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Aula 02 Preparo de Vidraria, Reagentes e Soluções p/ EBSERH (Biomédico) Professor: Denise Rodrigues 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 1 de 56 AULA 01: Equipamentos II SUMÁRIO PÁGINA 1. Saudação Inicial 01 2. Citômetro de Fluxo 02 3. Termociclador 13 4. Cromatografia 17 5. Eletroforese 27 6. Filtros, Destiladores e Purificação de Água 30 7. Lista de Questões 42 8. Gabarito 54 9. Referências Bibliográficas 55 Apresentação Olá pessoal! Essa é a segunda aula de nosso curso sobre “equipamentos, vidraria, reagentes e soluções”. Vamos estudar os seguintes equipamentos/técnicas: citômetros de fluxo, termocicladores, cromatógrafos, eletroforese, filtros, destiladores e purificadores de água. Preparados? Vamos lá! 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 2 de 56 Citômetro de Fluxo A citometria de fluxo é uma técnica que permite a verificação simultânea de múltiplas propriedades de células isoladas em suspensão. É possível detectar e quantificar antígenos de superfície celular, citoplasmáticos e nucleares. Nessa técnica, utiliza-se o citômetro de fluxo, um equipamento onde as células são orientadas num fluxo laminar de passagem e interceptadas uma a uma por um feixe de luz (laser). As modificações ocasionadas nesse feixe de luz devido a passagem das células são então detectadas e mensuradas por sensores (detectores) presentes no citômetro de fluxo. O sistema óptico de detecção faz a leitura e permite identificar as células pelo seu tamanho e granularidade interna. Hemácias, plaquetas, linfócitos, monócitos e granulócitos podem ser assim identificados e quantificados (ver figura abaixo). Citômetro de Fluxo: equipamento que permite análise das características físicas das células – tamanho e complexidade interna. FSC (Forward Scatter): detector na linha do feixe de luz (laser) SSC (Side Scatter): detector perpendicular ao feixe de luz 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 3 de 56 Na citometria de fluxo, semelhante à técnica de imunofluorescência, podem ser utilizados diferentes fluorocromos, os quais absorvem a luz e a emitem num comprimento de onda maior e específico. Cada fluorocromo possui um padrão espectral distinto de absorção e emissão, de tal maneira que várias cores de luz podem ser opticamente separadas com os filtros seletivos, dependendo do equipamento de citometria em questão. O uso de diferentes detectores de fluorescência permite o estudo simultâneo de vários antígenos celulares, utilizando-se anticorpos monoclonais específicos marcados com diferentes substâncias fluorescentes (em geral através da técnica direta).Os fótons de luz atingem detectores específicos e são convertidos em impulsos elétricos proporcionais ao número de fótons recebidos. Estes impulsos são convertidos em sinais digitais podendo oferecer os resultados em diferentes formas de análise tais como histogramas, gráfico de pontos (dot plot), tabelas, dentre outros. (ver figura abaixo) Figura: representação esquemática de funcionamento de um Citômetro de Fluxo 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 4 de 56 Figura: citômetro de fluxo. A citometria de fluxo é uma técnica rápida, precisa, quantitativa, reprodutível e passível de realização em um grande número de células. Possibilita a caracterização imunofenotípica/imunofenotipagem. Mas o que é imunofenotipagem? Anota ai: A imunofenotipagem é uma técnica utilizada na identificação e distinção de tipos celulares. Para tanto, utiliza anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos para analisar qualitativa e quantitativamente padrões de expressão de antígenos celulares (chamados “clusters of differentiation” ou CD). Cada tipo de célula de nosso corpo possui um padrão próprio de expressão de antígenos, assim é possível identificar com precisão a célula de interesse. Com uso do citômetro de fluxo e das técnicas de imunofenotipagem, é possível conhecer o tipo exato de células de 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 5 de 56 uma amostra, identificar sua linhagem e estado maturativo, por exemplo. Isso pode ser feito em amostras de medula óssea, sangue periférico, linfonodo, líquor cefalorraquidiano e diversos tecidos. A imunofenotipagem por citometria de fluxo pode ser realizada a fim de diagnosticar e classificar doenças onco-hematológicas como as leucemias e linfomas, mieloma múltiplo. A técnica também pode ser usada na avaliação de recuperação imunológica pós-transplante de medula, na quantificação de células-tronco CD34 positivas para transplante, na avaliação de subpopulações linfocitárias em pacientes HIV positivos ou com deficiências imunológicas hereditárias, além de inúmeras outras indicações. A citometria de fluxo também permite o isolamento de diferentes populações celulares com distintos antígenos de superfície. De que forma? Quando uma suspensão de células marcadas é colocada em um separador de células ativado por fluorescência (FACS), o aparelho é capaz de determinar a intensidade da fluorescência de cada célula e separa-las conforme sua emissão fluorescente característica. Os anticorpos monoclonais utilizados na Citometria de Fluxo são habitualmente submetidos aos critérios do International Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens, ocasião em que um grupo de laboratórios de referência avalia, caracteriza e classifica os anticorpos. Uma vez aceitos por este colegiado, esses anticorpos recebem a designação CD (cluster of differentiation). Cada CD pode ser representado por vários anticorpos monoclonais que reconhecem o mesmo antígeno, mas não necessariamente o mesmo epítopo. Fluorocromo/fluoróforo: fluorocromo ou fluoróforo é um composto que emite luz de um certo comprimento de onda (┡) quando excitado 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 6 de 56 por uma luz de um outro ┡. Cada ┡ corresponde também a uma coloração. A tabela abaixo mostra alguns fluoróforos: Tabela: Fluoróforos com os seus ┡s de excitação, emissão e coloração. Fluoróforos com características diferentes tornam possível marcar antígenos diferentes com cores diferentes em um mesmo tecido ou célula, permitindo a observação simultânea de dois ou mais componentes. Agora vamos praticar! Treinar a resolução de questões de prova é fundamental para consolidar o que foi aprendido e adquirir segurança. 1. (2010/FGV/FIOCRUZ/Tecnologista em Saúde - Operação e Manutenção de Plataformas Tecnológicas) CD4 e CD8 são receptoresde membrana associados à caracterização de linfócitos T do sistema imunológico. A contagem de células expressando CD4 (CD4 positivas) é um dos parâmetros analisados em pacientes HIV positivos, visto que o HIV infecta estas células. A contagem de células CD4 positivas é comumente obtida através de citometria de fluxo. Desta forma, o número reduzido de células CD4 positivas é um dos preditores para que o paciente entre no protocolo de tratamento utilizando anti- retrovirais contra HIV. Avalie os gráficos (dot plot) analisados por 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 7 de 56 citometria de fluxo provenientes de dois pacientes HIV positivos (A e B) com diferentes números de contagem de células CD4 positivas. Assinale a alternativa correta. a) Neste experimento, as células CD4 positivas foram identificadas utilizando anticorpos específicos contra os receptores de membrana CD4 conjugados com o fluoróforo PerCP. b) As células identificadas pelo número 3 representam as células duplamente positivas, expressando os receptores de membrana CD4 e CD8. c) O paciente B possui o menor número de contagem de células CD4 positivas e, portanto, deve entrar no protocolo de tratamento utilizando anti-retrovirais contra HIV. d) As células identificadas pelo número 1 representam as células expressando os receptores de membrana CD4. e) Estas análises foram obtidas utilizando apenas um canal de fluorescência do citômetro de fluxo. Comentário: questão interessante, que exige do candidato muito mais capacidade de interpretação e análise do que a mera retenção de conteúdo ou “decoreba”. Por isso é tão importante treinar todos os tipos de questão! O que vocês acharam? Eu achei muito boa! Vamos analisar item por item. A resposta sobre a alternativa A está no próprio gráfico. No eixo X (horizontal) podemos verificar que as células CD4 positivas foram identificadas utilizando anticorpos 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 8 de 56 específicos contra CD4 conjugados com o fluoróforo “FITC” e não o “PERCP”. Letra B é a alternativa correta! Sim, as células identificadas como “3”, na posição do gráfico em que se encontram indica que foram marcadas com anticorpos para os receptores CD4 e CD8, expressam os dois. Letra C errada pois o paciente B apresenta uma maior contagem de células CD4, conforme podemos verificar na população identificada como “2” no gráfico. Letra D também errada, identificadas como “1” estão as células expressando receptores CD8. Letra “E” errada, uma vez que foram usados dois anticorpos conjugados com fluoróforos diferentes e, portanto, diferentes detectores de fluorescência. Gabarito: B. 2. (2013/IBFC/EBSERH/Biomédico) Os equipamentos laboratoriais capazes de identificar células e determinar o seu fenótipo, além de analisar o conteúdo nuclear de DNA são denominados: a) Citômetros de fluxo. b) Espectrofotômetros de massa. c) Espectrofotômetros de chama. d) Termocicladores. Comentário: a descrição do enunciado é compatível com citômetros de fluxo, uma vez que estes equipamentos permitem a determinação simultânea de múltiplas propriedades de células isoladas em suspensão (dentre elas a detecção e quantificação de antígenos celulares nucleares) e possibilitam a imunofenotipagem. Gabarito: A. 3. (2010/FGV/FIOCRUZ/Tecnologista em Saúde – Imunologista) O citômetro de fluxo é um equipamento que pode ser utilizado para investigar a presença de células tumorais leucêmicas residuais na medula óssea pois: a) permite a análise do volume celular. 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 9 de 56 b) permite a análise da apoptose destas células. c) permite a análise de um grande número de células da medula. d) permite análise de um número máximo de 1000 células. e) utiliza a autofluorescência espontânea deste tipo celular para identificá-lo. Comentário: considerando que a intenção é investigar a presença de células tumorais residuais na medula óssea, podemos descartar todas as alternativas, exceto a letra C. Letra “a” e “b” são análises que podem ser feitas por citometria de fluxo, porém, não tem relação com o que está sendo questionado. Letra “d” e “e” estão totalmente incorretas. Gabarito: C. 4. (2015/AOCP/EBSERH-HC-UFG/Biomédico) Qual é o equipamento cuja análise permite a identificação direta do fenótipo celular, usando anticorpos marcados com moléculas fluorescentes, podendo medir múltiplos parâmetros como o espalhamento frontal, o espalhamento lateral e a intensidade de fluorescência em diversos comprimentos de onda? A) Potenciômetro. B) Citômetro de fluxo. C) Espectrofotômetro. D) Destilador filtrante. E) Imunodifusor radial. Comentário: questão direta e que traz uma boa descrição de um citômetro de fluxo. Gabarito: B. 5. (2015/COVEST/UFPE/Biomédico) A imunofenotipagem é uma técnica utilizada na identificação e na distinção de tipos celulares. Para tanto, utiliza anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos para analisar qualitativa e quantitativamente padrões 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 10 de 56 de expressão de antígenos celulares chamados “clusters of differentiation” ou CD. Cada tipo de célula de nosso corpo possui um padrão próprio de expressão destes antígenos; assim, é possível identificar com precisão a célula de interesse. Esta técnica é muito utilizada nos diagnósticos hematológicos, principalmente, de leucemias e linfomas. Também é utilizada no monitoramento de doenças infecciosas como a AIDS. Nesse contexto, é correto afirmar que: A) a citometria de fluxo é o método preferencial para a imunofenotipagem das doenças hematológicas malignas, pois permite detectar a presença de vários antígenos numa mesma célula, e fazer uma análise rápida de um grande número de células. B) a base para a classificação imunológica das leucemias é a combinação de anticorpos policlonais usados para determinar o perfil imunofenotípico de populações celulares. C) a presença de um antígeno diferente do esperado para determinado tipo celular e seu estágio de maturação, ou o aumento/diminuição da sua expressão, não é determinante da existência de um clone anormal. D) a imunofenotipagem é uma técnica que se resume à detecção de antígenos de superfície expressos por células leucêmicas. E) a imunofenotipagem pela citometria de fluxo é um teste complementar, pois não é utilizada para o diagnóstico diferencial. Comentário: já na letra A encontramos a sentença correta que a questão nos pede. Na letra B o erro é que, na verdade, são utilizados anticorpos monoclonais. A letra C está incorreta porque as alterações citadas podem sim indicar a presença de um clone celular anormal. A letra D está errada porque a imunofenotipagem é utilizada na identificação e distinção de tipos celulares por meio da utilização de anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos para analisar qualitativa e quantitativamente padrões de expressão de antígenos celulares e isso vale para qualquer célula de interesse, não apenas 26274965572- roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 12 de 56 a citometria tem como vantagem a possibilidade de avaliar múltiplos parâmetros celulares de forma individual. Gabarito: D. 7. (2017/IBFC/EBSERH-HUGG-Unirio/Biomédico) Assinale a alternativa correta sobre o manuseio e características dos citômetros de fluxo. a) Quando houver mais que um citômetro de fluxo realizando exames de rotina em determinado laboratório, deve-se realizar uma comparação de desempenho entre os equipamentos a cada dois anos. b) Cada fluorocromo tem um espectro de excitação e emissão único que determina em parte o desempenho e característica do anticorpo monoclonal e direciona quais fluorocromos podem ser utilizados simultaneamente. c) A verificação diária da intensidade de fluorescência e coeficiente de variação da fluorescência de partículas estáveis, bem como do ruído do equipamento com partículas não fluorescentes, não é necessária se o laboratório realiza apenas análise de amostras suspeitas para neoplasias hematológicas. d) A maioria dos instrumentos de citometria apresenta um carryover (carreamento) declarado pelo fabricante de, aproximadamente, 20% e) O tamanho das células é medido através da corrente elétrica (intensidade de pulso) e quanto maior a corrente elétrica, menor é o tamanho da célula. Comentário: nesta questão, a alternativa correta é a letra B. As alternativas D e E não tem relação com citometria de fluxo. A letra A não faz sentido. E a letra C é incorreta, os controles devem ser realizados sempre. Gabarito: B. 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 14 de 56 solução tampão. Este material vai para o termociclador, aquecendo e esfriando o material ali contido em ciclos de temperatura pré- estabelecidos. - Primeiramente, o tubo é aquecido a uma temperatura entre 90° a 96°C para que ocorra a desnaturação do DNA (separação das fitas). Depois, a temperatura do termociclador cai (50° a 60°C) para que haja a hibridização ou anelamento. Neste ponto do procedimento, os primers se ligam com especificidade às suas sequências complementares do DNA. Subsequentemente, há uma elevação da temperatura a aproximadamente 72°C para que ocorra a síntese pela polimerase (fase de extensão de uma nova molécula). Em seguida, um novo ciclo é iniciado. Normalmente são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação, apresentado taxa de replicação exponencial. - A análise do resultado é feita por meio da eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida, sendo interpretada por um profissional treinado. - A contaminação do material por substâncias que conhecidamente inibem a reação, como é o caso da hemoglobina, ou a contaminação por um material genético que não está sendo estudado são problemas técnicos que podem interferir no resultado da PCR. Certas medidas, como o uso de luvas e tubos descartáveis, são necessárias. Figura: termociclador. 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 15 de 56 8. (PR-4 Concursos/2012/Técnico em Farmácia) A reação de amplificação em cadeia (PCR) é uma metodologia que pode ser utilizada em vários testes laboratoriais. O equipamento que realiza esses testes, o termociclador, apresenta como característica principal: a) a manutenção da temperatura em 4º C durante o teste; b) a variação de comprimentos de onda na faixa UV num intervalo de tempo; c) a manutenção de temperaturas abaixo de zero por longos períodos de tempo; d) o aumento e diminuição de temperatura rapidamente e em períodos de tempo predeterminados; e) a variação de comprimento de onda e temperatura de modo sincronizado. Comentário: lembre-se no termociclador é possível realizar ciclos de diferentes temperaturas. Letra D! Gabarito: D. 9. (IBFC/2013/PC-RJ/Perito Criminal – Biologia) A técnica de PCR (reação em cadeia de polimerase) em tempo real revolucionou o processo de quantificação de fragmentos de DNA. Ela realiza a quantificação desses ácidos nucleicos de maneira precisa e com maior reprodutividade. Assinale o fator que permite essa quantificação: a) O sequenciamento do DNA. b) A eletroforese. c) A fluorescência. d) Os marcadores STRs e) O termociclador. 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 16 de 56 Comentário: questão que pode confundir quem está com muita pressa ou nervoso na hora da prova. Nada de marcar termociclador nessa questão! A pergunta é sobre o fator que permite a quantificação de ácido nucleico na técnica de PCR em tempo real. A diferença do PCR em tempo real (qPCR/quantitative PCR ou RT PCR/Real Time PCR) para a PCR tradicional é a presença, no primeiro, de algum elemento fluoróforo (SYBR Green ou sondas Taqman) que sinaliza o momento da formação das duplas fitas em cada ciclo, emitindo fluorescência. Dessa forma, tem-se uma ideia da quantidade de DNA formado enquanto a reação acontece sem a necessidade de eletroforese ao final dos ciclos. Gabarito: C. 10. (2016/IBFC/EBSERH-HUPEST-UFSC/Biomédico) Para que ocorra a amplificação, com a síntese de novas fitas de DNA, as amostras devem ser submetidas à combinação adequada de temperatura e de tempo. Cada ciclo da reação em cadeia da polimerase (PCR) apresenta três fases fundamentais que ocorrem em temperatura diferente, durante a incubação. Assinale a alternativa correta que indica qual equipamento ocorre a incubação e cada uma dessas fases. a) termociclador / separação, identificação e purificação b) centrífuga refrigerada / preparação, separação e precipitação c) espectrofotômetro / concentração, pureza e análise da densidade óptica d) termociclador / desnaturação, anelamento e extensão e) cuba eletroforese / separação, identificação e purificação Comentário: conforme estudamos, no termociclador ocorrem as três fases: desnaturação, anelamento e extensão. Gabarito: D. 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 18 de 56 Cromatografia Gasosa (CG): consiste na “vaporização” (sem que haja decomposição) da substância em um gás chamado gás de arraste (fase móvel) e posterior migração através de uma coluna de cromatografia. Esse gás deve, obrigatoriamente, ser inerte em relação à fase estacionária. Gases como hidrogênio, nitrogênio, argônio e hélio são os mais utilizados. As substâncias saem então da coluna e passam por um detector que gera um sinal proporcional à quantidade de substância eluída no gás em função do tempo (análise quantitativa). Por exemplo, em uma mistura, cada componente terá sua pressão de vapor característica (volatilidade), assim substâncias que forem mais voláteis, ficarão dissolvidas no gás de arraste e passarão mais rapidamente pela coluna cromatográfica. Trata-se de uma técnica muito utilizada pois é capaz de separar substâncias com concentrações de nanogramas e até picogramas. A cromatografia gasosa é usada no fracionamento de proteínas,enzimas, peptídeos e aminoácidos. Figura: cromatografia gasosa 26274965572 - roger mendonça ==9fe7d== Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 20 de 56 em sua composição íons que irão interagir quimicamente com os íons presentes na solução da fase móvel. Após a interação dos íons da amostra com a resina, uma solução chamada eluente é passada pela coluna de cromatografia liberando assim os íons que estavam interagindo com a resina. O tempo de retenção/separação das diferentes espécies é que determinará a concentração dos diferentes íons na amostra. Antes de passar pelo detector, as amostras passam por uma segunda coluna cromatográfica, a coluna supressora de eluente, que irá bloquear a detecção de íons que por ventura possam fazer parte da constituição do eluente e que poderiam interferir na concentração iônica real da amostra; ou seja, somente os íons da amostra são encaminhados para análise. Desvantagens: técnica de custo extremamente elevado e que requer mão de obra altamente especializada na operação do sistema e análise de dados. É usada para fracionar peptídeos, aminoácidos, hemoglobinas e hemoglobina glicada. Figura: cromatografia iônica 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 21 de 56 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC): HPLC é a sigla dos termos em inglês High Performance Liquid Chromatography. Atualmente é chamada de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Tem como características: elevada sensibilidade, a alta velocidade de reação e o grande desempenho com confiabilidade e rapidez na liberação de resultados. Trata-se de um tipo de cromatografia que utiliza um líquido como fase móvel, que é injetado na coluna cromatográfica a altas pressões e diferentes tipos de fase estacionária, variando de acordo com aquilo que se quer analisar. A fase móvel (líquida) movimenta-se continuamente através da coluna contendo a fase estacionária (sólido). O soluto interage com as fases estacionária e móvel por adsorção, partição, exclusão molecular, troca iônica. As separações na CLAE podem se dar por adsorção (separação sólido-líquido), partição (separação líquido- líquido) ou ambos. Os constituintes da fase estacionária, em geral, se encontram altamente particionados, o que gera uma separação mais eficiente. É composta de: reservatórios para os reagentes, bombas que propulsionam a fase móvel a altas pressões, injetor de amostra, coluna cromatográfica e um detector acoplado a um computador. O detector mais utilizado para separações por CLAE é o detector de ultravioleta (absorção da luz na faixa UV – visível), sendo também empregados detectores de fluorescência, de índice de refração, e eletroquímicos, entre outros. A técnica de HPLC é a base para o entendimento e realização de outras técnicas como a cromatografia gasosa e de troca iônica. A utilização de partículas ainda mais finas (0,1 nm) e pressões ainda mais elevadas (15.000 psi) tem gerado o que se chama de CLUE (Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência). É usada principalmente para fracionar hemoglobinas e hemoglobina glicada. Pode ser usada para proteínas, peptídeos e aminoácidos. 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 22 de 56 Figura: HPLC Cromatografia de Afinidade: uma característica importante de muitas moléculas é a sua capacidade de se ligar a moléculas específicas de uma forma não covalente. Esta propriedade pode ser usada na purificação de proteínas e outras moléculas através da cromatografia de afinidade. Nesta técnica, o agente conhecido como ligando, que se liga especificamente à molécula (ex: proteína) de interesse, está covalentemente ligada a uma matriz inerte e porosa. Quando uma mistura passa através deste material cromatográfico, a proteína de interesse liga-se ao ligando imobilizado na matriz, enquanto outras substâncias são eluídas ao longo da coluna com o tampão. A proteína-alvo pode assim ser recolhida numa forma altamente purificada a partir da alteração das condições de eluição até que a proteína seja libertada da matriz cromatográfica. A grande vantagem da cromatografia de afinidade é a sua capacidade de explorar as propriedades únicas das proteínas e de outras moléculas. 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 24 de 56 em gel ou cromatografia em gel, embora a fase estacionária não se restrinja a um gel. 11. (2013/IBFC/EBSERH/HUB/Biomédico) Assinale a alternativa correta sobre o método de separação denominado cromatografia. a) A cromatografia líquida de alta eficiência emprega bombas de alta pressão para a eluição da fase móvel. b) A grande limitação da Cromatografia líquida clássica é a necessidade de que a amostra seja volátil ou estável termicamente. c) O detector mais utilizado para separações por Cromatografia gasosa de alta resolução é o detector de ultravioleta. d) Cromatografia em papel é uma técnica baseada na adsorção irreversível das substâncias em questão. Comentário: na letra A não temos erros, é nossa alternativa correta. Letra B descreve a cromatografia gasosa e não a líquida clássica. Letra C também errada, pois esse tipo de detector é o mais utilizado na cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ou HPLC). E a letra D não se trata de adsorção e muito menos irreversível, mas sim de migração diferencial sobre a superfície de um papel de filtro. 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 25 de 56 Gabarito: A. 12. (2017/AOCP/EBSERH-HUJB-UFCG/Biomédico) A cromatografia é um processo físico-químico de separação de misturas que se divide em duas fases que são: a) fase de promoção e fase móvel. b) fase de progressão e fase estacionária. c) fase estacionária e fase líquida. d) fase móvel e fase de iniciação. e) fase estacionária e fase móvel. Comentário: a cromatografia é uma técnica quantitativa e tem por finalidades a identificação de substâncias e a separação-purificação de misturas, usando propriedades como solubilidade, tamanho e massa. Para o processo de separação de misturas, esta passa por duas fases sendo uma estacionaria (fixa, sendo um material poroso como um filtro) e outra móvel (como um liquido ou um gás, que ajuda na separação da mistura), sendo que os constituintes dessa mistura interagem com as fases através de forças intermoleculares e iônicas, fazendo a separação. Gabarito: E. 13. (2015/AOCP/EBSERH-HC-UFG/Biomédico) Proteínas, tais como o DNA e o RNA, são rotineiramente separadas e isoladas por cromatografia. Qual é a base de separação dos componentes na cromatografia por afinidade? A) Tamanho molecular. B) Sítio de ligação natural. C) Carga. D) Diferença de potencial. E) Pressão osmótica. Comentário: bem, DNA e RNA são ácidos nucléicos e não proteínas.Isso posto, é importante saber que a cromatografia de afinidade 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 26 de 56 baseia-se na ligação entre o ligando e a molécula de interesse e essa ligação ocorre devido a existência de sítios de ligação entre esses moléculas. Destacando que é algum tipo de ligação não covalente, de modo que é possível eluir posteriormente e obter a molécula de interesse. Gabarito: B. 14. (2016/IBFC/EBSERH-HUPEST-UFSC/Biomédico) A citometria de fluxo é uma técnica utilizada para contar, examinar e classificar partículas microscópicas suspensas, em fluxo, em um meio líquido. Permite a análise de vários parâmetros simultaneamente, sendo conhecida também por “citometria de fluxo multiparamétrica”. A versão mais aplicada da citometria de fluxo é denominada FACS (fluorescence-activated cell sorter, separador de célula ativado por fluorescência), que foi projetada para automatizar a análise e a separação das células coradas com anticorpo fluorescente. Assinale a alternativa que não corresponde às propriedades analisadas pelo equipamento nos sistemas celulares. a) Tamanho; b) Propriedades moleculares; c) Granulosidade relativa; d) Complexidade das partículas; e) Intensidade relativa da fluorescência; Comentário: vimos que o citômetro analisa todas as propriedades dispostas nas alternativas, exceto a letra B. Gabarito: B. 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 27 de 56 Eletroforese A eletroforese é um método habitualmente usado para separar e também purificar macromoléculas, principalmente ácidos nucleicos e proteínas. Essas macromoléculas carregadas são submetidas a um campo elétrico em um meio de suporte (em geral um meio poroso, como o gel de agarose ou poliacrilamida) e migram para o polo positivo ou negativo, de acordo com a sua carga. No caso de uma carga positiva, seguirá para o polo negativo e se for negativa, irá na direção do polo positivo. O fluxo migratório é determinado pelo peso molecular. Moléculas de menor peso migram mais rápido que as de maior peso, formando as bandas características que serão visualizadas posteriormente. É adotada para separação de componentes de interesse em misturas complexas, por exemplo, as proteínas do soro. A eletroforese é uma técnica que serve de etapa prévia para outras, como a imunoeletroforese e imunofixação, Western Blot e etc... O movimento das moléculas em um campo elétrico depende principalmente da sua carga, que é por sua vez determinada pelo pH. As moléculas de proteínas se tornam ionizadas e migram ao eletrodo com carga oposta (para o polo positivo, se a carga for negativa ou vice-versa), sendo sua mobilidade eletroforética diretamente proporcional à carga da partícula e inversamente proporcional à viscosidade do meio e ao peso molecular. A migração diferencial das moléculas gera um eletroforetograma que dispõe as proteínas em zonas com limites precisos. As zonas são visualizadas quando o meio de suporte é corado. A seguir, o meio de suporte é seco e as proteínas quantificadas em um densitômetro, que converte o padrão de bandas em picos. 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 28 de 56 Na figura acima temos uma eletroforese com imunofixação. “SPE” é a eletroforese de referência e, a seguir, cada campo foi analisado com o anti-soro respectivo (anti- IgG, antiIgA, anti-IgM, anti-kappa e anti-lambda). Neste paciente verificou-se proteína M monoclonal em IgM-kappa. Eletroforese – Equipamentos e Materiais (cuba, fonte e acessórios) Cuba de eletroforese: utilizada para eletroforese de géis. Tipicamente contém bandeja, pentes para várias amostras, tanque com tampa, divisórias de acrílico, suportes para pentes. Cuba de eletroforese: bandeja, tanque e conectores 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 30 de 56 Fonte para cuba de eletroforese Transiluminador UV: Utilizado para a visualização segura de bandas em géis de eletroforese coradas com marcadores fluorescentes. Pode ser também de LED, ao invés de UV. Filtros, Destiladores E Purificação De Água Água Reagente A água é um reagente utilizado na maioria dos testes laboratoriais e por isso deve seguir um padrão de controle de qualidade rigoroso. O fornecimento urbano de água apresenta moléculas orgânicas, íons inorgânicos, partículas, coloides, gases, bactérias e seus produtos, que podem alterar os resultados dos exames laboratoriais e causar eventuais erros e falhas mecânicas em equipamentos analíticos. Para remover essas impurezas, é necessário recorrer a uma combinação de tecnologias de purificação. Há várias organizações que especificam normas sobre a água reagente, a fim de minimizar sua interferência nos ensaios laboratoriais, pois as tecnologias de ensaio são refratárias à água reagente de baixa qualidade. 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 32 de 56 Os cuidados na preparação e no manuseio da água auxiliam na minimização de possíveis erros analíticos, aumentando a confiabilidade dos resultados. Tecnologias de purificação Já sabemos que a água deve ser purificada de alguma forma, mas como isso é feito? Quais são os tipos de água utilizados? Para se tornar adequada para a utilização no laboratório, a água deve passar por purificação para a eliminação dos contaminantes dissolvidos nela, tornando-se água reagente. O processo de purificação não é único e pode ser decorrente de uma combinação de métodos para que atenda às especificações de qualidade. Existem vários métodos para remoção de impurezas, por isso é necessário recorrer a uma combinação de tecnologias, associando suas vantagens, a fim de se obter uma água de alta qualidade. Vamos ver a tabela a seguir: 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 33 de 56 Especificações que devem ser estabelecidas no momento de produção da água: CLSI: água reagente para laboratório clínico (ARLC) Em um laboratório são utilizadas principalmente os seguintes tipos de água: Água destilada: é obtida por meio da destilação (condensação do vapor de água obtido pela ebulição ou pela evaporação). É a água utilizada em laboratório ou industrialmente como reagente ou solvente. Contém unicamente moléculas de água. Purificada através de destiladores, é a que apresenta maior pureza do ponto de vista microbiológico, não contém elementos orgânicos. Em contato com o ar, a água destilada pode se tornar rica em gases dissolvidos, como o gás carbônico (CO2). Seu pH é da ordem de 7, mas, se exposta ao ar, tende a ficar um pouco ácidadevido ao CO2 dissolvido. A água destilada é estéril enquanto estiver protegida do ar ambiente. Destiladores: o destilador de água funciona de tal forma a promover o processo de destilação simples da água. Esse processo é utilizado para separar misturas homogêneas quando um dos componentes é sólido (minerais) e o outro líquido (água). A destilação simples consiste em aquecer a mistura em uma aparelhagem apropriada, até que o líquido entre em ebulição. Como o vapor do líquido é menos 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 34 de 56 denso, sairá pela parte superior do balão de destilação (caldeira) e chegará ao condensador (parte refrigerada), ao entrar em contato com as paredes frias, se condensa, voltando novamente ao estado líquido. Em seguida, é recolhido em um recipiente adequado, e o sólido permanece no balão de destilação. Destiladores Água deionizada: é produzida nos deionizadores. A deionização (ou desmineralização) é um processo de remoção de íons (cátions/ânions) através de um sistema de resinas trocadoras de íons. Ela pode ser parcial ou total de acordo com os métodos de eliminação escolhidos e o grau de remoção necessário. Quando apenas os íons forem retidos nas resinas, a água deionizada ou desmineralizada obtida retém suas substâncias orgânicas e inorgânicas sem carga elétrica. Portanto, o líquido não é puro. Esse tipo de água é utilizada nas indústrias como água de processo. Mas a água para fins médicos precisa passar por um filtro biológico para purificá-la completamente e torná-la estéril. Deionizadores: aparelhos contendo resinas de troca iônica para remoção dos sais minerais produzindo água quimicamente pura com condutividade equivalente à da água destilada. Uma resina fortemente ácida remove os cátions eventualmente presentes na 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 35 de 56 água e uma resina fortemente básica (OH-) remove ânions que estejam contaminando a água. Os íons inorgânicos da água são removidos. Logo após a troca, efetua-se uma destilação normal, para remover os íons restantes. Deionizadores Osmose Reversa: a osmose reversa acontece quando uma pressão maior que a pressão osmótica é aplicada ao lado do concentrado da membrana e a direção normal do fluxo osmótico é revertida. Com isso, a água pura passa pela membrana a partir da solução concentrada e é, então, separada de seus contaminantes. É feita no equipamento de Osmose Reversa. Sistema de ultra-purificação da água: a água ultra pura é resultado de dois processos: osmose reversa e deionização. Agora vamos exercitar resolvendo mais algumas questões sobre tudo que vimos até aqui em nosso curso: 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 36 de 56 15. (2010/CESPE/INMETRO/ Técnico – Biotecnologia) Ainda com relação aos métodos eletroforéticos, assinale a opção correta: a) Na eletroforese de zona, as macromoléculas são separadas quase que exclusivamente com base na sua carga de superfície: quanto maior for a carga, menor será a velocidade de migração. b) A imunoeletroforese é um método quantitativo, aplicável a qualquer substância solúvel que seja imunogênica e cujos anticorpos não se precipitam. c) Em gel de agarose, ocorre um fenômeno chamado eletroendosmose, em que há um movimento claro da água para o pólo positivo para compensar as cargas do gel que são atraídas para o polo negativo. d) A imunoeletroforese combina dois métodos: a eletroforese em gel, seguida de imunodifusão e precipitação das proteínas. e) Quando a mobilidade eletroforética é maior que a velocidade da eletroforese, o movimento resultante é a migração para o polo negativo. Comentário: não está no escopo de nossa aula de técnicas imunológicas esmiuçar as técnicas eletroforéticas, porém, a questão permite reforçar alguns pontos vistos, então é válida para nós nesse momento. Na letra A, por exemplo, é justamente o contrário! A velocidade de migração é diretamente proporcional à carga da partícula e inversamente proporcional à viscosidade do meio. A alternativa correta da questão é a D. Gabarito: D. 16. (2014/AOCP/UFC/Biomédico) O equipamento laboratorial que utiliza prismas ou grades de difração é o: a) cromatógrafo gasoso. b) densitômetro. c) termociclador. d) espectrofotômetro. 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 38 de 56 B) Osmose reversa. C) Deionização. D) Destilação. E) Adsorção por carvão ativado. Comentário: as dosagens em questão são de íons (sódio e potássio) e é imprescindível que a água utilizada na técnica de dosagem esteja livre de íons que alterem a dosagem, devendo, portanto, ser deionizada. Gabarito: C. 19. (2016/Prefeitura de Fortaleza – CE/Prefeitura de Fortaleza – CE/Técnico de Laboratório em Análises Clínicas) Um dos métodos iniciais a ser aplicado no controle de qualidade da água no laboratório clínico é realizado através da detecção de contaminantes verificando- se: a) pH da água. b) resistividade da água. c) concentração de Sílica. d) condutância. Comentário: muita atenção ao enunciado! Típica questão pegadinha! Foi solicitado qual o método utilizado para verificar a presença de contaminantes na água, certo? Pois bem, no monitoramento da qualidade da água a determinação de resistividade e condutividade permite mensurar a quantidade de contaminantes iônicos presentes na água. E, dentre as alternativas, uma forma de determinar a presença desses contaminantes seria verificando-se o pH da água. Gabarito: A. 20. (2017/IBFC/EBSERH/Biomédico) Os destiladores são usados no processo de purificação da água reagente utilizada em laboratórios clínicos. Sobre o processo de destilação assinale a alternativa correta. 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 39 de 56 a) Promove a remoção de impurezas voláteis e não voláteis b) A grande vantagem deste processo é o baixo consumo de energia c) Remove grande porcentagem de todos os tipos de contaminantes presentes na água d) A membrana colocada na saída do sistema de purificação não permite a passagem de partículas acima de 0,22 µm e) A maior desvantagem é a saturação rápida das resinas de troca iônica Comentário: vimos que existem vários métodos para remoção de impurezas e uma tabela resumia as vantagens e desvantagens dos diferentes métodos. A destilação promove a remoção de grande parte dos contaminantes, por isso está correta a letra C. Esse método não remove impurezas não voláteis, tem alto consumo de energia e não envolve uso de membrana de filtração e nem resinas de troca iônica. Gabarito: C. 21. (2016/Prefeitura de Fortaleza – CE/Prefeitura de Fortaleza – CE/Farmacêutico-Bioquímico) Muitas determinações analíticas realizadas nos laboratórios clínicos são baseadas em mensurações de energia absorvida ou transmitida. Marque a opção que nãocontém um dos componentes básicos dos espectrofotômetros: a) Seletor de comprimento de onda. b) Fonte de energia radiante. c) Processadores de Sinal. d) Potenciômetro. Comentário: na letra D está citado o potenciômetro que é outro equipamento e não um componente de espectrofotômetros. Gabarito: D. 22. (2016/AOCP/EBSERH-HUJBB-UFPA/Biomédico) Os sistemas purificadores de água são encontrados em grande variedade no 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 40 de 56 mercado. Dentre eles, temos alguns sistemas que purificam a água por: A) absorção do carvão ativado, destilação e abrandamento. B) eletrodeionização, deionização e osmose inversa. C) filtração, deionização e osmose reversa. D) microfiltração, absorção com carvão ativado e abrandamento. E) osmose inversa, deionização e filtração. Comentário: a única alternativa que contém apenas métodos/sistemas de purificação de água é a letra C. As demais contêm incorreções, basta ler com atenção. Gabarito: C. 23. (2016/AOCP/EBSERH-HUJBB-UFPA/Biomédico) Um dos principais problemas que comprometem as atividades laboratoriais é a facilidade de contaminação da água, sendo os principais contaminantes: material particulado e coloide, substâncias inorgânicas e gases dissolvidos, compostos orgânicos dissolvidos, microrganismos e seus subprodutos (pirogênios). Em um laboratório de análises clínicas, precisam implantar um parâmetro de controle no sistema de purificação da água para evitar a contaminação da água por microrganismos e você, que é Biomédico, foi escolhido para implantar este parâmetro no laboratório. Qual é o parâmetro de controle indicado para esse tipo de contaminação? A) Teste LAL (Limulus Amoebocite Lysate). B) Filtração. C) Carbono orgânico total. D) Resistividade. E) Contagem total de bactérias heterotróficas em placa. Comentário: vimos que o controle microbiológico pode ser realizado por meio da contagem de UFC (unidades formadoras de colônias/contagem de bactérias heterotróficas em placa) 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 42 de 56 ( ) A solução tampão pode ser ácida ou alcalina, sendo específica para cada tipo de eletroforese, dada pelo grau de molaridade ou força iônica da solução. a) F V V b) F F V c) V V F d) V V V e) V F V Comentário: nesta questão todas as sentenças estão corretas a respeito da técnica de eletroforese. Gabarito: D. E chegamos ao fim de nossa aula 01! Fico à disposição por meio do fórum caso tenham alguma dúvida ao longo do estudo, ok? Até a próxima aula, Prof.ª Denise Rodrigues Lista de Questões 1. (2010/FGV/FIOCRUZ/Tecnologista em Saúde - Operação e Manutenção de Plataformas Tecnológicas) CD4 e CD8 são receptores de membrana associados à caracterização de linfócitos T do sistema imunológico. A contagem de células expressando CD4 (CD4 positivas) é um dos parâmetros analisados em pacientes HIV positivos, visto que o HIV infecta estas células. A contagem de células CD4 positivas é comumente obtida através de citometria de fluxo. Desta forma, o número reduzido de células CD4 positivas é um dos preditores para que o paciente entre no protocolo de tratamento utilizando anti- retrovirais contra HIV. Avalie os gráficos (dot plot) analisados por 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 44 de 56 d) Termocicladores. 3. (2010/FGV/FIOCRUZ/Tecnologista em Saúde – Imunologista) O citômetro de fluxo é um equipamento que pode ser utilizado para investigar a presença de células tumorais leucêmicas residuais na medula óssea pois: a) permite a análise do volume celular. b) permite a análise da apoptose destas células. c) permite a análise de um grande número de células da medula. d) permite análise de um número máximo de 1000 células. e) utiliza a autofluorescência espontânea deste tipo celular para identificá-lo. 4. (2015/AOCP/EBSERH-HC-UFG/Biomédico) Qual é o equipamento cuja análise permite a identificação direta do fenótipo celular, usando anticorpos marcados com moléculas fluorescentes, podendo medir múltiplos parâmetros como o espalhamento frontal, o espalhamento lateral e a intensidade de fluorescência em diversos comprimentos de onda? A) Potenciômetro. B) Citômetro de fluxo. C) Espectrofotômetro. D) Destilador filtrante. E) Imunodifusor radial. 5. (2015/COVEST/UFPE/Biomédico) A imunofenotipagem é uma técnica utilizada na identificação e na distinção de tipos celulares. Para tanto, utiliza anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos para analisar qualitativa e quantitativamente padrões de expressão de antígenos celulares chamados “clusters of differentiation” ou CD. Cada tipo de célula de nosso corpo possui um padrão próprio de expressão destes antígenos; assim, é possível 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 45 de 56 identificar com precisão a célula de interesse. Esta técnica é muito utilizada nos diagnósticos hematológicos, principalmente, de leucemias e linfomas. Também é utilizada no monitoramento de doenças infecciosas como a AIDS. Nesse contexto, é correto afirmar que: A) a citometria de fluxo é o método preferencial para a imunofenotipagem das doenças hematológicas malignas, pois permite detectar a presença de vários antígenos numa mesma célula, e fazer uma análise rápida de um grande número de células. B) a base para a classificação imunológica das leucemias é a combinação de anticorpos policlonais usados para determinar o perfil imunofenotípico de populações celulares. C) a presença de um antígeno diferente do esperado para determinado tipo celular e seu estágio de maturação, ou o aumento/diminuição da sua expressão, não é determinante da existência de um clone anormal. D) a imunofenotipagem é uma técnica que se resume à detecção de antígenos de superfície expressos por células leucêmicas. E) a imunofenotipagem pela citometria de fluxo é um teste complementar, pois não é utilizada para o diagnóstico diferencial. 6. (2014/IADES/EBSERH/Biomédico) A citometria de fluxo é uma técnica de medição das propriedades de células em suspensão, orientadas em um fluxo laminar e interceptadas uma a uma por um feixe de luz. Quanto à citometria de fluxo, assinale a alternativa correta. a) As células são boas condutoras de energia, o que permite a contagem e medição a partir dos impulsos elétricos que geram. b) Apresenta a desvantagem de não permitir a avaliação de múltiplos parâmetros celulares de forma individual. 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 46 de 56 c) Nenhum fator celular influi na amplitude, duração e forma do pulso elétrico, que estão relacionadas com a alteração das linhas de forças elétricas e com o deslocamento do meio condutor. d) Não consegue identificar todas as anormalidades significativas identificadas pelo observador humano. e) Quanto maiora corrente elétrica, ou seja, a intensidade do pulso elétrico, menor é o tamanho da célula. 7. (2017/IBFC/EBSERH-HUGG-Unirio/Biomédico) Assinale a alternativa correta sobre o manuseio e características dos citômetros de fluxo. a) Quando houver mais que um citômetro de fluxo realizando exames de rotina em determinado laboratório, deve-se realizar uma comparação de desempenho entre os equipamentos a cada dois anos. b) Cada fluorocromo tem um espectro de excitação e emissão único que determina em parte o desempenho e característica do anticorpo monoclonal e direciona quais fluorocromos podem ser utilizados simultaneamente. c) A verificação diária da intensidade de fluorescência e coeficiente de variação da fluorescência de partículas estáveis, bem como do ruído do equipamento com partículas não fluorescentes, não é necessária se o laboratório realiza apenas análise de amostras suspeitas para neoplasias hematológicas. d) A maioria dos instrumentos de citometria apresenta um carryover (carreamento) declarado pelo fabricante de, aproximadamente, 20% e) O tamanho das células é medido através da corrente elétrica (intensidade de pulso) e quanto maior a corrente elétrica, menor é o tamanho da célula. 8. (PR-4 Concursos/2012/Técnico em Farmácia) A reação de amplificação em cadeia (PCR) é uma metodologia que pode ser utilizada em vários testes laboratoriais. O equipamento que realiza 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 48 de 56 c) espectrofotômetro / concentração, pureza e análise da densidade óptica d) termociclador / desnaturação, anelamento e extensão e) cuba eletroforese / separação, identificação e purificação 11. (2013/IBFC/EBSERH/HUB/Biomédico) Assinale a alternativa correta sobre o método de separação denominado cromatografia. a) A cromatografia líquida de alta eficiência emprega bombas de alta pressão para a eluição da fase móvel. b) A grande limitação da Cromatografia líquida clássica é a necessidade de que a amostra seja volátil ou estável termicamente. c) O detector mais utilizado para separações por Cromatografia gasosa de alta resolução é o detector de ultravioleta. d) Cromatografia em papel é uma técnica baseada na adsorção irreversível das substâncias em questão. 12. (2017/AOCP/EBSERH-HUJB-UFCG/Biomédico) A cromatografia é um processo físico-químico de separação de misturas que se divide em duas fases que são: a) fase de promoção e fase móvel. b) fase de progressão e fase estacionária. c) fase estacionária e fase líquida. d) fase móvel e fase de iniciação. e) fase estacionária e fase móvel. 13. (2015/AOCP/EBSERH-HC-UFG/Biomédico) Proteínas, tais como o DNA e o RNA, são rotineiramente separadas e isoladas por cromatografia. Qual é a base de separação dos componentes na cromatografia por afinidade? A) Tamanho molecular. B) Sítio de ligação natural. 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 49 de 56 C) Carga. D) Diferença de potencial. E) Pressão osmótica. 14. (2016/IBFC/EBSERH-HUPEST-UFSC/Biomédico) A citometria de fluxo é uma técnica utilizada para contar, examinar e classificar partículas microscópicas suspensas, em fluxo, em um meio líquido. Permite a análise de vários parâmetros simultaneamente, sendo conhecida também por “citometria de fluxo multiparamétrica”. A versão mais aplicada da citometria de fluxo é denominada FACS (fluorescence-activated cell sorter, separador de célula ativado por fluorescência), que foi projetada para automatizar a análise e a separação das células coradas com anticorpo fluorescente. Assinale a alternativa que não corresponde às propriedades analisadas pelo equipamento nos sistemas celulares. a) Tamanho; b) Propriedades moleculares; c) Granulosidade relativa; d) Complexidade das partículas; e) Intensidade relativa da fluorescência; 15. (2010/CESPE/INMETRO/ Técnico – Biotecnologia) Ainda com relação aos métodos eletroforéticos, assinale a opção correta: a) Na eletroforese de zona, as macromoléculas são separadas quase que exclusivamente com base na sua carga de superfície: quanto maior for a carga, menor será a velocidade de migração. b) A imunoeletroforese é um método quantitativo, aplicável a qualquer substância solúvel que seja imunogênica e cujos anticorpos não se precipitam. c) Em gel de agarose, ocorre um fenômeno chamado eletroendosmose, em que há um movimento claro da água para o 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 50 de 56 pólo positivo para compensar as cargas do gel que são atraídas para o polo negativo. d) A imunoeletroforese combina dois métodos: a eletroforese em gel, seguida de imunodifusão e precipitação das proteínas. e) Quando a mobilidade eletroforética é maior que a velocidade da eletroforese, o movimento resultante é a migração para o polo negativo. 16. (2014/AOCP/UFC/Biomédico) O equipamento laboratorial que utiliza prismas ou grades de difração é o: a) cromatógrafo gasoso. b) densitômetro. c) termociclador. d) espectrofotômetro. e) fotocolorímetro. 17. (2015/VUNESP/ Pref. São José dos Campos-SP/Analista em Saúde - Biomédico/Bioquímico) Água reagente para laboratório clínico (ARLC), denominada dessa maneira a partir de sua purificação e, rotineiramente, de água tipo I, é utilizada em várias análises nos laboratórios clínicos, necessitando atender especificações de qualidade descritas pela padronização do CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). Assim, para ARLC, o parâmetro é um indicador da contaminação iônica dessa água, e o valor ideal desse parâmetro para uso no laboratório clínico é ____________________ Assinale alternativa que preenche, correta e respectivamente, as lacunas do texto. A) Carbono Orgânico Total … < 1.000 ng/g B) Bactérias heterotróficas … < 10 UFC/mL C) Resistividade … ≥ 10 M┒.cm a 25 °C D) pH … ≥ 7,00 E) Teor de silicatos … < 10 mg/L 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 51 de 56 18. (2015/AOCP/EBSERH-HE-UFPEL/Biomédico) A água, muito utilizada no laboratório para diversas finalidades, deve estar isenta de impurezas. São vários os métodos de purificação da água. Qual é o método utilizado na purificação da água para a dosagem de sódio e potássio no laboratório? A) Filtração. B) Osmose reversa. C) Deionização. D) Destilação. E) Adsorção por carvão ativado. 19. (2016/Prefeitura de Fortaleza – CE/Prefeitura de Fortaleza – CE/Técnico de Laboratório em Análises Clínicas) Um dos métodos iniciais a ser aplicado no controle de qualidade da água no laboratório clínico é realizado através da detecção de contaminantes verificando- se: a) pH da água. b) resistividade da água. c) concentração de Sílica. d) condutância. 20. (2017/IBFC/EBSERH/Biomédico) Os destiladores são usados no processo de purificação da água reagente utilizada em laboratórios clínicos. Sobre o processo de destilação assinale a alternativa correta. a) Promove a remoção de impurezas voláteis e não voláteis b) A grande vantagem deste processo é o baixo consumo de energia c) Removegrande porcentagem de todos os tipos de contaminantes presentes na água d) A membrana colocada na saída do sistema de purificação não permite a passagem de partículas acima de 0,22 µm 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 52 de 56 e) A maior desvantagem é a saturação rápida das resinas de troca iônica 21. (2016/Prefeitura de Fortaleza – CE/Prefeitura de Fortaleza – CE/Farmacêutico-Bioquímico) Muitas determinações analíticas realizadas nos laboratórios clínicos são baseadas em mensurações de energia absorvida ou transmitida. Marque a opção que não contém um dos componentes básicos dos espectrofotômetros: a) Seletor de comprimento de onda. b) Fonte de energia radiante. c) Processadores de Sinal. d) Potenciômetro. 22. (2016/AOCP/EBSERH-HUJBB-UFPA/Biomédico) Os sistemas purificadores de água são encontrados em grande variedade no mercado. Dentre eles, temos alguns sistemas que purificam a água por: A) absorção do carvão ativado, destilação e abrandamento. B) eletrodeionização, deionização e osmose inversa. C) filtração, deionização e osmose reversa. D) microfiltração, absorção com carvão ativado e abrandamento. E) osmose inversa, deionização e filtração. 23. (2016/AOCP/EBSERH-HUJBB-UFPA/Biomédico) Um dos principais problemas que comprometem as atividades laboratoriais é a facilidade de contaminação da água, sendo os principais contaminantes: material particulado e coloide, substâncias inorgânicas e gases dissolvidos, compostos orgânicos dissolvidos, microrganismos e seus subprodutos (pirogênios). Em um laboratório de análises clínicas, precisam implantar um parâmetro de controle no sistema de purificação da água para evitar a contaminação da água por microrganismos e você, que é Biomédico, foi escolhido para 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 54 de 56 ( ) A solução tampão pode ser ácida ou alcalina, sendo específica para cada tipo de eletroforese, dada pelo grau de molaridade ou força iônica da solução. a) F V V b) F F V c) V V F d) V V V e) V F V 1-B 2-A 3-C 4-B 5-A 6-D 7-B 8-D 9-C 10-D 11-A 12-E 13-B 14-B 15-D 16-D 17-C 18-C 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 55 de 56 19-A 20-C 21-D 22-C 23-E 24-D 25-D Referências Bibliográficas - A importância da imunofenotipagem e da citogenética no diagnóstico das leucemias: uma Revisão da literatura. Valéria Bernadete Leite Quixabeira & Vera Aparecida Saddi. RBAC, vol. 40(3): 199-202, 2008. - Papel da imunofenotipagem por citometria de fluxo no diagnóstico diferencial das pancitopenias e das linfocitoses. Eduardo M. Rego e Guilherme A. S. Santos. Rev. Bras. Hematol. Hemoter. http://www.novainstruments.com.br/produtos_detalhes.aspx?Produto ID=3968&CategoriaID=348 http://www.patentesonline.com.br/termociclador- 125856.html#adsense1 http://www.infoescola.com/genetica/reacao-em-cadeia-da- polimerase/ Naoum, P. F. Métodos de Avaliação Laboratorial. http://www.pucrs.br/quimica/professores/arigony/cromatografia_FIN AL/detectores_cg.htm 26274965572 - roger mendonça Equipamentos, vidraria, reagentes e soluções Teoria e exercícios comentados Prof.ª Denise Rodrigues ʹ Aula 01 Prof. Denise Rodrigues www.estrategiaconcursos.com.br 56 de 56 http://www.pucrs.br/quimica/professores/arigony/cromatografia_FIN AL/EXCLUSAO.htm http://www.quimica.ufpr.br/fmatsumo/antigo/2011_CQ092_Preparac aoDeSolucoes_Pratica2.pdf. Acessado em: 27 de julho de 2016. http://www.kasvi.com.br/principios-da-tecnica-de-eletroforese/ http://www.sorocaba.unesp.br/Home/CIPA/Treinamento_para_utiliza cao_de_laboratorios_quimicos_e_biologicos_leitura.pdf. Acessado em: 27 de julho de 2016. MENDES, M. E. et al. A importância da qualidade da água reagente no laboratório clínico. J. Bras. Patol. Med. Lab. 2011, vol.47, n.3, pp. 217-223. BASQUES, F. W. A. A água como reagente. 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