra em estudo, até 
para além da probabilidade de existência de um só micro-organismo no volume de diluição a 
inocular no meio de cultura (Número Mais Provável). 
Aulas práticas de Microbiologia – UNIVALI 
19 
Contagem de Micro-organismos 
 
1 Contagem de viáveis por Inoculação em Superfície 
 
Material 
Amostra para análise; 
Placa de Petri estéril para coleta de saliva; 
Tubos de ensaio com salina estéril (NaCl 0,86%) para diluição da amostra; 
Placa de Petri com meio de cultivo (ágar Mueller-Hinton) 
Micropipeta e ponteiras estéreis; 
Alça de Drigalski 
 
Procedimento 
 
Diluição seriada da amostra 
- Identificar os tubos de ensaio com salina (tubo 1, tubo 2 ...) 
- Com auxílio de uma micropipeta, transferir 0,1 mL da saliva para o tubo (1) contendo 9,9 mL de 
salina e homogeneizar a mistura; 
- Transferir 0,1 mL do tubo 1 para outro tubo (2) contendo 9,9 mL de salina estéril e homogeneizar 
a mistura; 
Caso necessário, repita o procedimento anterior para a obtenção de novas diluições. 
Procedendo como o solicitado serão obtidas as diluições 1:100 (10-2) para o tubo 1 e 1:10000 
(10-4) para o tubo 2, respectivamente. 
 
Inoculação da amostra em superfície: 
- Identificar a(s) placa(s) de Petri com meio de cultura, marcando a(s) diluição(ões) a ser(em) 
inoculada(s) não esquecendo de identificar as placas com as diluições correspondentes a cada 
uma; 
- Com auxílio de micropipeta, inocular 0,1 mL da diluição na superfície do meio de cultura contido 
na placa de Petri; 
- Estender (espalhar) o inóculo com auxílio de uma alça de Drigalski previamente esterilizada por 
flambagem, até que todo inóculo tenha sido distribuído por toda superfície do meio e tenha sido 
absorvido pelo mesmo; 
Aulas práticas de Microbiologia – UNIVALI 
20 
- Inverter a placa e incubar a 37 0C por 24 h. 
 
 
Figura 4 – Representação de uma série de diluição decimal e respectiva inoculação. 
 
 
 
Figura 5 – Representação de inoculação com alça de Drigalski e placa após incubação. 
 
 
 
 
Aulas práticas de Microbiologia – UNIVALI 
21 
2 Contagem de viáveis por Inoculação em Profundidade (“Pour-plate”) 
 
Material 
Amostra; 
Tubos de ensaio com salina estéril (NaCl 0,86%) para coleta de material das mãos e diluição da 
amostra; 
Zaragatoa (swab) para a coleta de material das mãos; 
Placa de Petri estéril; 
Meio de cultivo: ágar Mueller-Hinton; 
Micropipeta e ponteiras estéreis; 
 
Procedimento 
 
Diluição seriada da amostra 
- Identificar os tubos de ensaio com salina (tubo amostra, tubo 1, tubo 2 ...) 
- Com auxílio de uma micropipeta, transferir 1 mL da saliva para o tubo (1) contendo 9 mL de 
salina e homogeneizar a mistura; 
- Transferir 1 mL do tubo 1 para outro tubo (2) contendo 9 mL de salina estéril e homogeneizar a 
mistura; 
Caso necessário, repita o procedimento anterior para a obtenção de novas diluições. 
Procedendo como o solicitado serão obtidas as diluições 1:10 (10-1) para o tubo 1 e 1:100 (10-2) 
para o tubo 2, respectivamente. 
 
 
Aulas práticas de Microbiologia – UNIVALI 
22 
Inoculação da amostra em profundidade 
- Identificar a(s) placa(s) de Petri, marcando a(s) diluição(ões) a ser(em) inoculada(s) não 
esquecendo de identificar as placas com as diluições correspondentes a cada uma; 
- Com auxílio de micropipeta, inocular 1 mL da diluição na superfície do meio de cultura contido 
na placa de Petri; 
- Adicionar meio de cultivo fundido arrefecido em quantidade suficiente para cobrir o fundo da 
placa,fechar a placa e homogeneizar a mistura com movimentos rotatórios em forma de 8; 
- Aguardar o meio solidificar; 
- Inverter a placa e incubar a 37 0C por 24 h. 
 
 
- Com auxílio de micropipeta, transferir 1,0 mL da amostra para uma placa de Petri seca e estéril; 
- Adicionar meio de cultura fundido arrefecido em quantidade suficiente para cobrir o fundo da 
placa seguido de homogeneização com movimentos rotatórios em “oito”; 
Após solidificação do meio, inverter a placa e incubar a 37 0C por 24 h. 
 
Análise dos resultados 
 
 O objetivo desta análise é determinar o número de bactérias por mililitro de amostra, para 
tanto: 
- Selecione uma das placas incubadas, que contenha entre 30 e 300 colônias; 
- Conte o número de colônias; 
- Calcule a quantidade de micro-organismos, levando em consideração a diluição utilizada, bem 
como o tamanho do inóculo empregado para semear a respectiva placa 
 
 
Aulas práticas de Microbiologia – UNIVALI 
23 
4 - Morfologia dos Micro-organismos – Coloração de Gram 
 
A morfologia dos micro-organismos só pode ser observada ao microscópio. Mas devido 
ao seu reduzido tamanho e ao seu índice de refração, muito próximo do índice de refração da 
água, a observação microscópica de micro-organismos, especialmente de bactérias, não é tarefa 
muito fácil. Sendo também, em geral, não pigmentadas, a observação microscópica somente se 
torna possível aumentando o contraste entre o meio envolvente e o conteúdo celular. Para 
permitir o estudo das propriedades das bactérias e classificá-las em grupos para efeitos de 
diagnóstico, várias colorações biológicas e procedimentos específicos foram desenvolvidos. 
 As técnicas de coloração podem subdividir-se em técnicas simples para visualização 
direta da morfologia, como é exemplo o azul de metileno, ou diferenciais, que possibilitam a 
discriminação entre tipos morfológicos diferentes de bactérias ou determinadas estruturas 
subcelulares. 
 
Quadro 2 - Tipos de colorações para bactérias 
 
 
 
 
Tipos de 
colorações 
Coloração negativa Coloração do meio envolvente das 
bactérias 
- Nigrosina 
- Tinta da china 
Coloração simples Morfologia: cocos, bacilos etc. e 
associações entre bactérias ou 
rearranjo: pares, cachos, cadeias etc. 
- Ácidos 
- Básicos 
- Indiferenciados 
 
 
Coloração 
diferencial 
Separação entre grupos - Gram 
- Álcool-Ácido resistentes 
Visualização de estruturas - Cápsulas 
- Endósporos 
- Flagelos 
- Nucléolo 
 
Coloração de Gram 
A coloração de Gram, desenvolvida em 1884 por Hans Christian Joachim Gram, é a 
coloração diferencial mais utilizada em microbiologia e permite classificar as bactérias em dois 
grupos: as Gram-negativas e as Gram-positivas. 
 O processo da coloração baseia-se na capacidade que certas bactérias possuem em reter 
a coloração do cristal violeta (violeta de genciana, violeta de metila 10 B, cloreto de 
pararosanilina), mesmo após a descoloração com álcool, sendo então chamadas de Gram-
positivas. As que se deixam descorar, as Gram-negativas, são depois contrastadas com um 
corante de cor diferente. 
Aulas práticas de Microbiologia – UNIVALI 
24 
A capacidade de reter a coloração inicial, nas condições do procedimento, é devido à 
diferente estrutura da parede celular (tabela de características). Em particular as várias camadas 
do peptidoglicano existente nas bactérias Gram-positivas são responsáveis por impedir a 
remoção dos complexos, que se formam entre o cristal violeta e o mordente (substância que 
aumenta a afinidade entre a célula e o corante), no passo da lavagem com álcool. 
Basicamente a coloração de Gram consta de uma exposição inicial da bactéria ao cristal 
violeta, após o que é adicionada uma solução de iodo. O iodo penetra com facilidade na célula e 
forma complexos insolúveis com o cristal violeta. A adição do álcool no passo seguinte permite a 
eliminação dos complexos por passagem através da fina camada de peptidoglicano das Gram-
negativas, mas é insuficiente para fazê-los passar através da grossa camada das Gram-positivas. 
Depois da lavagem com o álcool, as Gram-negativas, que ficaram descoradas, são contrastadas 
com um segundo corante, de cor diferente e menos intenso que o primeiro. O passo crítico é a 
remoção dos complexos do cristal violeta - iodo pelo álcool. Um tratamento excessivo pode 
descorar as bactérias Gram-positivas e um tratamento insuficiente não removerá totalmente a 
cor violeta das bactérias Gram-negativas. 
 
Técnica de preparo 
1. Preparar um esfregaço com a cultura microbiana teste (diluir e fixar em chama). 
2. Cobrir com Cristal Violeta por 30 a 60 segundos e escorrer. 
3. Cobrir com Lugol fraco por 60 segundos. 
4. Escorrer e descorar com solução de álcool/acetona (1:1) até a solução escorrer límpida. 
5. Cobrir com Fucsina ou Safranina por 30 a 60 segundos (60 segundos para anaeróbios) 
6. Lavar com água corrente e secar ao ar ou à chama com cuidado. 
 
 
 
Aulas práticas de Microbiologia – UNIVALI 
25 
Cuidados especiais 
• Usar lâminas limpas e desengorduradas (não usar detergente). 
• Filtrar os corantes se houver precipitação, pois poderão aparecer como artefatos. 
• Não lavar entre o Cristal Violeta e o Lugol. 
• O lugol deve ser armazenado em frascos de vidro âmbar e protegido da luz. 
• Descorar a lâmina com tempo suficiente. 
• Culturas velhas e células mortas são sempre Gram-negativas (perdem a capacidade de 
reter o corante). 
e) Organismos sob antibioticoterapia possuem morfologia e coloração atípica. 
f) Validação do método com bactérias padrão. 
 
Resultado: Indique nos campos abaixo a morfologia celular, rearranjo (caso houver) e reação 
da(s) cultura(s) observada(s) ao microscópio. 
 
 
 
Aulas práticas de Microbiologia – UNIVALI 
26 
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