Esterilização e Assepsia em Microbiologia

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19/11/2013
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Disciplina: Microbiologia Geral
Esterilização, Assepsia 
e Preparo de Meios de 
Cultura.
• PROCEDIMENTOS DE SEGURANÇA
* Os estudantes devem estar concentrados
nas tarefas que desenvolvem, compreender o
equipamento, os reagentes e os materiais
biológicos que usam.
TÉCNICAS LABORATORIAIS EM MICROBIOLOGIA 
ESTERILIZAÇÃO E ASSEPSIA
CONCEITOS
ANTI-SEPSIA – Inativação ou redução do número de
microrganismos presentes em um tecido vivo, com
substâncias anti-sépticas.
DESINFESTAÇÃO – Inativação ou redução do número de
microrganismos presentes em um material inanimado, não
implicando na eliminação de todos os microrganismos viáveis.
Porém elimina a potencialidade infecciosa do objeto ou
superfície de trabalho (eliminação de microrganismos
patogênicos).
ASSEPSIA – Impede a entrada de microrganismos em
áreas de trabalho .
ESTERILIZAÇÃO – eliminação de toda e qualquer forma de
vida presente em um determinado material ou ambiente.
SANITIZAÇÃO – é o tratamento que leva à diminuição da
vida microbiana nos utensílios alimentares e equipamentos
de manipulação de alimentos até os níveis seguros de saúde
pública.
Processo que promove a completa eliminação 
ou destruição de todas as formas de 
microrganismos presentes: 
•vírus, 
•fungos, 
•bactérias, 
•protozoários, esporos
ESTERILIZAÇÃO
•Evitar a contaminação;
•As técnicas assépticas:
• minimizam a possibilidade das culturas serem 
contaminadas por organismos vivos do ambiente
• e impedem que os organismos, especialmente 
os patógenos, escapem para o meio
Finalidade da esterilização: 
http://www.ehelpcarolina.com/anvisa-anuncia-reforo-em-medidas-de-combate-superbactria/super-bacterias/
http://www.microbiologiabrasil.blogspot.com/
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•Todas as condições, gestos e atitudes que tendem a 
manter o estado de ausência de microrganismos 
contaminantes no meio em que atuam.
•Agentes desinfetantes:
•São tipicamente aplicados em objetos, 
superfícies
•Agentes antissépticos:
•São aplicados em tecidos vivos
Assepsia:
•Agentes desinfetantes:
• Álcool 70%: superfícies de trabalho e câmara de fluxo 
laminar, entre outros.
• Porque não utilizar Álcool absoluto ???? 
• Hipoclorito de sódio ou de cálcio: o cloro oxida os 
componentes celulares
• Detergentes
• Fosfato Trissódico
• Dietilpirocarbonato (DEPC): inibidor RNAses
Assepsia:
Higienização do Laboratório:
• É fundamental ter os cuidados de assepsia do 
laboratório e do material nele utilizado
• Partículas estranhas podem constitui-se de 
contaminantes
• Ocasionando perda de experimentos e, ou, 
interferência nos resultados
Higienização do Laboratório:
• Bancadas e todas as superfícies devem ser desinfestadas, 
• O piso do laboratório, deve ser limpo diariamente com pano 
umedecido em solução desinfestante.
• Durante a higienização do piso NÃO se deve varrer, para 
evitar a suspensão de partículas no ar, principalmente em 
ambientes com câmara de fluxo laminar
• Na entrada do laboratório é recomendável manter um pano 
umedecido em solução desinfestante para limpar os 
calçados
TIPOS DE ESTERILIZAÇÃO TIPOS DE ESTERILIZAÇÃO 
a) ESTERILIZAÇÃO PELO CALOR SECO:
• Para vidrarias. 
• ESTUFA OU FORNO DE PASTEUR 
• Geralmente 180 °C por 2 horas;
• Remove toda umidade do material
• Deve-se envolver todo o material a ser esterilizado em 
papel alumínio ou outro tipo, para evitar 
contaminações posteriores
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Temperatura Tempo de exposição (min)
170 -180 60
160 120
150 150
140 180
121 Durante 1 dia ou 1 noite
Tabela1.Temperatura e tempo necessários para esterilização de
vidrarias em estufa.
Figura 1. Estufas para esterilização de vidrarias
B
•A esterilização de materiais metálicos pela chama de um 
bico de Bunsen (Flambagem) (300 a 600 º C)
Figura 2 Bico de Bunsen e esquema da chama Figura 3 Bico de Bunsen e transferência asséptica
b) ESTERILIZAÇÃO PELO CALOR ÚMIDO:
• Meios de cultura e outros líquidos como soluções Tampões. 
Utiliza-se AUTOCLAVE
Volume do 
recipiente
Minutos de exposição 
a 120ºC e 1 atm
Erlenmeyer de 
1000 ml
17 – 20
Erlenmeyer de 
500 ml
15 – 17
Erlenmeyer de 
250 e 125 ml
12 – 15
Tubos de ensaio 12 – 15
TIPOS DE ESTERILIZAÇÃO 
Tabela 2. Tempo requerido para esterilização de líquidos em
autoclaves de acordo com o volume.
Figura 4. Esquema de autoclave horizontal, Autoclave vertical utilizada para 
esterilização de meios de cultura; Detalhe do cesto de esterilização.
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Figura 5. Autoclave vertical utilizada para esterilização de meios de cultura (A); 
Detalhe do registro e manômetro (B).
A
B
Preparação de materiais e vidrarias para 
esterilização em autoclave:
• O acondicionamento correto de materiais e de
vidrarias é importante para a esterilização
eficiente em autoclave
• Pipetas, placas de Petri, tubos e demais
intrumentos devem estar corretamente
embalados, para que posterior a esterilização
possam ser guardados sem ser contaminados.
Preparação de materiais e vidrarias para 
esterilização em autoclave:
• Placas e Pipetas devem ser condicionadas em papel de embrulho ou jornal e 
identificadas
Figura 6. Placas de Petri sendo embrulhadas em
papel Kraft (A); Pipeta embrulhada em Kraft(B).
Preparação de materiais e vidrarias para 
esterilização em autoclave:
• Placas e Pipetas devem ser condicionadas em papel de embrulho e identificadas
Figura 7. (A) Pipeta embrulhada em Kraft(B) Placas de Petri sendo embrulhadas
em papel Kraft
Preparação de materiais e vidrarias para 
esterilização em autoclave:
• Tubos de cultura devem possuir um tampão de algodão, cobertos por uma coifa feita com 
pedaço de papel de embrulho
Figura 8. (A) Tubo de ensaio (B) Tubo de ensaio com boneca
Procedimentos para a esterilização de 
materiais e vidrarias em autoclave:
Figura 9. Autoclave vertical utilizada para esterilização de meios de cultura 
(A); Detalhe do nível da água em 1 cm abaixo da cruzeta (B).
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• Observar o nível de água, que deve estar até 1 cm abaixo da cruzeta;
• Colocar o cesto da autoclave;
• Colocar todo o material a ser esterilizado na parte superior do cesto;
• Fechar a tampa, apertando os manípulos em cruz;
• Ligar a autoclave na potência máxima e abrir o registro (válvula de escape);
• Aguardar a saída do vapor por 3 a 5 minutos, fechando o registro posteriormente;
• Alcançada a temperatura de trabalho (121°C), colocar a chave na posição média,
ajustando, quando necessário, os pesos que controlam a quantidade de vapor;
• Marcar o tempo, que deverá ser de 15 a 30 minutos, dependendo do material;
• Terminado o tempo de esterilização, desligar a autoclave e deixar que o ponteiro do
manômetro atinja a posição zero;
• Abrir o registro aos poucos e aguardar a saída do vapor da autoclave, de maneira
que ele seja escoado completamente;
• Em seguida, abrir os manípulos em cruz e retirar os materiais, colocando-os em
estufa de secagem.
Procedimentos para a esterilização de materiais e 
vidrarias em autoclave:
• Não abrir o registro antes que o manômetro
atinja a posição zero, para evitar que o material
esterilizado fique muito molhado e que os
papéis que o envolvem se rasguem;
• Nunca abandonar o local de esterilização,
conferindo sempre a temperatura da autoclave,
e evitando a quebra de materiais e o RISCO DE
EXPLOSÃO.
Procedimentos para a esterilização de 
materiais e vidrarias em autoclave:
c) ESTERILIZAÇÃO POR FILTRAÇÃO:
• Para substâncias que não podem ser esterilizadas pelo calor.
• Utilizam-se filtros apropriados
• Filtros Milipore (0,45 µ e 0,2 µ), proporcionam bons
resultados de esterilização por filtração
TIPOS DE ESTERILIZAÇÃO 
Figura 10: Tipos de Filtros
Filtragem
Filtro com 
poro de 5 m
Bactérias 
retidas no 
filtro
Figura 11: Exemplo de Filtragem
d) ESTERILIZAÇÃO POR SUBSTÂNCIA GASOSAS:
• Óxido de propileno pode ser utilizado para esterilizar placas 
de Petri de plástico com ou sem meio de cultura
• Pilhas de placas são acondicionadas em sacos plásticos, 
adicionaum chumaço de algodão embebido com 3-10 ml de 
OP por 24 h.
• Placas devem ser retiradas em condições assépticas
TIPOS DE ESTERILIZAÇÃO 
e) ESTERILIZAÇÃO DE SOLOS :
• Utiliza-se Autoclave a 120° C por duas horas por 2 dias 
consecutivos
• Após a esterilização o solo deve permancer em repouso por 
5-7 dias
f) ESTERILIZAÇÃO POR RADIAÇÃO ULTRA VIOLETA
• Lâmpadas UV eficientes na eliminação ou redução de 
microrganismos do ar
• Utilizadas em Câmara asséptica
• CUIDADO!!!
TIPOS DE ESTERILIZAÇÃO 
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Figura 12. Câmara asséptica utilizada nas práticas de isolamento, plaqueamento e
repicagem (A); Detalhe do interior da câmara (B).
A B
Figura 13: Esquema do Filtro da Câmara de Fluxo Laminar 
g) ESTERILIZAÇÃO POR AGENTES QUÍMICOS:
• Brometo de metila (solos): liberado até 2015
• Desinfestantes:
• Hipoclorito de Sódio
• Álcool 70%
• Detergentes
• Fosfato Trissódico 
• Dietilpirocarbonato (DEPC): inibidor RNAses
TIPOS DE ESTERILIZAÇÃO 
• Destinam-se ao cultivo artificial dos microrganismos e 
fornecem os princípios indispensáveis ao seu crescimento.
• O que são ? 
• Materiais nutrientes preparados no laboratório para 
crescimento de microrganismos
• Substratos naturais ou artificiais
• Devem conter as substâncias exigidas para o crescimento 
e multiplicação
• Devem atender as exigências de fontes de C, N, energia e 
sais minerais.
• Função: Isolamento, cultivo, preservação, estudos 
morfológicos
MEIOS DE CULTURA
• Há uma variedade de meios de cultura, alguns vendidos 
comercialmente
Figura 14. Frascos de Meio de Cultura comercial tradicionalmente utilizado em 
técnicas de isolamento de microrganismos
MEIOS DE CULTURA PREPARO DE MEIOS DE CULTURA
Figura 15: Balança semi analítica pesando meio de cultura
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PREPARO DE MEIOS DE CULTURA
Figura 16 . Meio de Cultura sendo vertido para placa de Petri em 
condições assépticas. 
a) Quanto a Consistência:
-Líquidos: isolamento, formato, cor e tamanho da colônia 
formada.
-Sólidos: cultivo, formação de gás, odor e alterações no 
pH produzidas pelas bactérias, preservação.
-Semi-sólidos: a diferença entre esses tipos é a 
quantidade de ágar que é acrescentada ao meio.
MEIOS DE CULTURA
SÓLIDO
SEMI -SÓLIDO
Bradyrhizobium sp Derxia sp
Figura 17 . Exemplos de Meios de Cultura de diferentes consistências
Meio Líquido
Figura 18. Exemplo de Meio de Cultura de consistência líquida
*ÁGAR: 
• polissacarídeo que tem muitas propriedades que o 
tornam um agente solidificante ideal, 
• formado por extrato de algas marinhas, é usado na 
preparação de meios sólidos;
• Utilizado em uma concentração em torno de 1,5% 
(p/v), ou 1,5 g/100ml
• Funde-se em torno do ponto de ebulição da água 
(100°C), formando uma solução transparente que 
permanece no estado líquido em torno de 40 °C.
MEIOS DE CULTURA
b) Quanto a Composição:
Naturais: material natural com composição desconhecida
Ex: Extrato de Malte, batata, extrato de carne.
Sintéticos: composição química conhecida
Semi-sintéticos: quando não se conhece a composição 
de alguns componentes do meio
Ex: Batata-dextrose-ágar (BDA)
MEIOS DE CULTURA
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c) Quanto a Especificidade:
-Gerais: utilizados por uma ampla gama de microrganismos
-Seletivos: Específicos para isolamento, crescimento e 
multiplicação de determinadas espécies ou Gênero de 
microrganismos
d) Condições de cultivo:
Bactérias: pH neutro
Fungos: condições ácidas
MEIOS DE CULTURA
- Os meios, após sua preparação, devem ficar sobre o 
balcão ou interior da câmara de fluxo laminar até o 
esfriamento à temperatura ambiente.
- quando a quantidade de meios preparados é pequena e de 
uso imediato, eles devem ser armazenados em geladeira 
e, preferencialmente, dentro de sacos plásticos para evitar 
maior desidratação.
MEIOS DE CULTURA
-Vírus: não crescem em meios de cultura 
Ex: Fitovírus
Sobrevivem nas células vivas do Hospedeiro
Meio de Cultura: Planta 
Inoculação: introdução do vírus por meio de 
microferimentos em presença de Soluções 
Tamponantes no tecido vegetal do Hospedeiro
SOLUÇÕES TAMPONANTES
Figura 19. Inoculação mecânica de vírus de plantas