Guia Prático de PCR

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Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
· O que é?
É uma técnica da biologia molecular onde se amplifica uma única cópia ou algumas cópias de um segmento de DNA em várias ordens de grandeza, gerando milhares a milhões de cópias de uma determinada sequência de DNA. É uma maneira fácil, barata e confiável de replicar repetidamente um segmento específico de DNA. Esta técnica é utilizada na pesquisa biomédica, na forense criminal e na arqueologia molecular.
· Para que serve?
Na medicina forense: pequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime (pedaços de cabelo que contenham bulbo, gotas de sangue ou saliva, pedaços de pelo ou até mesmo a minúscula quantidade de DNA deixada em uma impressão digital) são amplificadas para serem analisadas pelo método de impressão digital genética.
Na biologia molecular: como amplificação para gerar mutagênese, detecção de mutações ou preparação de fragmentos de DNA para clonagem (inserção em plasmídeo, por exemplo) como também pode ser utilizada para identificação de patógenos que estão presentes em amostras, como por exemplo a identificação de agentes como Candida sp, Chlamydia trachomatis, HPV (Vírus do papiloma humano) e seus genótipos, HIV, Vírus da Hepatite B, etc.
Na paleontologia: para o sequenciamento gênico de animais pré-históricos.
· Componentes
Cada reação deve utilizar quantidades suficientes de Cloreto de Magnésio (MgCl2) (É necessário que haja magnésio disponível para que os dinucleotídeos possam ser adicionados pela Taq à nova fita que estará se formando), dinucleotídeos (dNTPs: Adenina, Guanina, Citosina e Timina) que dirá pela sua quantidade a quantidade de magnésio livre, enzima DNA Polimerase, oligonucleotídeos iniciadores (primers) e amostras do DNA template. Adicionalmente deve-se ainda fazer uso de alguns componentes tamponantes e estabilizadores da reação. A composição dos tampões, em geral, inclui Tris-HCl, KCl e gelatina. Em geral costuma-se utilizar cerca de 1/10 de tampão (10x) por volume final de reação. A enzima Taq Polimerase, isolada do microorganismo Thermus aquaticus, resiste a altas temperaturas, sendo a mais comumente utilizada em reações de PCR.
· DNA ou RNA?
· A reação SEMPRE parte de um DNA molde, extraído convenientemente da amostra, ou de uma amostra de RNA, convertida para cDNA (DNA complementar) através da transcriptase reversa. Ferramenta útil em estudos de expressão gênica, pois avaliando o mRNA, podemos detectar quais proteínas estão sendo efetivamente expressas. Se partir do DNA, a amostra provavelmente estará passando pelo PCR para dizer se há a presença de um certo gene e se ele está mutado, no diagnóstico de doenças genéticas e na detecção de microrganismos presentes no organismo. Se partir do RNA, estará verificando se há presença de microrganismos de RNA ou estará sendo usado para avaliar o acompanhamento da agressividade de uma doença, se o paciente está respondendo à um tratamento químico.
· Método
Obtém-se uma amostra mínima de DNA de uma célula humana.
1. A amostra de DNA, a enzima que faz a replicação (DNA polimerase), os nucleotídeos de DNA e os primers complementares a sequência de DNA são colocados em um tubo de ensaio.
2. Coloca-se o tubo de ensaio em uma máquina de PCR (máquina que aumenta e diminui a temperatura de acordo com um programa). Os passos seguintes, de aquecimento e resfriamento, acontecem dentro da máquina controlados pelo programa.
3. Aquece-se o tubo a 94ºC para desnaturar (separar a dupla fita) o DNA.
 4. Cada fita simples do DNA que foi desnaturado serve de molde para a síntese de novas cadeias complementares. Para isso resfria-se a 54ºC onde os primers se anelam ao início das duas fitas simples, servindo de iniciadores para a enzima polimerase. 
 5. Aquece-se novamente o tubo a 72ºC (temperatura ideal de funcionamento da DNA polimerase) para a duplicação da fita. A DNA polimerase inicia, após o final do primer, a colocar os nucleotídeos livres na fita de DNA ligando-os por complementaridade, formando assim uma nova fita dupla. Em seguida um novo ciclo é iniciado. Normalmente são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação.
 6. O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida e depois é interpretado com a ajuda de um profissional competente. Geralmente um padrão de peso molecular é adicionado em uma das fileiras do gel, assim poderá se avaliar o tamanho do fragmento amplificado. A quantidade de DNA final segue uma função exponencial, portanto, a concentração final do DNA molde na solução é muito maior do que a inicial, possibilitando a sua identificação.
· Análise
A Eletroforese em gel é uma técnica usada para separar fragmentos de DNA (ou outras macromoléculas, como o RNA e proteínas) com base no tamanho e carga. A eletroforese envolve a passagem de uma corrente através de um gel contendo as moléculas de interesse. Em função de seu tamanho e carga, as moléculas vão se mover através do gel em diferentes direções ou em diferentes velocidades, o que permite que sejam separadas umas das outras. 
Todas as moléculas de DNA têm a mesma quantidade de carga por massa. Por essa razão, a eletroforese em gel de fragmentos de DNA faz a separação baseada apenas no tamanho. Através do uso da eletroforese, podemos ver quantos diferentes fragmentos de DNA estão presentes em uma amostra, e o quão grande eles são em relação aos outros. Podemos também determinar o tamanho absoluto de um pedaço de DNA examinando-o ao lado de um DNA "padrão", composto de fragmentos de DNA de tamanhos conhecidos.
Uma vez que o gel esteja na caixa, cada uma das amostras de DNA que queremos examinar é cuidadosamente transferida para um dos poços. Um poço é reservado para uma escada de DNA, um padrão de referência que contém fragmentos de DNA de comprimentos conhecidos. As escadas de DNA comerciais vêm em diferentes intervalos de tamanho, então podemos escolher uma que tenha boa "cobertura" para a faixa de tamanho esperada de nossos fragmentos.
A seguir, a caixa é ligada e a corrente começa a fluir através do gel. As moléculas de DNA têm carga negativa devido aos grupos fosfato em seus esqueletos de açúcar-fosfato, assim elas começam a se mover através da matriz de gel, para o polo positivo. Quando a energia é ligada e a corrente passa através do gel, diz-se que o gel está correndo.
Uma vez que os fragmentos tenham sido separados, podemos examinar o gel e ver quais tamanhos de faixas são encontrados. Quando um gel é pigmentado com um corante que se liga ao DNA e depois colocado sob luz UV, os fragmentos de DNA brilham, o que nos permite visualizar o DNA presente em diferentes locais ao longo da extensão do gel.
Uma "linha" bem definida de DNA em um gel é chamada de banda. Cada banda contém um grande número de fragmentos de DNA do mesmo tamanho e todos os que viajaram, como um grupo, para a mesma posição. Um fragmento único de DNA (ou até mesmo um pequeno grupo de fragmentos de DNA) não seria visível por si só em um gel.
Obs: Há um limite para as amplificações, por haver uma quantidade pré definidas de cada componente da reação.