Diagnóstico Por Biologia Molecular

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DIAGNÓSTICO POR BIOLOGIA MOLECULAR
Alice Barbosa dos Santos Torres1
Diana Helena Miranda1
Mariana Tavares dos Reis1
Murilo Pozzi Hemerly1
Orlando Vionet de Carvalho1
Sarah Aparecida Ludwig1
RESUMO
Sabendo que os diagnósticos por biologia molecular visam a investigação de alvos de interesse, como o diagnóstico de doenças infeccionas, oncológicas, mutações genéticas, entre outros. À partir da análise do material genético (DNA, RNA) por meio de Reações em Cadeia da Polimerase (PCR), apresentam alta sensibilidade, especificidade na investigação do alvo de interesse e maior reprodutibilidade dos ensaios, reduzindo então o tempo de análise assim como a liberação de resultados mais precisos, desta maneira estão sendo cada dia mais utilizados quando comparados com outras metodologias na clínica veterinária
PALAVRAS-CHAVE: Diagnóstico. Biologia. Molecular.
 DESENVOLVIMENTO
A BIOLOGIA MOLECULAR DE MODO GERAL
Estudos a respeito da biologia molecular tiveram início por volta de 1953 com James Watson e Francis Crick que mostraram a forma tridimensional da molécula do DNA. Essa área dispõe de um imenso campo de conhecimento, porém sua pesquisa volta-se para o âmbito da genética acerca de ácidos nucleicos e sua capacidade de sintetizar proteínas. A necessidade de conhecer e identificar modificações em nível de ácido desoxirribonucleico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA) relacionadas ao indivíduo e sua genética levou a diversas pesquisas que culminaram no diagnóstico por biologia molecular, técnica utilizada para constatar mutações relacionadas a leucemia, doenças infecciosas e hematológicas (LEMOS, 2019; LIMA, 2008).
Existe um conjunto de subdivisões de áreas onde cada uma delas tem uma função específica de pesquisa e estudo e que, juntas, formam a biologia. A biologia molecular faz parte deste conjunto de ramos, provém da união formada entre a bioquímica, genética e biologia celular e nela o organismo é estudado a partir do seu ponto de vista molecular tendo seu foco principal nos ácidos nucleicos, em sua potencial capacidade de sintetizar proteínas e nas atividades biológicas das biomoléculas em geral envolvidas nesse processo (SILVA & NETO, 2015; ZAHA et al., 2014; GIRARDI et al., 2018).
OS ÁCIDOS NUCLEICOS
DNA e RNA são os ácidos nucleicos presentes no organismo e armazenados no meio intracelular, mais especificamente no interior do núcleo celular, estes são compostos por aminoácidos, cadeias de diferentes nucleotídeos ligados que na maioria das vezes se apresenta de forma condensada. O nucleotídeo é uma molécula formada por um grupo de fosfatos, uma base nitrogenada e uma pentose (açúcar composta por cinco carbonos) (GIRARDI et al., 2018).
ESTRUTURA E CARACTERÍSTICAS DOS ÁCIDOS NUCLEICOS
O DNA, ácido desoxirribonucleico, uma molécula extremamente longa com uma desoxirribose e duas fileiras de aminoácidos denominada “dupla hélice”, esta é sintetizada na sequência 5’ – 3’, faz o armazenamento do genoma na maioria das espécies de seres vivos. Sua principal função é preservar, replicar e garantir que a informação genética esteja em condições favoráveis de ser transmitida para futuras gerações de forma que vá ser expressada nestes futuros organismos (ANDRADE et al., 2017; GIRARDI et al., 2018).
Suas bases nitrogenadas são Adenina, Guanina, Citosina e Timina (A, G, C e T respectivamente), estas são organizadas aos pares sendo cada uma delas destinada a outra especifica. Os pares são formado da seguinte forma, Adenina se une com Timina, Guanina se une a Citosina (figura 1) e a união das bases do DNA tem maior estabilidade em comparação com as moléculas do RNA (ANDRADE et al., 2017; GIRARDI et al., 2018). 
Figura 1- Composição do DNA
Fonte: Brasil Escola
RNA, ácido ribonucleico, com a presença de ribose é uma molécula pouco menor e com condições menores de estabilidades em suas moléculas em relação ao DNA, esta é sintetizada na sequência 5’ – 3’. Ainda que não tenha capacidade de fazer auto replicação e sua principal função esteja relacionada a replicação do DNA e síntese de proteínas, em alguns vírus o RNA é tido como principal material genético (GIRARDI et al., 2018).
Como parte de suas peculiares diferenças o RNA possui entre suas bases nitrogenadas uma troca nos agrupamentos de pares, suas bases são Adenina, Guanina, Citosina e Uracila (A, G, C e U respectivamente), organizadas da seguinte forma: Adenina se une com Uracila, Guanina se une a Citosina (figura). Durante a replicação do DNA a Adenina se une a Uracila, esta assume papel de Timina para que seja feita a cópia da fita em questão (GIRARDI et al., 2018; ZAHA et al., 2014).
Figura 2- Composição do RNA
Fonte: Brasil Escola
REPLICAÇÃO
O processo de replicação consiste em separar duas fitas moldes e a partir delas produzir novas fitas. É um processo que abrange a participação de várias enzimas e proteínas para garantir a eficácia do mesmo. (RIBEIRO, 2009)
Inicialmente a enzima DNA helicase irá realizar a separação das fitas de DNA que compõem a dupla hélice por meio da quebra das pontes de hidrogênio denominadas origem de replicação. A enzima helicase ainda possibilita a formação de uma bolha no arcabouço do DNA, denominada forquilha de replicação, esta após ser aberta possibilita a ação da RNA polimerase em nível de DNA na qual utilizará esta última como molde para produzir uma sequência de nucleotídeos que atuarão como primers, dando início a síntese da nova fita (BECKÉR, 2018; RIBEIRO, 2009).
Então a DNA polimerase catalisa a soma de nucleotídeos tri-fosfatados no sentido 5’ para 3’ (fita líder) e a outra ocorre no sentido 3’ para 5’ (fita reparada) devido as hélices serem antiparalelas. A forquilha irá se deslocar, proporcionando a síntese do restante da hélice (BECKÉR, 2018; RIBEIRO, 2009).
A fita líder a DNA polimerase irá catalisar a polimerização por meio de um primer, enquanto a fita retarda tem sua síntese por meio dos Fragmentos de Okasaki (fragmentos de DNA) que se ligam a fita molde e permitem a replicação e é assim denominada por dispor de uma velocidade inferior a fita líder para ser formada (BECKÉR, 2018; RIBEIRO, 2009).
Figura 3- Replicação do DNA
Fonte: RIBEIRO (2009. p 40)
EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE DNA
Para a clonagem celular temos um processo simples e necessário no isolamento de DNA cromossomal ou plasmidial. Muitas técnicas são utilizadas para fazer o isolamento de DNA, mas só isolam um tipo de DNA por extração. A purificação e basicamente a divisão do DNA a partir dos resíduos celulares e das proteínas, exclusivamente as DNAses. De acordo com o tipo de células são necessários diversos reagentes e substancias. A mistura de dois solventes orgânicos o fenol e o clorofórmio podem retirar as proteínas, onde esses solventes atuam como desproteinizantes condenar a integridade celular alterando as proteínas colocando os ácidos nucleicos em solução aquosa (LIMA, 2008).
Pode se dizer basicamente que os processos de preparação de DNA, de uma célula bacteriana por:
1°- Cultivar as células no meio de cultura, centrifugação, concentrada no menor volume
2°- Rompimento da célula, conteúdo exposto fora da célula, formação de um extrato
3°- Tratar os estratos celulares onde os componentes são eliminados, exceto o DNA
4°- Por precipitação o DNA é reunido e deixado em solução aquosa
(LIMA, 2008).
PCR
A reação em cadeia de polimerase (PCR) é utilizada para fazer cópias de determinadas partes características do DNA, in vitro (tubos de saios, ao invés do organismo). A PCR requer uma enzima de DNA polimerase que produza novas fitas de DNA utilizando as existentes como molde, a DNA polimerase tradicionalmente utilizada na reação em cadeia de polimerase é nomeada por, Taq polimerase, pois estar relacionada com a bactéria resistente a alta temperatura (ao calor) da qual ela foi isolada (Thermus aquaticus), a Taq polimerase alcança produzir DNA apenas quando é ofertado um primer, uma sequência curta de nucleotídeos que proporciona um sinal de partida para a produção de DNA. Em uma reação de PCR, o cientista determina a região do DNA que será transpassada,ou amplificada, pelos primers que ela ou ele escolher. Os primers de PCR são pequenos pedaços de DNA de fita simples, comumente por volta de vinte nucleotídeos (LIMA,2008).
As etapas da PCR, reuni o DNA molde, primers, Taq polimerase e o nucleotídeo que são blocos que compõem o DNA em um tubo de ensaio em companhia com cofatores de que a enzima precisa, e passam por constantes etapas de aquecimento e resfriamento que autorizam que o DNA seja sintetizado (LIMA,2008).
1º passo (96º C) Desnaturação do ácido desoxirribonucleico em elevada temperatura devido a ruptura das pontes de hidrogênio, proporcionando molde de fita simples, para próxima etapa
2º passo (55- 60º) Anelamento, resfriamento da reação proporcionando aos primers ligação entre as sequências contingente do DNA molde de fita simples
3º passo (72-75ºC) - Aumenta temperatura da reação para que a Taq polimerase prolongue os primers, produzindo novas fitas de DNA
(LIMA, 2008).
PCR EM TEMPO REAL 
Quando comparado com novas tecnologias, o teste qPCR ou PCR em tempo real tem a vantagem de não precisar da eletroforese, é o mais rápido e pode processar um número grande de amostras. Em sua grande maioria os equipamentos da qPCR são com preços reduzidos e portáteis, e é possível identificar vários agentes em um mesmo teste, geralmente em menos de 30 minutos, e quando é analisada uma amostra de vírus é possível obter resultados com aproximadamente 1:30H. Temos então como vantagem, permitir o diagnóstico mais rápido que o diagnóstico por isolamento ou cultivo do microrganismo (FRAGA,2009).
 É baseado na detecção e quantificação em tempo real da fluorescência emitida na mesma proporção a síntese do produto de PCR (FRAGA,2009).
Atualmente este teste está sendo empregado para Leishmania, Borelia burgdorferi, Toxoplasma gondii, Neospora caninum, e isto se dá pela marcação que pode ser feita utilizando o sistema Taq-Man que se faz através de sondas fluorescentes ás reações do teste, logo, à medida em que o DNA ou RNA é amplificado este nível de fluorescência crescerá na mesma proporção, ou então uma molécula fluorescente que irá se intercalar, ou seja, tem dois marcadores fluorescentes, um em cada extremidade da sonda. À medida em que a enzima Taq polimerase avança, sintetizando a fita nova de DNA, ela vai degradando a sonda à sua frente, liberando o fluorocromo e permitindo que este absorva energia e emita luz, A energia para a excitação dos fluorocromos provem de um feixe de laser que atravessa a amostra no equipamento de PCR em tempo real O teste de qPCR nos permite o diagnóstico e identificação de microorganismo com a diferenciação de cepas e espécies de vários microorganismos de importância na medicina veterinária, através da análise das curvas de dissociação dos produtos. (FRAGA, 2009)
ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE
A eletroforese em gel de agarose é uma das técnicas utilizadas para pesquisa em laboratório empregada na área da biologia molecular sobre DNA e também de outras macromoléculas, como RNA e proteínas, seu objetivo é a separação e a identificação dessas moléculas. (LIMA, 2008)
Para realização da eletroforese, é introduzida uma amostra de DNA em pequenos poços localizados numa das extremidades da cuba de eletroforese, equipamento aonde é realizada a técnica, então uma corrente elétrica é aplicada sobre o gel de agarose de modo que a migração ocorra conforme o seu tamanho, forma ou carga, no caso do DNA, que é uma molécula carregada negativamente, a migração ocorre para o polo positivo onde fragmentos de menor massa tendem a migrar mais facilmente. O gel forma uma malha que funciona como uma peneira dificultando a passagem do DNA de um polo para outro, fragmentos maiores sofrem maior resistência e migram mais devagar. (VERSOLA, 2017)
Após a migração todas as moléculas de mesmo tamanho ficam agrupadas em umas determinadas regiões do gel, moléculas menores estão mais próximas do polo positivo, enquanto as moléculas maiores próximas do polo negativo. Depois que todo esse processo termina os fragmentos de DNA são coloridos com brometo de etídeo, associado ao uso de radiação ultravioleta. Dessa forma pode-se visualizar as bandas que correspondem ao DNA. (LIMA, 2008)
PLASMÍDEOS OU VETORES DE CLONAGEM 
Os plasmídeos são moléculas de DNA circular extracromossomal que apresentam a capacidade de se replicar independentemente do cromossomo do hospedeiro presentes em todas as espécies de bactérias, assumem um papel de adaptador, é neles aonde se encontram o gene de resistência a antibióticos, para serem utilizados como vetores de clonagem necessitam de 3 características. (LIMA, 2008)
· ter uma origem de replicação, que consiste numa sequência de DNA que permite a replicação do vetor na célula hospedeira, permitindo a proliferação de centenas de cópias por célula.
· Possuir vários sítios de clonagem, ou seja, um sítio de clivagem para endonucleases de restrição, onde é inserido um fragmento de DNA que não vai interferir na funcionalidade do plasmídeo.
· Marca seletiva que se refere à preparação do meio de cultura, é adicionado um antibiótico onde as bactérias estão crescendo, são utilizados genes que conferem resistência a um antibiótico, exemplo o gene que confere resistência à ampicilina. Assim, as células que possuem este gene são capazes de crescer em meios com ampicilina, enquanto que as restantes não sobrevivem, proporcionando a seleção de célula não-transformada (sensível ao antibiótico) da célula transformada (resistente ao antibiótico).
 (LIMA, 2008)
CONCLUSÃO
O conhecimento sobre o diagnóstico por biologia molecular vem sendo cada vez maior e mais utilizado no dia a dia do médico, o mesmo se faz de suma importância para o diagnóstico de doenças terminais ou não, identificadas somente através do DNA e RNA, que estão cada dia mais comuns, tendo milhares de métodos para o diagnóstico por biologia molecular, sendo inapropriado colocar todos em um resumo expandido. 
REFERÊNCIAS
ANDRADE, A. E. B.; BIZARRO, C. V.; RENARD, G. Biologia molecular da célula. Porto Alegre: Artmed, 2017.
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FRAGA, T. L. PCR EM SANGUE PERIFÉRICO COMO FERRAMENTA NO DIAGNÓSTICO E NO CONTROLE DE CURA DA LEISHMANIOSE VISCERAL EM CRIANÇAS. Campo Grande,2009.
FREITAS, F. A. D.; SIQUEIRA, H. R.; ALBANO, R. M. Métodos moleculares no diagnóstico da tuberculose e na resistência do Mycobacterium tuberculosis às drogas. Rio de Janeiro: Pulmão, 2009.
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LEMOS, M. Diagnóstico molecular: o que é, para que serve e como é feito. Tua saúde, 2019.
LIMA, L. M. Conceitos básicos de Técnicas em Biologia Molecular. Embrapa. Paraíba, 2008
OVIGLI, D. F. B.; BOSSOLAN, N. R. S.; BELTRAMINI, L. M. BIOLOGIA MOLECULAR NA EDUCAÇÃO BÁSICA: EXPLORANDO POSSIBILIDADES DE APRENDIZAGEM EM UM ESPAÇO NÃO FORMAL. São Paulo: São Carlos, 2009.
PINHO, M. S. L. Pesquisa em Biologia Molecular: Como Fazer? Mato Grosso: Revista Brasileira de Coloproctologia, 2006.
RIBEIRO, M. C. M. Genética Molecular. Florianópolis: Universidade Federal de Santa Catarina, 2009.
ROTTA, L. N.; ANDRIGHETTI, L. H. Biologia molecular e biotecnologia. Porto Alegre: SAGAH, 2018.
SILVA, A. M.; NETO, L. M. R. Biologia molecular. Rio de Janeiro: Roca, 2015.
ZAHA, A.; FERREIRA, H. B.; PASSAGLIA, L. M.; Biologia molecular básica. Porto Alegre: Artmed, 2014.
1 Discentes do curso de Medicina Veterinária da Faculdade Multivix – Castelo.
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