RESUMO SEQUENCIAMENTO DE DNA

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SEQUENCIAMENTO DE DNA 
Processo que determina a ordem dos 
nucleotídeos (blocos que constituem a 
molécula de DNA) em uma amostra. 
O mapeamento do genoma humano levou 13 
anos para ser feito e mais de 5.000 
cientistas, de 17 países diferentes (inclusive o 
Brasil), trabalharam para isso, ficando pronto 
em 2003. A partir da avaliação de duplas de 
cromossomos, descobriu-se que a diferença 
entre o DNA de duas pessoas pode ser de 
até 5%. 
Foi somente na década de 70 que os 
primeiros métodos para sequenciamento de 
DNA foram criados, dando início à era de 
sequenciamento de primeira geração. Essa 
mudança, responsável por um grande impacto 
na ciência, aconteceu com a utilização da 
técnica de separação de polinucleotídeos por 
comprimento através da eletroforese em gel, 
sendo utilizada em dois protocolos: o método 
de sequenciamento químico de Allan Maxam e 
Walter Gilbert e o sistema de Alan Coulson e 
Frederick Sanger. 
Na técnica de sequenciamento Maxam-
Gilbert., os fragmentos de DNA clivados são 
corridos em eletroforese em gel e 
separados de acordo com seu tamanho. Os 
fragmentos de maior peso permanecem na 
parte superior do gel, enquanto os de menor 
peso se localizam na parte inferior. A leitura 
é feita de baixo para cima. O procedimento 
de Maxam e Gilbert determina a sequência 
das bases através da clivagem química da 
terminação 5’ dos fragmentos de DNA 
marcados radioativamente. 
Já a metodologia de Sanger e Coulon 
determina a sequência de nucleotídeos 
através da síntese de uma fita simples de 
DNA utilizando a DNA polimerase e 
didesoxinucleotídeos (ddNTPs). O uso da DNA 
polimerase é a principal diferença entre os 
métodos. Ao misturar os ddNTPs marcados 
radioativamente em uma reação de PCR, a 
síntese da nova fita de DNA continua até que 
um dos análogos seja incorporado, já que os 
ddNTPs não possuem o grupo hidroxila 3’ 
necessário para a extensão das cadeias de 
DNA. Quando isso ocorre, a etapa de 
elongação termina e a fita é inacabada. Cada 
reação vai terminar contendo uma mistura 
com diferentes comprimentos de fitas de 
DNA, todas terminadas com o ddNTP marcado 
para aquela reação, que serão visualizados 
por autorradiografia ou luz ultravioleta. 
Imagem traduzida, clique para visualizar a 
original. 
 
 
 
 
 
http://bitesizebio.com/36696/maxam-gilbert-sequencing/
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MÉTODO QUÍMICO 
Tem por princípio a utilização de substâncias 
químicas que cortam a molécula de DNA em 
nucleotídeos específicos. 
MÉTODO ENZIMÁTICO/ 
DE SANGER 
Esta técnica tem como princípio o uso de 
dideoxinucleotídeos/didesoxinucleotídeos 
(ddNTP) marcados e uso de fita simples de 
DNA – 1 primer. 
 
 
O método Sanger de sequenciamento 
promove sequências de alta qualidade para 
trechos relativamente longos (por volta de 
900 pares de base). Entretanto, o método de 
Sanger de sequenciamento é caro e 
ineficiente para projetos de larga escala, 
como o sequenciamento de um genoma inteiro. 
ALTO PARALELISMO 
Muitas reações de sequenciamento 
acontecem ao mesmo tempo. 
 
 
 
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MICROESCALA 
Reações são pequenas e muitas podem ser 
realizadas de uma vez em um chip. 
RAPIDEZ 
Pelas reações serem feitas em paralelo, 
resultados são obtidos muito mais rápido. 
BAIXO CUSTO 
Sequenciar um genoma é mais barato do que 
com o sequenciamento de Sanger 
MAIOR COMPRIMENTO 
Leituras tipicamente variam entre 50-700 
nucleotídeos de comprimento