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CRESCIMENTO E VARIAÇÕES NO CONTEÚDO DE AIA E ABA DURANTE O DESENVOLVIMENTO DO EMBRIÃO ZIGÓTICO DE Ocotea catharinensis Mez. (LAURACEAE) Santa-Catarina, Claudete(1); Silveira, Vanildo(1); Balbuena, Tiago Santana(1); Maranhão, Maria Emília Estelita(2); Floh, Eny Iochevet Segal(1). (1) Laboratório de Biologia Celular de Plantas (BIOCEL), Departamento de Botânica-IB/USP (2) Laboratório de Anatomia Vegetal, Departamento de Botânica- IB/USP. (floeny@ib.usp.br). 1 INTRODUÇÃO A embriogênese zigótica, um processo complexo e organizado, é essencial no ciclo de vida dos vegetais. Este processo pode ser dividido em duas etapas principais: a primeira caracterizada pela divisão celular e diferenciação do embrião, e a segunda caracterizada pela maturação do embrião. Nesta última etapa ocorre o acúmulo dos principais compostos de reserva e a preparação do embrião para a tolerância à desidratação, dormência e germinação (Sallandrouze et al., 2002). Entre os vários fatores que interferem o processo de embriogênese destacam-se os hormônios vegetais, que atuam na regulação e expressão de múltiplos genes durante o desenvolvimento do embrião (Faure et al., 1998; Jiménez, 2001; Chiwocha & von Aderkas, 2002). Dentre os hormônios mais estudados da maioria dos estudos incluem o ácido abscísico (ABA) e o ácido 3-indol acético (AIA) (Rock & Quatrano, 1995; Hess et al., 2002). O ABA atua em diferentes eventos durante o desenvolvimento da semente, incluindo a inibição da germinação precoce, indução da síntese de proteínas de reserva e dormência. Os níveis de ABA geralmente são elevados nos estágios iniciais do desenvolvimento e decrescem durante a maturação do embrião (Rock & Quatrano, 1995). Durante a embriogênese, o AIA tem importância nos eventos de diferenciação e no estabelecimento da simetria bilateral dos embriões (Fischer & Neuhaus, 1996; Kong et al., 1997). Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi avaliar as variações no conteúdo de AIA e ABA durante o processo de desenvolvimento do embrião zigótico de Ocotea catharinensis. 2 MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Material vegetal Frutos de O. catharinensis foram coletados no Parque Estadual da Cantareira – SP, em diferentes períodos após a floração, ocorrida entre maio de 2002 e maio de 2003. Dos frutos foram obtidas as sementes e destas foram isolados embriões zigóticos no estágio 1, com 4 semanas (07/06/02); estágio 2, com 12 semanas (09/09/02); estágio 3, com 24 semanas (9/12/02); estágio 4 com 32 semanas (07/02/03) e estágio 5 com 40 semanas (15/04/03) após a floração (Figuras 1 e 2). Foram utilizados os seguintes materiais para as análises bioquímicas: Estágio 1: embrião em estágio cordiforme inicial incluindo endosperma; Estágio 2: embrião em estágio cotiledonar inicial incluindo endosperma; Estágio 3: embrião em estágio cotiledonar incluindo endosperma; Estágio 4: embrião em estágio cotiledonar (apresentando os cotilédones completamente desenvolvidos); Estágio 5: embrião em estágio cotiledonar maduro. Figura 1 - Aspectos morfológicos do desenvolvimento do fruto de Ocotea catharinensis nos estágios 1 (A), 2 (B), 3 (C), 4 (D) e 5 (E). Setas indicam o hipanto. Figura 2 - Corte longitudinal do fruto de Ocotea catharinensis, mostrando o desenvolvimento do embrião nos estágios 1 (A), 2 (B), 3 (C), 4 (D) e 5 (E). hi = hipanto. ( = endosperma. C = cotilédone. Setas indicam o eixo embrionário. 2.2 Métodos 2.2.1 Determinação de AIA e ABA Para a determinação de AIA e ABA, foram utilizadas amostras de 600 mg de matéria fresca (MF) para os estágios 1 e 2, e 1 g de MF para os estágios 3, 4 e 5, em triplicata. Os níveis de AIA e ABA foram determinados de acordo com a metodologia de Kojima (1996), com modificações (Silveira et al., 2004), utilizando-se cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). 2.2.2 Determinação da matéria fresca (MF) e seca (MS) Foram avaliados os parâmetros MF (mg) e MS (%) a partir de 15 sementes nos estágios 1, 2, 3, 4 e 5. A MS foi determinada após desidratação do material a 70 (C, por 48 h, e a partir dos dados de MF e MS foi estabelecido o conteúdo de MS, expresso em porcentagem [MS (%) = (MS/MF)x100]. 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.2.1 Determinação de AIA e ABA O AIA é a principal auxina encontrada nas plantas, ocorrendo na forma livre ou conjugada (Bandurski et al., 1995), atuando nos processos de alongamento e divisão celular, diferenciação do sistema vascular e no estabelecimento da polaridade do embrião (Liu et al., 1993; Gaspar et al., 1996; Kong et al., 1997). Durante o desenvolvimento da semente de O. catharinensis, observou-se um pico nos níveis de AIA em embriões no estágio 2, seguido de decréscimo contínuo até o estágio 5 (Figura 3A). O padrão de variação nos níveis de AIA observado neste trabalho é aquele característico das sementes em desenvolvimento, quando o valor máximo ocorre durante o crescimento, seguido de redução na semente madura (Bewley & Black, 1994). Os maiores conteúdos de AIA detectados durante o desenvolvimento inicial em sementes de diferentes sistemas vegetais, como por exemplo de Picea glauca, estão relacionados com o crescimento do embrião zigótico (Kong et al., 1997). Sua importância é ressaltada para os eventos de diferenciação e estabelecimento da simetria bilateral dos embriões. Em sementes de A. angustifolia, os maiores valores de AIA livre também ocorreram em tecidos do eixo embrionário nas fases iniciais do desenvolvimento dop embrião (Astarita et al., 2003). O ABA está envolvido na maturação do embrião, no acúmulo de proteínas, na aquisição de tolerância à desidratação e na indução da dormência em sementes (Rock & Quatrano, 1995; Xiong & Zhu, 2003). Durante o desenvolvimento da semente para a maioria das angiospermas, ocorre um aumento no conteúdo de ABA alcançando um ou dois picos, seguido de uma redução considerável após o acúmulo de substâncias de reserva e o início da desidratação da semente (Rock & Quatrano, 1995; Bewley & Black, 1994). Em O. catharinensis, observou-se uma redução nos níveis de ABA nos estágios iniciais de desenvolvimento (estágios 1 e 2), seguido de um acréscimo no estágio 3. Em seguida, ocorreu uma redução no conteúdo de ABA nas sementes contendo embrião no estágio 4, quando os cotilédones completaram o seu desenvolvimento, seguido de um acréscimo no embrião maduro, no estágio 5 (Figura 3B). Este acréscimo nos níveis de ABA nas sementes contendo embrião maduro (estágio 5) não corresponde ao freqüentemente observado para a maioria das angiospermas (Rock & Quatrano, 1995; Bewley & Black, 1994), e sugere a existência de uma possível dormência no embrião destas sementes, no final do seu desenvolvimento. Até o momento não existem dados descritos sobre a dormência do embrião para esta espécie. Pode-se supor que a redução no conteúdo de ABA ocorrerá somente após a abscisão dos frutos, e a permanência destes por um período no solo, anterior à germinação da semente. Rock & Quatrano (1995) mostraram que no final da embriogênese de cevada ocorre uma redução nos teores de AIA paralelamente a um aumento no conteúdo de ABA, bem como um acúmulo de substâncias de reserva, caracterizando a fase de maturação do embrião. Neste trabalho pode-se observar resultado semelhante, sugerindo que esta relação também possa também estar ocorrendo na embriogênese zigótica de O. catharinensis. 0 1000 2000 3000 4000 5000 12345 Estágios de desenvolvimento AIA (ng.g -1 de MF) A 0 20 40 60 80 100 12345 Estágios de desenvolvimento ABA ( g.g -1 de MF) B Figura 3 - Conteúdo de AIA (A) e ABA (B) em embriões zigóticos de O. catharinensis nos estágios 1, 2, 3, 4 e 5 (médias + desvio padrão, n=3). 3.2 Determinação da MF e MS Para a maioria dos sistemas vegetais estudados, durante o final do desenvolvimento da semente ocorre o acúmulo de substâncias de reserva, como proteínas, lipídios e carboidratos, e uma redução no conteúdo de água resultado da desidratação da semente (Bewley & Black, 1994; Rock & Quatrano, 1995). Durante o desenvolvimento da semente de O. catharinensis,observou-se um aumento em MF, estabilizando nas sementes maduras (estágio 5). A porcentagem de MS manteve-se constante até o estágio 4, seguido de um acúmulo nas sementes maduras (Figura 4). Este acúmulo em MS pode ocorrer como resultado da síntese e deposição de substâncias de armazenamento no final do desenvolvimento e do processo de desidratação que ocorre neste período (Bewley & Black, 1994). 0 200 400 600 800 1000 1200 12345 Estágios de desenvolvimento MF (mg) 0 20 40 60 80 100 MS (%) MFMS Figura 4 - Matéria fresca (MF) e matéria seca (MS) em sementes de O. catharinensis nos estágios 1, 2, 3, 4 e 5 (Média + desvio padrão, n=15). 4. CONCLUSÕES Neste trabalho observou-se uma relação entre o conteúdo de AIA e ABA com o processo de embriogênese zigótica, uma vez que as mudanças nos níveis endógenos destes compostos estão associados com as mudanças morfológicas durante o desenvolvimento do embrião zigóticos em O. catharinensis. Observou-se um aumento em MF durante o desenvolvimento da semente, enquanto a MS manteve-se constante até o estágio 4, seguido de um acúmulo nas sementes maduras. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ASTARITA, L.V.; FLOH, E.I.S.; HANDRO, W. Changes in IAA, tryptophan and activity of soluble peroxidases associated with zygotic embryogenesis in Araucaria angustifolia (Brazilian pine). Plant Growth Regulation, Dordrecht, v.39, p.113-118. 2003. BEWLEY, J.D.; BLACK, M. Seeds: physiology of development and germination. 2 ed. New York: Plenum Publishing, 1994. 445p. CHIWOCHA, S.; VON ADERKAS, P. Endogenous levels of free and conjugated forms of auxin, cytokinins and abscisic acid during seed development in Douglas fir. Plant Growth Regulation, Dordrecht, v. 36, p. 191-200. 2002. FAURE, O.; DEWITTE, W.; NOUGARÈDE, A.; VAN OCKELEN, H. Precociously germinating somatic embryos of Vitis vinifera have lower ABA and IAA levels than their germinating zygotic counterparts. 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