aula 10- MALDI -TOF

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Bombardeamento por Átomos Rápidos (FAB)
• FAB é uma técnica de ionização descrita na literatura em 1982 (Barber, et al. Nature, 1982)
• Rapidamente transformou-se uma técnica muito utilizada na espectrometria de massas.
• FAB fornece meios eficientes para analisar compostos polares, iônicos, térmicos e energeticamente lábeis e de elevado peso molecular que não podem ser analisados por EI ou CI.
• Extrema utilidade na análise de biomoléculas polares e de produtos naturais.
• Análises de íons positivos ou negativos.
FAB - Características
Na ionização por FAB, a amostra é bombardeada com átomos energéticos (Ar, Xe) com energia cinética de 8-10 keV.
	Os átomos do xenônio são ionizados a Xe+, usando elétrons. Estes íons são relativamente lentos e movimentam-se em todos os sentidos.
(b) Os íons de Xe+ são acelerados com um potencial elétrico elevado de modo que alcancem uma alta velocidade em um sentido único.
(c) A troca da carga entre íons rápidos de Xe+ e átomos lentos de Xe dá origem a um feixe de átomos rápidos de Xe e de íons lentos de Xe+. O últimos íons Xe+ são removidos pelas placas elétricas do defletor.
FAB - Características
Mecanismo de dessorção em
ionização por FAB
FAB - Características
Estrutura de algumas matrizes utilizadas em FAB
• Para cada composto deve-se escolher uma matriz adequada.
• Para cada nova análise deve-se realizar uma revisão bibliográfica para economizar tempo.
Alguns espectros de massas de FAB
Vantagens da utilização de FAB
• FAB é utilizado para compostos não voláteis e/ou termicamente lábeis 
• FAB possui sensibilidade elevada para [M + H]+ ou [M – H]-
• Faixa de Massas de ~ 7000 Da.
• O íon precursor obtido possui poucos fragmentos.
Desvantagens da utilização de FAB
• FAB requer o uso de uma matriz. As interações entre a matriz e a amostra podem complicar a análise.
• Dificuldades na escolha da matriz.
• Baixa sensibilidade em massas altas comparadas com MALDI e ESI.
• Pouca informação estrutural devido à baixa fragmentação.
Histórico
•1960 → Laser tem sido utilizado para gerar íons;
•Variedades de laser com vários comprimentos de onda diferentes;
•1970 → Primeira tentativa sistemática para gerar íons de moléculas orgânicas com laser;
•Primeira observação → Transferência de energia eficiente e controlável para a amostra requer absorção ressonante da molécula no comprimento de onda do laser;
•Segunda observação → Para evitar decomposição térmica de moléculas termicamente lábeis, energia tem que ser transferida dentro de um tempo muito curto;
•Hillenkamp e Karas → Imaginaram que a utilização de uma matriz poderia resolver alguns problemas anteriores.
A técnica MALDI: Características
•Utilização de uma baixa concentração das moléculas do analito;
•As moléculas do analito são colocadas em uma matriz sólida;
•Matriz é constituída de espécies pequenas e altamente absorventes → material sólido não volátil;
•Transferência eficiente e controlada de energia para a matriz enquanto as moléculas do analito são poupadas da energia excessiva do laser que poderia levar a sua decomposição;
•Matrizes adequadas melhoram a formação do íon das moléculas do analito por fotoexcitação ou fotoionização das moléculas da matriz seguida pela transferência de próton para a molécula do analito.
Características da Matriz
•A matriz tem duas grandes funções:
→Absorção da energia da luz do laser;
→Isolamento das moléculas do analito umas das outras.
Sugestões de mecanismos operantes em MALDI
matriz 
matriz+
fotoionização
(1)
matriz + matriz+
(2)
[matriz + H]+ + [matriz – H]
[matriz + H]+ + M
[M + H]+
(3)
Preparo da Amostra
•A amostra em uma faixa de concentração de 10-6 – 10-8 mol.L-1 é dissolvida em solventes como água, metanol, acetonitrila com traços de ácido (ácido trifluoracético 0,1 %) – Solução A
•A matriz á dissolvida em um sistema de solventes similar em uma faixa de concentração de 5,0 – 10,0 g.L-1 – Solução B
•As soluções A e B são misturadas na razão 1:1 e uma alíquota de 0,1 – 1,0 µL da amostra é então aplicada à sonda de amostra e seca com ar ou com nitrogênio.
•Resultados experimentais indicam que uma razão molar variando de 100:1 a 50.000:1 da matriz para o analito é ótima para a produção do íon.
VANTAGENS
•O número de moléculas da matriz á maior do que o número de moléculas do analito;
•Proteínas com massas moleculares de até 300.000 Da podem ser dessorvidas e ionizadas;
•A sensibilidade típica está na ordem de fentomoles a picomoles de amostra;
•É um método de ionização suave com pequena a nenhuma fragmentação observada;
•Apresenta tolerância de sais em concentrações milimolares;
•É adequada para as análises de misturas complexas.
DESVANTAGENS
•Interferência da matriz pode ocorrer com massas moleculares menores do que 1000 Da a interferência do ruído de fundo é altamente dependente do material de matriz;
•Possibilidade de fotodegradação por dessorção/ionização do laser.
CONCLUSÕES
•É um método de ionização suave que fornece informações sobre a massa molecular do composto;
•Adequada para a análise de biopolímeros e polímeros sintéticos de elevada massa molecular;
•Sensibilidade depende do analito;
•Pequena ou nenhuma fragmentação;
•Técnica de ionização pulsada, em contraste com as técnicas de EI, CI, FAB, ESI e APCI.
PROTEOMA
TODAS AS PROTEÍNAS EXPRESSAS EM UM TECIDO OU ORGANISMO, EM UM DADO MOMENTO, E EM UMA DETERMINADA CONDIÇÃO
	QUAIS ?
	QUANTO ? 
	ONDE ?
	MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUCIONAIS ?
Gel 2D:
Eletroforese de duas dimensões
	PREPARAÇÃO DE AMOSTRA
	SEPARAÇÃO POR CARGA
	SEPARAÇÃO POR TAMANHO
	VISUALIZAÇÃO
	ANÁLISE DE IMAGEM
	IDENTIFICAÇÃO
PREPARAÇÃO DE AMOSTRA
7.psd
SEPARAÇÃO POR CARGA
	pI: ponto isoelétrico
8.psd
SEPARAÇÃO POR TAMANHO
9.psd
VISUALIZAÇÃO E ANÁLISE DE IMAGEM
10.psd
ANÁLISE DE IMAGEM
A
11.psd
12.psd
TRIPSINA
TRIPSINA
QUEBRA EM LISINA (L) E ARGININA (R)
LMNNRDEAWEERIMNMNIIIVGGHTEETERG
LMNNR
DEAWEER
IMNMNIIIVGGHTEETER
617.89 Da
836.49 Da
2036.49 Da
Bactérias ! MALDI-TOF
Bactérias ! MALDI-TOF
Applications in Biology – Tissue Imaging
MW 6713
MW 18391
MW 6844
MW 7532
MALDI microanalysis
R. Caprioli
MALDI
–
“
Matrix
-
Assisted Laser 
Desorption 
Ionization
”
“
Ionização
a Laser 
Assistida por Matriz
”
(
Karas
& 
Hillenkamp
-
1987)
MALDI “…
fazendo 
um 
elefante voar
!”
MALDI “…
fazendo 
um 
elefante voar
!”
·
Prepara
-
se 
solu
ç
ão da amostra e matriz (pequenas mol
é
culas orgânicas
)
. O 
solvente 
é
evaporado resultando em uma solu
ç
ão s
ó
lido
-
s
ó
lido que 
é
depositada 
sobre 
a 
superf
í
cie da sonda. Esta solu
ç
ão 
é
então irradiada com laser. Ocorre 
aquecimento localizado e seletivo. A matriz absorve fortemente a
radia
ç
ão do 
laser. Ocorre a evapora
ç
ão r
á
pida da matriz e a mol
é
cula ionizada (ex: MH
+
) 
é
então liberada para a fase gasosa, e acelerada em dire
ç
ão ao analisador
de
massas
pelo 
alto 
potencial 
(20.000 V) 
aplicado 
à
sonda. 
MALDI
-
TOF
“Lucky Survivors” : 
em
MALDI 
predominam íons monocarregados 
(MH
+
) 
assim macromoléculas apresentam sinais 
de 
altas
m/z !
Espectros 
e 
Aplicações
Espectros 
e 
Aplicações
Pol
í
meros