Análise_molecular-compactado

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Genética molecular humana
Fundamentos e aplicação 
Base molecular da doença genética
 vários tipos de mutações estão na base tanto 
da variação normal, como de doença genética;
 um grande número de mutações específicas tem 
sido identificado em diferentes doenças 
genéticas 
 ex.: ΔF508 (no gene CFTR) – Fibrose Quística.
Detecção de mutações - importância
 a descrição de diferentes mutações possibilita:
 aumentar a percepção da diversidade genética humana
 conhecer a diferença entre a função normal e a alterada;
 obter informação necessária para a detecção e rastreio de 
doença genética em famílias em risco e, no caso de algumas 
doenças, na população em geral.
 o conhecimento da patologia molecular que causa uma 
dada doença genética, permite:
 delinear uma terapêutica racional; 
 planear o acompanhamento adequado.
Amostras biológicas
 A análise molecular é efectuada a partir da 
extracção de DNA genómico (DNA total da 
célula)
 a partir de qualquer tecido composto por 
células nucleadas, por ex.:
 Linfócitos do sangue periférico (sangue venoso);
 Baço e fígado (post mortem);
 Amniócitos (líquido amniótico);
 Células bucais (esfregaços bucais);
 Espermatozóides (sémen ou esfregaço vaginal);
 Etc. 
Análise 
forense
DPN
Análise molecular - objectivos
 Obtenção de DNA (ou RNA) em quantidade suficiente 
para análise
 Dificuldades
 cada célula tem apenas 2 cópias de um gene;
 alguns genes são transcritos em apenas alguns tecidos;
 alguns genes são transcritos em níveis reduzidos 
reduzido número de moléculas de mRNA disponíveis.
 Purificar a sequência-alvo, isolando-a de todas as 
outras sequências de DNA (ou RNA) presentes na célula
 Clonagem de DNA
 envolve a transferência da sequência-alvo de DNA para uma 
célula ou microorganismo o qual é, depois, cultivado de forma 
a reproduzir a referida sequência, concomitantemente com o 
seu próprio DNA;
 permite isolar grandes quantidades da sequência-alvo, na sua 
forma pura.
 PCR (polymerase chain reaction)
 envolve amplificação de quantidades ilimitadas de uma 
sequência-alvo;
 permite amplificar selectivamente uma única molécula de 
DNA, ou RNA, milhões de vezes, em poucas horas;
Análise molecular – tecnologias de base
Clonagem de DNA
 Enzimas de restrição
 Vectores
 Bibliotecas
 Sondas de ácidos nucleicos
Enzimas de restrição
 Enzimas especiais bacterianos que clivam (“cortam”) as 
moléculas de DNA em locais específicos (palindromas);
 A clivagem do DNA por estes enzimas é reprodutível e 
cria um conjunto de fragmentos característicos, os quais 
reflectem a frequência e a localização de sítios de 
reconhecimento específicos;
 Aplicação:
 uma única alteração num par de bases, altera a sequência do 
sítio de reconhecimento do enzima, o que impede a ligação 
deste ao DNA
 os fragmentos resultantes da digestão têm uma localização 
específica no genoma  se algum estiver alterado, é possível 
localizar a alteração correspondente na sequência de DNA;
Exemplos de enzimas de restrição
enzima fonte Sequência reconhecida
EcoRI Escherichia coli RY 13
5’-G^AATT C-3’
3’-C TTAA^G-5’
TaqI Thermus aquaticus
5’-T^CG A-3’
3’-A GC^T-5’
BamHI Bacillus amyloliquefaciens H
5’-G^GATC C-3’
3’-C CTAG^G-5’
HaeIII Haemophylus aegyptius
5’-GG^CC-3’
3’-CC^GG-5’
HindIII Haemophilus influenzae Rd
5’-A^AGCT T-3’
3’-T TCGA^A-5’
NotI Nocardia otitidis-cavarium
5’-GC^GGCC GC-3’
3’-CG CCGG^CG-5’
Sau3A Staphylococcus aureus
5’-^GATC-3’
3’- CTAG^-5’
Vectores
 Moléculas de DNA que se podem replicar, de 
forma autónoma, num hospedeiro (bactéria ou 
levedura), a partir do qual podem depois ser 
isoladas, na forma pura, para análise;
 Permitem gerar um grande número de cópias de 
uma sequência de DNA;
 Tecnologia de DNA recombinante
 novas combinações, criadas in vitro, de sequências 
de DNA humano (ou outro) e moléculas-vector (por 
ex., bacterianas) capazes de várias duplicações 
numa estirpe laboratorial do microorganismo.
 Plasmídeos  ~ 15kb
 Bacteriófago lambda (fago lambda)  ~ 20kb
 Cosmídeos  ~ 45kb
 BACs (bacterial artificial chromosomes)  100 – 300kb
 YACs (yeast artificial chromosomes)  100 – 2000kb
Vectores - tipos
Tecnologia de DNA recombinante
Bibliotecas
 Conjunto de clones (de bactérias ou de leveduras) que contêm 
um vector, no qual foram inseridos fragmentos de DNA;
 Tipos
 genómicas
 criadas por digestão parcial de DNA genómico, de forma que 
alguns sítios sejam clivados e outros não  se ocorrer clivagem 
ao acaso nesses sítios, obtém-se um conjunto de fragmentos 
(parcialmente sobreponíveis) com um tamanho adequado para 
clonagem e ligação a um vector.
 de cDNA
 Cópias de DNA complementar da população de mRNA presente 
num dado tecido;
 Vantagens: 
 o clone obtido é uma representação directa das sequências 
codificantes (sem sequências não codificantes);
 o uso de uma fonte específica de mRNA enriquece as sequências 
derivadas de um gene que se expressa selectivamente nesse tecido;
Criação de uma biblioteca genómica Criação de uma biblioteca de cDNA
Sondas de ácidos nucleicos
 Fragmentos de DNA específicos utilizados para analisar 
a sequência-alvo de DNA
 Marcadas para posterior detecção 
 isótopo radioactivo;
 composto histoquímico; 
 corante fluorescente.
 Aplicação
 testa-se uma sequência (alvo), presente numa mistura de 
ácidos nucleicos, pela sua complementaridade com um 
fragmento de sequência conhecida (sonda);
 Se a sonda for complementar com o alvo, formará uma 
molécula de cadeia dupla estável;
 A detecção e análise dessas moléculas são facilitadas pela 
marcação prévia da sonda.
Hibridação de DNA com sondas de ácidos 
nucleicos
Métodos de análise de ácidos nucleicos
 Southern Blotting;
 Análise de oligonucleótidos específicos de alelo 
(A.S.O.);
 Northern Blotting;
 Hibridação in situ de fluorescência (FISH) (em 
cromossomas)
Southern Blotting
 O DNA é isolado, a partir de uma amostra 
biológica, digerido por enzimas de restrição e os 
fragmentos resultantes separados (com base no seu 
tamanho), por electroforese em gel de agarose;
 Método padrão para análise da estrutura do DNA 
clivado por enzimas de restrição;
 Permite analisar globalmente o gene e detectar 
grandes alterações (não permite detectar pequenas
alterações).
Southern blotting
Digestão com enzimas 
de restrição
Hibridação com sondas 
específicas
Análise de Southern blotting
Northern Blotting
 semelhante ao Southern blotting, mas usado para 
análise de amostras de RNA;
 O RNA não pode ser clivado pelos enzimas de restrição 
usados para o DNA, mas os diferentes transcritos de 
RNA têm diferentes tamanhos dependendo do número 
de exões do gene;
 O RNA celular total é separado, de acordo com o 
tamanho, por electroforese em gel de agarose, 
transferido para filtros de nitrocelulose ou nylon, 
incubado com sondas desnaturadas e marcadas e, 
depois, revelado;
 Método padrão para determinação do tamanho e 
abundância do mRNA, de um gene específico, existente 
numa amostra de RNA
Análise de oligonucleótidos específicos de 
alelo - A.S.O.
 usa sondas de tamanho 
reduzido  oligonucleótidos
 mais sensíveis a pequenas 
diferenças entre alvo e sonda;
 hibridam apenas com o alvo 
complementar normal (e não com 
sequências alteradas, nem que 
seja apenas numa única base);
 permite 
 uma identificação específica de 
uma dada sequência de DNA
 distinguir entre indivíduos 
 com a sequência normal em 
ambos os cromossomas
 com a sequência mutante em 
ambos os cromossomas
 com a sequência mutante 
num dos cromossomas e a 
normal no outro.
 usada apenas quando a mutação 
específica é conhecida.
 As sondas podem ser aplicadas ao DNA contido nos 
cromossomas fixados numa lâmina;
 O DNA é desnaturado no local (in situ) para que as 
duas cadeias sejam separadas e possam hibridar com 
uma sonda marcada (normalmente, com um corante 
fluorescente);
 Quando a lâminaé colocada num microscópio sob uma 
luz fluorescente, observa-se um sinal correspondente 
à emissão de luz pela molécula do corante  o que 
permite localizar região do DNA em que a sonda 
hibrida.
Hibridação in situ de fluorescência 
FISH
FISH II
 Usam-se vários tipos de sondas
 Cosmídeos, BACs, YACs
 Misturas complexas
 DNA de um cromossoma inteiro
 DNA de um braço de um cromossoma
 DNA de uma região cromossómica
 DNA centromérico
 Aplicada a cromossomas (metafase) mas também a DNA 
em interfase (ex.: pesquisa de aneuploidias);
 Desenvolvimentos
 CGH – hibridação genómica comparativa
 SKY – spectral karyotyping
 Microarrays
 Array-CGH
Chromosome 
painting probes
CGH
Array-CGH
Pesquisa de microdelecções
(a
)
(b
)
FISH em interfase
FISH com sondas 
subteloméricas
Reacção em cadeia da polimerase – P.C.R.
 Amplificação enzimática de um fragmento de 
DNA (alvo) localizado entre dois 
oligonucleótidos “iniciadores” – primers;
 Os primers são desenhados de forma a que um 
seja complementar de uma cadeia de DNA, num 
dos lados da sequência-alvo e o outro primer
seja complementar da outra cadeia, no lado 
oposto da sequência-alvo 
PCR II
 Como a extremidade 3’ de cada primer aponta para a 
sequência a ser amplificada e os primers flanqueiam a 
sequência-alvo, eles são alongados pela síntese da 
sequência entre eles;
 Vários ciclos da reacção resultam em amplificação 
exponencial da sequência-alvo;
 A amplificação de sequências específicas facilita a 
clonagem de genes para análise de mutações 
 amplificam-se porções de um gene, usando primers que se 
sabe serem específicos para o gene normal;
 o gene mutante pode, depois, sequenciar-se ou analisar-se por 
A.S.O.
 Aplicável tanto a amostras de DNA como de 
RNA;
 Técnica rápida, pouco laboriosa e pouco 
dispendiosa;
 Extremamente sensível 
 detecção e análise de sequências génicas 
específicas numa amostra, sem necessidade de 
clonagem ou de Southern ou Northern blotting;
 necessita de pequena quantidade de amostra 
pode efectuar-se numa única célula (tanto para 
diagnóstico pré-natal, por ex., como para análise 
forense).
PCR III
Outros métodos de análise molecular
 Análise de sequência de DNA
 Análise de proteínas
 Western blotting
 Detecção de proteínas específicas;
 Obtenção de informação sobre o tamanho e quantidade de 
proteína alterada, em extractos celulares de pacientes 
com doenças genéticas;
 Isolam-se proteínas de um extracto celular, separam-se 
em gel de poliacrilamida e transferem-se para uma 
membrana; esta é incubada com anticorpos específicos 
para a proteína e, depois, com anticorpos marcados. 
Polimorfismos genéticos
 Diferentes versões de uma dada sequência de DNA 
numa dada localização cromossómica, com uma 
frequência superior a 1% na população geral
 Tipos:
 S.N.P. – polimorfismos mononucleotídicos;
 R.F.L.P. - polimorfismos de tamanho de fragmentos de 
restrição
 minissatélites – resultam da inserção ou delecção de 
DNA entre dois sítios de restrição;
 Ex: V.N.T.R. – número variável de repetições em tandem.
 microssatélites – sequências de DNA que consistem em 
unidades repetidas de dois, três ou quatro nucleótidos. 
Polimorfismos genéticos - II
 Diferenças:
 Frequências alélicas;
 Localização no gene;
 Impacto na expressão génica;
 Estrutura proteica resultante;
 Consequências patológicas.
 Aplicações
 distinguir entre formas herdadas de um gene ou entre diferentes 
segmentos do genoma;
 mapear um gene numa dada região cromossómica;
 Diagnóstico pré-natal de doença genética;
 Detecção de portadores heterozigóticos de doença genética;
 Testes de paternidade;
 Análises forenses de vários tipos;
 Etc.
Análise de RFLPs
Análise de microssatélites
Análise de minissatélites 
(DNA fingerprinting)
Exercícios
Na família que se segue, verificou-se uma doença metabólica de 
transmissão AR, cujo gene tem linkage com um polimorfismo de 
restrição de que existem dois alelos A e B. Baseando-se nos 
padrões de Southern blotting diga qual o genótipo e fenótipo dos 
quatro irmãos do rapaz afectado, incluindo a indicação dos alelos 
mutados e a sua proveniência.
Observe os resultados da análise de investigação de 
paternidade, por pesquisa de VNTR, na seguinte família. 
Indique qual a relação de paternidade dos indivíduos II-1, 
II-2 e II-3 com o indivíduo I-1.
I
II
1 2
31 2
Na seguinte família, observa-se a transmissão de hemofilia B. 
Indique qual o tipo de transmissão em causa. Baseando-se na 
análise de um polimorfismo RFLP intragénico do factor IX 
(indicado por 1.3) indique, ainda, se o indivíduo II-3 será, ou não, 
afectado. 
1 2
1 2 3
Na árvore genealógica seguinte, representa-se uma família com 
transmissão de doença poliquística renal do adulto, e estão 
indicados os genótipos dos indivíduos em relação a um 
polimorfismo de microssatélites localizado no cromossoma 16. 
Indique o tipo de transmissão em causa e qual o genótipo 
associado à doença.