ESPECTROMETRIA DE MASSAS

Prévia do material em texto

ESPECTROMETRIA DE MASSAS
ANALISE DE ALIMENTOS II
Professora – Marta Suely Madruga
Universidade Federal da Paraíba
Centro de Tecnologia
Departamento de Engenharia de Alimentos
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
INTRODUÇÃO
A Espectrometria de massas fragmenta um composto puro que tenha sido previamente isolado por cromatografia líquida ou gasosa, ou outro método qualquer, coleta os fragmentos dotados de carga elétrica de acordo com a relação massa carga (m/z) e fornece ao analista um histograma de abundância relativa de cada fragmento.
O espectro de massas é um histograma que mostra a frequência relativa de íons de acordo com a relação massa/carga. 
Técnica analítica para identificação e quantificação de compostos e caracterização molecular e estrutural de amostras, com base na sua composição elementar.
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
INTRODUÇÃO
PRINCÍPIOS
Auxiliar na determinação da estrutura de um composto desconhecido com ajuda de outros métodos, como espectrometria no ultravioleta e infravermelho e ressonância magnética nuclear
Confirmar a identidade de compostos por meio da comparação de espectros de compostos conhecidos
Quantificar compostos de estrutura conhecida por meio da monitoração de um fragmento específico e com alta abundância
Determinar a massa molecular de compostos
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
INTRODUÇÃO
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
Componentes básicos de MS
VÁCUO
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
AMOSTRAS
Sistema de Inserção (INLET) das amostras
LC-Cromatografia Líquida
GC- Cromatografia Gasosa
Eletroforese
Inserção Direta
LÍQUIDA
SÓLIDA
GASOSA
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
AMOSTRAS
Exemplo de sistema de inserção
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
IONIZAÇÃO
O espectro de massas produz, separa e detecta íons na fase gasosa.
Os íons são obtidos por colisão das moléculas do composto de interesse com elétrons ou outros íons.
A colisão transfere um excesso de energia para as moléculas que além de ionizar, sofrem subsequente fragmentação
Os tipos de fragmentação mais importante em análise de alimentos são: ionização eletrônica (IE), ionização química (IO) e métodos brandos de ionização, como bombardeamento rápidos de átomos, dessorção/ionização com laser (laser desoption ) e electrospray.
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
IONIZAÇÃO - Eletrônica
Método mais simples e mais usado de ionização
Um feixe de elétrons de alta energia (70V) incide sobre o feixe de moléculas que vem do inlet, removendo um elétron de algumas moléculas, formando um cátion radical
Os cátions são direcionados pela placa repelente (+) em direção às placas aceleradoras (-), que produzem um feixe de cátions de alta velocidade em direção ao analisador
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
IONIZAÇÃO - Eletrônica
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
IONIZAÇÃO - Química
 Consiste em um feixe de moléculas de um gás reagente pré ionizado causa ionização das moléculas que vem do inlet;
Tipos de gases usados: metano, amônia isobutanol;
A ionização pode ocorrer por:
Transferência de próton: origina uma molécula na forma (M-H)+
Transferência de elétron: formação de um íon negativo por adição à molécula de um elétron ou de uma espécie negativamente carregada;
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
IONIZAÇÃO - Química
 Dependendo do gás utilizado, obtém-se um maior ou menor grau de fragmentação
Escolha do gás apropriado, é possível obter um espectro praticamente intacto, quando comparado a outros métodos de ionização.
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
IONIZAÇÃO - Química
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
IONIZAÇÃO - Bombardeamento Rápido
Fast atom bombardment –FAB
Essa técnica está incluída entre os métodos de ionização e dessorção simultâneas que permitem submeter compostos não voláteis e termicamente instáveis à MS. Técnica considerada branda.
O composto de interesse á mantido em solução e bombardeado com um feixe de átomos de argônio (Ar) ou xenônio (Xe).
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
IONIZAÇÃO - Bombardeamento Rápido
Fast atom bombardment –FAB
*Rapidez e simplicidade
*Tolerante às variações na amostra
*Corrente intensa de íons (bom para altas resoluções)
Requer que o analito seja solúvel na matriz líquida
*Requer pureza e boa quantidade de amostra
*Não é adequado para compostos com mais de duas cargas
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
IONIZAÇÃO - Bombardeamento Rápido
2) Matrix-assited laser desorption/ionization (MALDI)
Técnica branda que sua um laser para transferir energia para moléculas em solução, volatilizando-as e ionizando-as.
Mistura do solvente com a amostra de forma adequada permite que a radiação laser seja absorvida de maneira eficiente.
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
IONIZAÇÃO - Bombardeamento Rápido
2) Matrix-assited laser desorption/ionization (MALDI)
*Baixa concentração do analito
*Velocidade
*Análise de polímeros e macromoléculas polares e não polares (M>50.000)
*Não compatível com LC/MS
*Difícil obtenção de espectros de MS/MS
*Deve ser usados como analisadores compatíves com métodos pulsados (TOF ou FT-ICR)
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
IONIZAÇÃO - Bombardeamento Rápido
3) Electrospray -ESI
Substância dissolvida numa mistura (ex. água-metanol), é injetada diretamente, por HPLC ou por eletroforese capilar.
Íons são formados a partir de gotas a pressão atmosférica e formam um jato de expansão livre. A amostragem ocorre através de um “skimmer”, e introduzidos no alto vácuo do espectrômetro.
Íons com carga múltipla podem ser detectados mesmos com instrumentos menos sofisticados. 
 O número de cargas pode depender do pH, da presença de sais, desnaturação da proteína, quebra de ligações S-S, etc. 
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
IONIZAÇÃO - Bombardeamento Rápido
3) Electrospray-ESI
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
IONIZAÇÃO - Bombardeamento Rápido
3) Electrospray-ESI
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
IONIZAÇÃO - Química à Pressão Atmosférica
Variante da electrospray, porém ocorre a pressão atmosférica e não em vácuo
Pode ser usado para compostos com massas moleculares de até 1.200u.
A nebulização ocorre a Patm e a ionização é iniciada por descarga elétrica 
Os íons passam por um gás secante ( nitrogênio) e depois passam por câmaras intermediarias onde o solvente é eliminado
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
IONIZAÇÃO - Química à Pressão Atmosférica
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
SEPARAÇÃO E CAPTURA DOS ÍONS
O ANALISADOR É O 
A Separação dos íons pode ser conseguida:
 submetendo-os à influência de um campo magnético;
Submetendo-os a uma combinação de campos criados por corrente contínua e frequência de rádio (quadropolo);
Por efeito de ressonância ciclotrônica de íons;
Medindo tempo de migração de cada fragmento ao percorrer uma distancia fixa (time-of-flight).
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
SEPARAÇÃO E CAPTURA DOS ÍONS
Campo Magnético
A separação dos íons com diferente massas ocorre porque, sob efeito do campo magnético, o grau de deflexão que cada íons sofre depende de sua massa.
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
SEPARAÇÃO E CAPTURA DOS ÍONS
QUADRUPOLO
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
SEPARAÇÃO E CAPTURA DOS ÍONS
QUADRUPOLO
Um campo quadrupolo é formado por quatro rolos paralelos aos quais aplica-se uma corrente contínua que afeta o percurso dos íons viajando pelo trajeto centralizado entre os 4 rolos. 
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
SEPARAÇÃO E CAPTURA DOS ÍONS
Armadilha de íons (Ion Trap)
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
SEPARAÇÃO E CAPTURA DOS ÍONS
Tempo de vôo -Time-of-flight (TOF)
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
SEPARAÇÃO E CAPTURA DOS ÍONS
Tempo de vôo -Time-of-flight (TOF)
Não existe campo elétrico ou magnético
Não há limite superior de detecção de m/z
É o mais precisos quando comparado com os demais, permitindo análise elementar
Podem fazer até 100 espectros por segundo.
http://www2.iq.usp.br/docente/lhc/disciplinas/qfl5922-2011/2011_massa_-_bloco_1_-_lique.pdf
http://slideplayer.com.br/slide/288820/
http://pt.slideshare.net/lhaisleal/espectrometria-de-massas-princpios-e-aplicaes
29
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
SEPARAÇÃO E CAPTURADOS ÍONS
Ressonância Ciclotrônica de íons
http://www2.iq.usp.br/docente/lhc/disciplinas/qfl5922-2011/2011_massa_-_bloco_1_-_lique.pdf
http://slideplayer.com.br/slide/288820/
http://pt.slideshare.net/lhaisleal/espectrometria-de-massas-princpios-e-aplicaes
30
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
DETECÇÃO DOS ÍONS 
http://www2.iq.usp.br/docente/lhc/disciplinas/qfl5922-2011/2011_massa_-_bloco_1_-_lique.pdf
http://slideplayer.com.br/slide/288820/
http://pt.slideshare.net/lhaisleal/espectrometria-de-massas-princpios-e-aplicaes
31
FOTOMULTIPLICADORES
Multiplica uma corrente eletrônica, por aceleração de elétrons na superfície de um eletrodo.
PLACAS DE MICROS CANAIS (MCP)
Íon que colidir com a parede interna dos capilares criará uma avalanche de elétrons secundários.
Um arranjo de capilares de vidro, material condutor de energia elétrica de alta voltagem 
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
ANÁLISE DOS DADOS 
http://www2.iq.usp.br/docente/lhc/disciplinas/qfl5922-2011/2011_massa_-_bloco_1_-_lique.pdf
http://slideplayer.com.br/slide/288820/
http://pt.slideshare.net/lhaisleal/espectrometria-de-massas-princpios-e-aplicaes
32
Determinação da massa molecular
Quantificação de compostos
Determinação da estrutura molecular de composto desconhecido
Confirmação da identidade de compostos 
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
ANÁLISE DOS DADOS – 
Determinação de massa molecular 
Para macromoléculas a medição da massa molecular pode ajudar a confirmar mutações em proteínas , sequencia de DNA, composição oligonucleotídeos, teor de carboidratos em proteínas e término da síntese de diversos tipos de macromoléculas.
A exatidão na medição é garantida com o uso de um composto de referência.
As massas dos íons podem ser expressas:
*Nominais: calculada com base no isótopo mais abundante de cada elemento arredondando o valor de cada elemento para um casa decimal.
*Monoisotópicas: calculas como anterior , mas sem arredondar o valor de cada elemento
*Mais abundante: Correspondendo ao pico do mesmo fragmento mas com isótopos diferentes.
*Média: calculo da média ponderada de um conjunto vizinho de picos do mesmo fragmento mas com isótopos diferentes.
http://www2.iq.usp.br/docente/lhc/disciplinas/qfl5922-2011/2011_massa_-_bloco_1_-_lique.pdf
http://slideplayer.com.br/slide/288820/
http://pt.slideshare.net/lhaisleal/espectrometria-de-massas-princpios-e-aplicaes
33
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
ANÁLISE DOS DADOS – 
Determinação de massa molecular 
http://www2.iq.usp.br/docente/lhc/disciplinas/qfl5922-2011/2011_massa_-_bloco_1_-_lique.pdf
http://slideplayer.com.br/slide/288820/
http://pt.slideshare.net/lhaisleal/espectrometria-de-massas-princpios-e-aplicaes
34
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
ANÁLISE DOS DADOS – 
Determinação da estrutura molecular de compostos desconhecidos
Utiliza-se a tabela de abundancia natural dos isótopos para realizar o calculo da formula molecular.
Identificar os picos dos isótopos permite o calculo da formula molecular do composto por indicar quais são os elementos presentes no composto e em que proporção.
http://www2.iq.usp.br/docente/lhc/disciplinas/qfl5922-2011/2011_massa_-_bloco_1_-_lique.pdf
http://slideplayer.com.br/slide/288820/
http://pt.slideshare.net/lhaisleal/espectrometria-de-massas-princpios-e-aplicaes
35
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
ANÁLISE DOS DADOS – 
Confirmação da Identidade de Compostos 
A identificação do composto pode ser realizada por meio de comparação do espectro do composto obtido anteriormente com um padrão de referencia
Através de bibliotecas de espectro de massas, compiladas por diversa organizações.
http://www2.iq.usp.br/docente/lhc/disciplinas/qfl5922-2011/2011_massa_-_bloco_1_-_lique.pdf
http://slideplayer.com.br/slide/288820/
http://pt.slideshare.net/lhaisleal/espectrometria-de-massas-princpios-e-aplicaes
36
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
ANÁLISE DOS DADOS – 
Confirmação da Identidade de Compostos 
http://www2.iq.usp.br/docente/lhc/disciplinas/qfl5922-2011/2011_massa_-_bloco_1_-_lique.pdf
http://slideplayer.com.br/slide/288820/
http://pt.slideshare.net/lhaisleal/espectrometria-de-massas-princpios-e-aplicaes
37
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
ANÁLISE DOS DADOS – 
Confirmação da Identidade de Compostos 
http://www2.iq.usp.br/docente/lhc/disciplinas/qfl5922-2011/2011_massa_-_bloco_1_-_lique.pdf
http://slideplayer.com.br/slide/288820/
http://pt.slideshare.net/lhaisleal/espectrometria-de-massas-princpios-e-aplicaes
38
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
ANÁLISE DOS DADOS – 
Confirmação da Identidade de Compostos 
LRI = [(RTx – RTn / RT n+1 – RTn) +n] x 100
IK = [n+(N - n) log(tn) – log (tn-1)
 log(tn+1) – log (tn)
http://www2.iq.usp.br/docente/lhc/disciplinas/qfl5922-2011/2011_massa_-_bloco_1_-_lique.pdf
http://slideplayer.com.br/slide/288820/
http://pt.slideshare.net/lhaisleal/espectrometria-de-massas-princpios-e-aplicaes
39
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
ANÁLISE DOS DADOS – Quantificação de Compostos
É conseguida por meio da monitorização de um ou mais fragmentos específicos e com alta abundância.
A matriz utilizada influencia a resposta, o que obriga o emprego de curvas de calibração
Pode-se utilizar padrão interno, um composto de concentração e espectro conhecidos
http://www2.iq.usp.br/docente/lhc/disciplinas/qfl5922-2011/2011_massa_-_bloco_1_-_lique.pdf
http://slideplayer.com.br/slide/288820/
http://pt.slideshare.net/lhaisleal/espectrometria-de-massas-princpios-e-aplicaes
40
ESPECTROMETRIA DE MASSAS
APLICAÇÕES
http://www2.iq.usp.br/docente/lhc/disciplinas/qfl5922-2011/2011_massa_-_bloco_1_-_lique.pdf
http://slideplayer.com.br/slide/288820/
http://pt.slideshare.net/lhaisleal/espectrometria-de-massas-princpios-e-aplicaes
41
Identificação e Classificação de microrganismos presentes em alimentos
Identificação e quantificação de compostos voláteis de diversas matrizes alimentares.
Determinar a massa molecular e quantificar biomoléculas: carboidratos, proteínas e lipídeos
Controle de qualidade de leite e derivados (fraldes e adulterações)