Enzimas - Hemoglobina - Proteínas

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Victoria Moreno – 58
cÉLULA
Aminoácidos e proteínas
1. Aminoácidos como componentes de proteínas
Proteínas são polímeros de aminoácidos: todas elas são formadas a partir dos 20 aa diferentes que existem. Os aa são compostos que contém um grupo amino (-NH2), com exceção da prolina, e um grupo carboxila (-COOH), no entanto diferem entre si pela cadeia lateral R. As propriedades das cadeias R são importantes para a formação de proteínas como um todo, por isso, foram divididos em dois grandes grupos: polares e apolares. 
	Os aa apolares apresentam cadeias R semelhantes a hidrocarbonetos e encontram-se no interior das estruturas tridimensionais das proteínas, e, dessa forma, se protegem do meio aquoso no qual elas estão inseridas.
	O carbono α de todas as proteínas, com exceção da glicina (grupo R é um H), são assimétricos. Conforme a convenção de Fischer, todos os aa que participam da composição de proteínas de vertebrados são isômeros do tipo L.
2. Ionização de aminoácidos
Dependendo do pH do meio, os aa podem assumir três formas diferentes: completamente protonados, quando o meio for ácido (altas quantidades de H+), na forma de íon dipolar com carga elétrica total nula, ou na forma completamente desprotonada (baixas quantidades de H+).
A conversão de uma espécie na outra pode ser observada na curva de titulação, a qual, quando o aa não possui nenhum grupo ionizável no grupamento R, se assemelha com a curva de dois ácidos fracos com valores de pKa , esse resultado é devido a presença do grupo amino e carboxila. As regiões de tamponamento na curva refletem a transformação da primeira espécie na segunda, e da segunda espécie na terceira.
A curva de titulação torna-se mais complexa conforme crescem o número de grupos ionizáveis na cadeia R do aa: apresentam uma terceira área de tamponamento.
Ponto Isoelétrico
Há um pH, específico para cada aa, no qual prevalece a forma na qual a carga total líquida da molécula é zero, e as outras moléculas, carregadas positiva e negativamente, têm quantidades equivalentes, anulando a carga uma da outra. Quando não há nenhum grupo ionizável no grupamento R, o pI é o ponto equidistante entre o pKa da carboxila e o pKa do amino. Quando há um grupo ionizável na cadeia R, é necessária uma avaliação das propriedades desse grupo (ver se é mais semelhante com -COOH ou -NH2), e fazer uma média entre os mais semelhantes.
Aminoácidos como tampões fisiológicos
Os aminoácidos não são bons tampões em pH fisiológico, o que muda completamente quando esses são associados em peptídeos e proteínas. Dentro da conformação da molécula proteica a proximidade com outros grupamentos R, a polaridade ou a falta dela, e a perda de moléculas de água durante a polimerização faz com que a proteína adquira um ótimo poder tamponante em pH fisiológico, como é o caso da hemoglobina. 
3. Polímeros de aminoácidos: Peptídeos e Proteínas
Os aminoácidos podem formar polímeros lineares a partir da ligação de uma α-carboxila com uma α-amino de outro aa (ligação amídica, ou no caso das proteínas, peptídica). A síntese dessa cadeia envolve vários processos e grande gasto de ATP.
Os quatro átomos que participam da ligação peptídica apresentam uma ressonância de dupla ligação, a qual impede a rotação nessas áreas. Porém, a outras unidades realizam rotação (em torno das ligações de carbono), permitindo o dobramento de diversas maneiras diferentes.
As proteínas são formadas por uma ou mais cadeias polipeptídicas e todas elas apresentam uma cadeia tridimensional definida e alterações nessas definições podem ser usadas como maneira de regulação para o funcionamento dessas proteínas. Podem ser globulares ou fibrosas: as globulares têm caráter mais hidrossolúvel, e geralmente são dinâmicas; já as fibrosas são alongadas, insolúveis e tem caráter estático, desempenhando papel principalmente estrutural no organismo.
4. Estrutura de proteínas
A organização espacial da proteína está intimamente relacionada com a ordem em que os aa foram adicionados: a interação entre as diferentes cadeias R pode fazer com que a proteína seja mais alongada ou mais globular.
-Estrutura Primária: é a sequência de aminoácidos dentro da cadeia peptídica. 
-Estrutura Secundária: descreve estruturas tridimensionais regulares, com as α-hélices e as folhas β pregueadas. As duas estruturas se estabilizam através de pontes de hidrogênio que, embora sejam fracas, geram grande estabilidade quando em grande número. 
-Estrutura Terciária: descreve o dobramento final a partir das interações entre as estruturas regulares através de ligações não covalentes, as quais podem ser: pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas, ligações iônicas ou salinas, forças de Van der Waals e ainda pontes dissulfeto. 
{lembrando dos aa que possuem S na composição do grupamento R: Cisteína (possuí o R na extremidade da cadeia, o que confere a possibilidade de formação de pontes dissulfeto) e metionina (possui o S no meio da cadeia e é portanto apolar), que não faz pontes dissulfeto}
-Estrutura Quaternária: descreve a interação de mais de uma cadeia polipeptídica para compor uma proteína funcional, sendo essas subunidades idênticas ou não. 
Domínios: são regiões compactas formadas pelo dobramento das cadeias, que desempenham funções específicas, com poder de movimentação (um em relação ao outro). Áreas de ligação de coenzimas e substratos. Motivos: são associações de estruturas secundárias que realizam funções em conjunto, como transportar um sinal ou formar um canal iônico.
Motivos: são diferentes organizações da forma secundária das proteínas globulares; arranjos e combinações de α-hélices e folhas-β, formando diversas estruturas como canais e receptores de membrana.
5. Proteínas Fibrosas
Proteínas fibrosas têm forma alongada e são formadas pela repetição de módulos, o que possibilita a construção de grandes estruturas. 
	Nas α-queratinas, duas ou três cadeias de α-hélice se associam lateralmente formando longos cabos helicoidais, os quais reunidos formam as fibrilas e fibras. Presente nos mamíferos geralmente na pele e em seus anexos. São frequente as pontes dissulfeto entre os resíduos de cisteína (grande resistência). Nas β-queratinas, as fibras são formadas através do empilhamento de folhas-β. 
No caso do colágeno, as cadeias apresentam uma formação helicoidal típica, dada a grande quantidade de glicina, prolina e hidroxiprolina nas cadeias e, geralmente, nessa ordem. Essa característica permite a relação íntima entre três cadeias, formando o tropocolágeno, o qual, por sua vez, interage com outras moléculas semelhantes através de ligações covalentes.
6. Proteínas conjugadas
Muitas proteínas apresentam resíduos de aa que não são codificados por RNAm, mas modificados após a formação da cadeia ou durante. No caso do colágeno, a cadeia lateral de algumas prolinas sofre hidroxilação, reação que exige vit. C (ácido ascórbico), formando a hidroxiprolina. Em outras proteínas é comum ocorrer a acetilação ou fosforilação – a adição ou remoção de grupos fosfatos é um importante mecanismo de regulagem e manutenção da atuação das proteínas.
{Deficiência de vit. C – Escorbuto: Quando há falta de vit. C no organismo, o colágeno formado fica defeituoso, dada a não hidroxilação da prolina, fazendo com que essas moléculas fiquem menos estáveis. Manifestações clínicas: interrupção do crescimento dos ossos em crianças, má cicatrização, aumento da fragilidade dos vasos sanguíneos, hemorragia na pele e nas gengivas.}
As proteínas podem ainda apresentar moléculas não orgânicas associadas, covalentemente ou não, as suas estruturas, os Grupos Prostéticos, e nesse caso são chamadas de proteínas conjugadas. Os grupos prostéticos também podem ser lipídios ou carboidratos: glicoproteínas e lipoproteínas. 
7. Carga elétrica e solubilidade das proteínas 
Valor do PI
A carga elétrica liquida de uma proteína é dada pelo somatório de todas as cargas das cadeias laterais e dos terminas amino e carboxila. O ponto isoelétrico é o pH no qual a molécula apresenta-se neutra: o número de cargas positivas equivaleo número de cargas negativas. O calculo do PI de uma proteína não é tão simples como o de um aa, já que a carga dos resíduos pode variar de acordo com a posição que ocupam na ptn. 
{Em pH menor que o PI (grande quantidade de H+) a proteína encontra-se carregada positivamente; em pH maior que o PI, a ptn está carregada negativamente (liberação de H+)} 
Solubilidade de Proteínas
A solubilidade de proteínas é determinada, fundamentalmente, pela estrutura primaria. Além disso, as características do meio também podem influenciar a interação com a água: no PI, a solubilidade é menor, pois em outros valores de pH, as moléculas tendem a ter a mesma carga, portanto se repelem e estabilizam-se. 
Efeito salting-in: conforme é adicionado sal a uma solução com proteínas, os íons carregados reagem com as cadeias R dos resíduos, atenuando a interação entre eles, facilitando a solubilidade em água. Efeito salting-out: ocorre quando a quantidade de sal é tão grande que a quantidade de moléculas de água não é suficiente para formar a camada de solvatação dos sais e das proteínas, diminuindo a solubilidade das proteínas da solução.
Solventes orgânicos solúveis em água, como acetona e etanol, também diminuem a solubilidade das proteínas, devido ao baixo valor das constantes dielétricas e porque também sofrem hidratação. 
8. Alterações estruturais das proteínas
As proteínas, assim que são formadas, já adquirem suas conformações secundárias e terciárias, e quaternárias quando as subunidades já estão prontas. As alterações químicas que afetam suas estruturas a ponto de causar perda de função são chamadas de desnaturação: provocada por tratamentos que ocasionem o rompimento de ligações covalentes, como aquecimento, adição de ácidos ou álcalis fortes e detergentes/sabão.
Algumas proteínas, quando retiradas do meio de desnaturação podem renaturar, o que prova que sua estrutura tridimensional depende unicamente de sua estrutura primária.
A montagem das proteínas nas células, no entanto, ocorre com o auxílio de uma família de família de proteínas, as chaperonas, para que o processo ocorra num tempo compatível com a vida: elas se ligam às proteínas e, por meio de reações de hidrólise com gasto de ATP, impedem ou facilitam a ligação precoce de cadeias complementares. As chaperonas podem ainda atuar na estabilização de proteínas em condições extremas.
{Anemia falciforme: ocorre quando o aa glutamato, com cadeira R polar, é trocado por valina, com cadeia R apolar, na molécula de hemoglobina. Essa substituição acarreta a agregação das moléculas na forma desidrogenada, descaracterizando o formato da hemácia: quando isso ocorre, toma forma de foice. As hemácias deformadas podem obstruir capilares, tornando a vascularização ineficiente, também sofrem hemólise mais facilmente.}
Hemoglobina
1. Estrutura da hemoglobina
A molécula de hemoglobina é formada por quatro cadeias polipeptídicas, duas α e duas β. Os dois tipos de subunidades e a mioglobina, apesar de apresentarem diferenças de aminoácidos, possuem estruturas terciarias muito semelhantes. As ligações não covalentes da estrutura quaternária são muito mais numerosas entre subunidades diferentes, resultando em uma molécula tetramérica formada pela união de dois dímeros.
2. Ligação com o oxigênio
Grupo prostético heme
A hemoglobina é uma hemoproteína: cada uma de suas cadeias apresenta um grupo prostético heme, que é uma molécula de porfirina contendo um íon Fe2+. O grupo heme localiza-se dentro de uma cavidade hidrofóbica, que torna possível a ligação do oxigênio ao Fe2+, sem que haja oxidação para Fe3+. 
	Ao sítio de ligação do ferro com o oxigênio podem ligar-se outras moléculas, como CO e H2S, com afinidade ainda maior, por isso sua alta toxicidade para organismos aeróbios. 
	A molécula de hemoglobina totalmente oxigenada é chamada oxi-hemoglobina, e apresenta uma cor mais avermelhada (sangue arterial). Já a molécula de hemoglobina com nenhum oxigênio é a desoxi-hemoglobina, de cor mais azulada (sangue venoso).
Ligação com O2 e mudança conformacional
	A oxigenação da hemoglobina determina mudanças estruturais sequenciais. Na desoxi-Hb, os íons ferro estão fora do plano do grupo heme e o anel porfirínico é ligeiramente côncavo. Com a ligação do primeiro oxigênio, o ferro retorna ao plano do heme, arrastando todo o resto da cadeia de aminoácido, desfazendo ligações covalentes, alterando a estrutura quaternária da hemoglobina: a ligação da primeira molécula de oxigênio facilita o preenchimento dos outros grupos heme, a ligação da quarta molécula é 300x mais eficiente que a primeira.
Cooperatividade
	Cooperatividade é a influência exercida por um sítio sobre outros em outras subunidades de uma proteína oligomérica, como é o caso da hemoglobina e de enzimas alostéricas. A curva de saturação da mioglobina e da hemoglobina apresentam-se de maneiras diferentes por essa razão: a primeira tem curva hiperbólica, dado que possui um único sítio de ligação; já a hemoglobina tem curva sigmoide, indicando que a ligação das moléculas de O2 no grupo heme não é independente, e que o preenchimento de um, aumenta a afinidade para os próximos. 
	A cooperatividade da hemoglobina torna essa molécula muito sensível às variações na pO2, tornando essa molécula perfeita para o transporte desse gás. No sangue arterial, que acabou de sair dos pulmões, a pressão parcial de O2 é de 100mmHg, e a Hb está 100% saturada nessa situação. Já no sangue arterial, como a pressão está mais baixa, por volta de 20mmHg, a saturação da hemoglobina cai, liberando mais da metade do O2 capturado em pressões maiores. A mioglobina seria um transportador menos eficiente, já que na pressão venosa de O2, ela se apresenta quase 100% saturada. Todavia, essa alta afinidade faz com que essa molécula seja um bom reservatório de O2 nos músculos de mamíferos, onde são encontradas em abundância. A mioglobina apresenta maior afinidade pelo O2 em qualquer pressão, portanto ele pode ser transferido facilmente do sangue para essas moléculas e ficar armazenado nos músculos, servindo de reservatório de mátria prima para as mitocôndrias. 
3. Fatores que interferem na ligação com o O2
2,3-Bifosfoglicerato
	O BPG (intermediário da glicólise) liga-se fortemente à desoxi-Hb, em uma cavidade circulada por cadeias R positivas, as quais interagem fortemente com os grupos negativos do BPG, fazendo com que a forma desoxigenada predomine, diminuindo a afinidade pelo O2. Todavia, mesmo na presença de BPG, a hemoglobina continua ficando saturada na pressão pulmonar de O2. O papel do BPG é aumentar a liberação de oxigênio em tecidos extrapulmonares. A [BPG	] aumenta em casos de hipóxia tecidual prolongada e compensa a menor disponibilidade com a maior liberação de gás para os tecidos.
Efeito Bohr – pH
	A afinidade da hemoglobina diminui quanto menor for o pH. Assim como o BPG, os íons H+ ligam-se preferencialmente à desoxi-Hb, que passa a constituir a forma predominante da molécula, diminuindo a sua afinidade por O2. Visto isso, é possível afirmar que a forma desoxigenada é uma base mais forte que a forma oxigenada, dado que com a associação/desassociação de oxigênio promove uma mudança conformacional da molécula, que acaba afastando alguns aminoácidos que proporcionariam maior facilidade à entrada de H+. Em resumo, a conversão de oxi­Hb em desoxi­Hb é acompanhada por captação de prótons, e a sua oxigenação, por liberação de prótons.
	A afinidade da hemoglobina por oxigênio também diminui com acréscimos na pressão parcial de CO2. O CO2 reage com os grupos aminos terminais das cadeias da hemoglobina, formando a carbaminahemoglobina, que tem afinidade menor por O2. Essa dinâmica é extremamente importante, visto que os tecidos periféricos, os quais necessitam mais de oxigênio, também tem maior [CO2] e [H+], diminuindo a afinidade da Hb ao oxigênio, facilitando a liberação do gás O2 para os tecidos. O efeito conjunto da diminuição do pH e aumento de Co2 sobre a Hb é chamado Efeito Bohr.
Manutenção do pH plasmático
À medida que a pO2 diminui e a [H+] aumentaa Hb captura H+ e libera O2, isso ocorre nos tecidos, e de forma contrária, nos alvéolos, à medida que a pO2 aumenta e a [H+] diminui, a Hb libera H+ e captura O2. Nos capilares que irrigam os tecidos, o CO2 produzido pelo metabolismo difunde-se até as hemácias, onde é hidratado rapidamente em uma reação catalisada pela anidrase carbônica formando H2CO3, porém no pH do sangue a molécula se dissocia facilmente em HCO3 e H+:
 
Essas reações consecutivas explicam porque o pH diminui com o aumento da [CO2]. Nos tecidos extrapulmonares, a maior concentração de H+ faz a Hb liberar O2 e capturar íons hidrogênio, favorecer a formação de HCO3-, o qual viaja até os pulmões difundido no plasma. Nos pulmões, como há alta de O2, o H+ é liberado, então o HCO3- é convertido em H2CO3, que é convertido pela anidrase carbônica em CO2 e água. O CO2 difunde-se das hemácias para o plasma e é expirado, a liberação de H+ corrige o valor do pH pulmonar, que tenderia a subir.
Assim, a manutenção do pH fisiológico, imprescindívelpara o desempenho de qualquer função vital, é obtida pela ação coordenada do sistema Hb/HbO2 e do sistema CO2 /HCO3-.
4. HbA e HbF
A hemoglobina fetal, HbF, dos mamíferos é diferente da hemoglobina presente nos adultos, HbA. A primeira apresenta, em vez das cadeias β, duas cadeias γ.
A HbF apresenta maior afinidade ao O2, dado que sua afinidade por BPG é menor: nas cadeias γ, um aa positovo foi substituido por um aa apolar sem carga, ou seja, a cavidade onde o BPG se liga apresenta um aa positivo a menos. Essa propriedade faz com que o O2 das hemacias da mãe migre para a HbF do feto. 
Enzimas
Enzimas são um grupo de substâncias orgânicas de natureza normalmente proteica, com atividade intra ou extracelular que têm funções catalisadores, catalisando reações químicas que, sem a sua presença, dificilmente aconteceriam.
1. Enzimas e a cinética das reações
As enzimas aceleram a velocidade das reações por que diminuem a energia de ativação.
Constante de velocidade de reação: k
{A velocidade de uma reação será diretamente proporcional ao número de moléculas com energia igual ou maior do que a energia do estado de transição.}
Para reagir as moléculas devem ter uma quantidade de energia que lhes permita alcançar o estado reativo, chamado estado de transição: a energia de ativação, é a barreira que separa reagente do produto.
Em reações de primeira ordem, nas quais o reagente sofre modificações que o transformam no produto, apenas uma molécula está envolvida (v=k.[x]), já em moléculas de segunda ordem, duas moléculas precisam colidir, de forma que a energia da colisão seja suficiente para que alcancem o estado reativo, além de que necessitam estar orientadas adequadamente para que a colisão seja efetiva.
A velocidade de reação pode ser alterada de três maneiras: a) Aumento da quantidade de produto; b) elevação da temperatura; c) diminuição da energia de ativação (atuação enzimática – obtida pela presença de catalizadores, nas reações enzimáticas os reagentes são chamados substratos).
Ligação enzima-substrato
As enzimas reproduzem os mecanismos da catálise não enzimática de reações orgânicas: as cadeias laterais de aminoácidos do sitio ativo adicionam ou removem prótons do substrato, ou formam ligações covalentes transitórias com o substrato.
Sítio Ativo: é uma cavidade com forma definida, revestida por cadeias laterais e aminoácidos, algumas ajudam na ligação do substrato e outras participam diretamente da catálise. É responsável pela grande especificidade das enzimas, pois permitem o reconhecimento dos substratos. As enzimas podem possuir diferentes graus de afinidade, por exemplo, algumas enzimas podem se ligar a um único aa, enquanto outras permitem a ligação de uma certa variedade de aa. 
Ajuste induzido: a ligação do substrato induz uma mudança na conformação da enzima, moldado sua forma a forma do substrato e fazendo com que adquira uma nova configuração e, dessa forma, diminua a energia de ativação.
2. Classificação e nomenclatura de enzimas 
Na terminologia usual, o nome é dado indicando o substrato, seguido de outra palavra terminada em ase que especifica o tipo de reação que a enzima catalisa.
-Oxiredutase: reações de oxidação e redução, transferência de H+ de uma molécula para outra;
-Transferases: transferências de grupos de uma molécula para a outra; 
-Hidrolases, hidrólises; 
-Liases: adição de grupos a duplas ligações ou remoção de grupos, deixando a dupla ligação;
-Isomerases: rearranjos intramoleculares;
-Ligases: condensação de duas moléculas, associadas ao consumo de ATP.
3. Fatores que interferem na reação enzimática
Assim como nas proteínas, as enzimas possuem uma forma tridimensional que permite a sua atuação adequada, e características do meio podem fazer com que sua atuação fique debilitada quando sua estrutura é modificada. Desa forma a atuação da enzima depende da estabilidade das características do meio: pH e temperatura.
Para a maioria das enzimas existe um pH ótimo para sua atuação, este pode variar conforme a necessidade de cada enzima, mas tende a ser próximo do pH neutro. O pH ótimo depende do número de grupos ionizáveis que a molécula possui.
A velocidade da reação enzima a 0°C é praticamente zero, e a velocidade da reação aumenta até o ponto em que a enzima consegue manter sua forma para atuação, perto de 50°C.
4. Cinética da reação enzimática
A velocidade de reação de uma reação enzimática é diretamente proporcional a quantidade de substrato, portanto ela varia ao longo do tempo, visto que o substrato será consumido.
Equação de Michaelis Menten
Existe uma relação entre a quantidade de substrato, a disponibiliade de enzimas e a velocidade que essa reação ocorre:
Km: é a concentração de substrato onde metade da velocidade máxima da reação é atingida. Esse parâmetro é importe para a determinação de atividades enzimáticas, afinidade enzima substrato, determinar se uma reação vai ocorrer mais rápido do que outras, etc.
	Quanto maior a concentração do substrato, mais rápido a reação vai ocorrer, até o ponto de atividade máxima, nesse ponto dizemos que a enzima está saturada: todas as moléculas enzimáticas estão formando produtos. 
A reação catalisada enzimaticamente processa-se em duas etapas: a primeira é a formação do complexo ES a partir da enzima e do substrato, na segunda fase são liberados o produto e a enzima, a última na mesma forma que entrou na reação.
O complexo enzima substrato possui uma energia de ativação muito menor, portanto um número maior de moléculas realizam a reação.
5. Cofatores enzimáticos 
As enzimas podem ser formadas unicamente por uma cadeia proteica, ou podem requerir para serem funcionais algum outro componentes químicos: os cofatores (íons, moléculas orgânicas, associadas ou não a outros íons, são as coenzimas).
A enzima ativa, ligada a seus cofatores/coenzimas é holoenzima, e apenas a parte enzimática é chamada de apoenzima.
A enzima pode ser sintetizada na célula sem estar ativa e ser modificada fora da célula. A enzima inativa é chamada zimogênio. Exemplo: pepsinogênio, tripsinogênio, quimiotripsinogênio.
Isoenzimas e isoformas de enzimas:
Varias formas para o mesmo tipo de catálise, variando local/tecido de ação. Isoenzimas são formas originadas durante a tradução, de locus gênicos diferentes, ativação de genes/alelos diferentes; isoformas são formas originadas após a tradução. 
As enzimas podem ter o sitio ativo comprometido e a sua atividade enzimática inibida, de forma reversível ou irreversível.
Inibidores irreversíveis:
Organofosforados, por exemplo, que se ligam as enzimas do sistema nervoso, e acabam bloqueando as sinapses nervosas irreversivelmente; Acido Acetil Salicílico, se liga irreversivelmente a uma ciclooxigenase, que é uma enzima que realiza reações ligadas a inflameção (formação de prostaglandinas); Penicilina, inibem a enzima que realiza a formação da parede celular bacteriana.
Inibidores reversíveis:
Competitivos – se ligam aos sítios ativos, nesse caso, a afinidade da enzima pelo substrato diminui (Km aumenta).O inibidor possui características semelhantes ao substrato. Se houver quantidades suficientes de substrato a enzima pode chegar na velocidade máxima.
Incompetitiva: o inibidor de liga ao complexo enzima-substrato e impede a formação de produtos. A velocidade máxima diminui, mas ainda que se aumente a quantidade de substrato, a velocidade máxima sempre diminui.