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Micologia Clínica 1 Micologia Clínica Profª Ana Paula da Rocha Takushi Micologia Clínica 2 Introdução 3 Micologia Geral 4 Reino Fungi 4 Reprodução 7 Reprodução assexuada 7 Reprodução sexuada 8 Taxonomia 10 Micoses 12 Micoses Superficiais 12 Micoses Cutâneas 14 Micoses Subcutâneas 17 Micoses Sistêmicas 20 Micoses Oportunistas e Outras 22 Antifúngicos 25 Técnicas Laboratoriais 27 Coleta 27 Identificação 28 Isolamento/semeadura 32 Antifungigrama 32 Referências 34 Sumário Micologia Clínica 3 Introdução Os fungos estão presentes em nosso planeta há muito tempo. Há especulações científicas de que esses microrga- nismos são os primeiros eucariontes, porém, devido à dificuldade em sua classificação no decorrer das décadas, não há um estudo profundo e conclusivo de sua cronologia. Estudos recentes demonstram achados fósseis de cé- lulas fúngicas entre 760 milhões e 1,06 bilhão de anos atrás, porém a comunidade científica ainda defende que os fungos colonizaram a terra no período câmbrico (542- 488 milhões de anos), ou seja, muito antes das plantas terrestres. Esse grupo de microrganismos foi por muito tempo classificado como reino Monera, depois Protista, e alguns exemplares, até mesmo como Plantae. Somente em 1969, com o desenvolvimento de técnicas de identificação bio- químicas e celulares, foi criado o reino Fungi. Hoje temos conhecimento de cerca de 100.000 espé- cies catalogadas no reino Fungi. Os fungos possuem distribuição mundial e são ubí- quos, desenvolvendo-se em qualquer habitat, de regiões áridas a aquáticas, com resistência a altas concentrações de sais, a diferentes pressões atmosféricas e, em algumas espécies, até mesmo a radiações ultravioletas e cósmicas. Portanto, sua distribuição é facilitada por essas condições de resistências e adaptação. Os fungos são de conhecimento de antigas civilizações e há muito tempo já eram empregados na alimentação, como fonte alimentícia ou na fermentação de outros ele- mentos. Em cerimônias religiosas, eram usados como alu- cinógenos e até mesmo como veneno. Mas foi a partir de 1940 que o fungo ganhou uma em- pregabilidade notável para a humanidade na composição de antibióticos. Possui destaque na indústria farmacêu- tica e alimentícia e recentemente também passou a ser utilizado na indústria química e agrotóxica. O fungo é um microrganismo eucariota e com células microscópicas, porém pode tornar-se notado quando fru- tifica, seja como cogumelos ou como bolores. Então, vamos conhecer um pouco mais sobre esses microrganismos de ampla dispersão e variadas caracterís- ticas e propriedades. Micologia Clínica 4 Micologia Geral O termo micologia tem origem na linguagem grega, na qual mykes significa cogumelo e logos, estudo, ou seja, é o estudo dos cogumelos. É uma parte da ciência microbiológica que estuda as características morfológicas, fisiológicas, bioquímicas e genéticas dos fungos, assim como suas interações com o meio ambiente e com outros seres vivos. Esses estudos são as bases para classificação taxonômica e até mesmo revisão de classificações anteriores. No universo clínico, esse estudo é direcionado para identificação das características de colonização dos fun- gos e dos efeitos nocivos à saúde do homem e para o desenvolvimento de terapias de combate à proliferação deles e de inativação de suas toxinas e seus efeitos cola- terais. Reino Fungi O reino Fungi foi criado em 1969, após descoberta de características celulares que diferenciavam os fungos dos reinos Monera e Plantae. A presença de quitina na parede celular, a ausência de celulose (com exceção de algumas espécies aquáticas), a não produção de clorofila e o uso do glicogênio como re- serva energética, semelhante à célula animal, propiciou a esse grupo uma nova classificação. Os representantes desse grupo são eucariontes, po- dendo possuir um ou vários núcleos, delimitados por uma membrana nuclear. Possuem uma parede celular rígida, composta por glu- canas, mananas, quitina, proteínas e lipídeos. A parede fúngica pode apresentar até oito camadas, sendo que cada uma possui um polissacarídeo dominante que con- tribui para a taxonomia desses microrganismos. Para entender melhor a composição das camadas da parede celular fúngica, veja a tabela: Esquema: camadas da parede celular fúngica Camada Composição 1 Finos filamentos de associações a proteínas, formando glico- proteínas, manoproteínas e glicomanoproteínas. 2 Camada contínua de glicoproteínas, manoproteínas e glicoma- noproteínas. 3 Camada de glicoproteínas, manoproteínas e glicomanoproteí- nas com baixa densidade. 4 Camada de glicoproteínas, manoproteínas e glicomanoproteí- nas com alta densidade. 5 Camada não delineada de glucanas e quitina. 6 Camada não homogênea de mananas e proteínas. 7 Camada espessa de quitina e glucanas. 8 Camada irregular de quitina, proteínas e polissacarídeos. Micologia Clínica 5 As mananas representam o material amorfo das cé- lulas fúngicas. São divididas em não enzimática e en- zimática; esta última está envolvida na degradação de macromoléculas. A quitina é responsável pela rigidez e formatação da parede celular. Os lipídeos estão presen- tes em menor quantidade e conferem a propriedades de compostos apolares e polares. A membrana citoplasmática fúngica possui uma dife- renciação em relação às membranas bacterianas, devido à composição de esteroides. O núcleo é composto por uma dupla fita helicoidal de DNA e possui um nucléolo composto por DNA, RNA e proteínas. Esse material é delimitado por uma membrana nuclear que, durante a divisão celular, desaparece, retor- nando quando o processo é finalizado. No citoplasma, há presença de ribossomos, mitocôn- drias, retículo endoplasmático com aparelho de Golgi e lomassomos. Figura 1- Célula eucarionte. Fonte: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Celula2.gif. Micologia Clínica 6 Os fungos são, em sua maioria, aeróbios, mas pode- mos encontrar algumas formas de leveduras anaeróbias facultativas, muito empregadas nas indústria alimentícias para fermentação. São psicrófilas, mesófilas e termófilas, o que propor- ciona a presença em diferentes ambientes, porém os fun- gos de interesse clínico são, em sua maioria, mesófilos. Os fungos podem apresentar-se com formas variáveis, de acordo com sua classificação e seu estágio de vida/fase reprodutiva. As colônias pastosas e geralmente esbranquiçadas são classificadas como leveduriformes, e as colônias algodo- nosas e aveludadas que caracterizam o bolor são classifi- cadas como fungos filamentosos. As colônias filamen- tosas são formadas por elementos multicelula- res em forma de tubo, denominados hifas. As hifas podem ser con- tínuas, não septadas, cenocíticas ou septadas e podem possuir um ou mais núcleos, sendo classificadas como ha- ploides e dicarióticas. Figura 2 – Colônias leveduriformes. Fonte: http://www.agorams.com.br/ jo rna l /2012/03/mode lo -de - se l ecao -de - l eveduras - se ra - apresentado-em-simposio/. Figura 3 – Colônia filamentosa. Fonte: http://www.portaleducacao.com. br/nutricao/artigos/14906/bolores. As leveduras são unicelulares, portanto suas células desempenham a função vegetativa e reprodutiva. A re- produção da levedura, em sua grande maioria, é assexua- da, por brotamento ou gemulação. Elas são encontradas onde há concentração de matéria orgânica, sendo comuns em superfícies de vegetais, trato intestinal e substratos lí- quidos ou semilíquidos com alta concentração de carboi- dratos. Geralmente saprófitas ou parasitas, secretam en- zimas digestivas no substrato onde se desenvolvem. Essas enzimas catalisam a quebra de macromoléculas em molé- culas menores para serem absorvidas pela célula fúngica. O conjunto de hifas forma o micélio. Este, quando no interior do substrato, é chamado de micélio vegetativo e, quando cresce acima do substrato, é denominado de micélio reprodutivo. Podem ser saprófitos, parasitas ou simbióticos. É importante destacar que osfungos podem apresen- tar morfologia diferenciada de acordo com exposição à pressão, variação de temperatura, pH e condições nutri- cionais. Essa diferenciação é denominado dimorfismo e/ ou pleomorfismo. Figura 4 - Tipos de hifas. Fonte: http:// www.sobiologia.com.br/conteudos/ Reinos/biofungos2.php. Figura 5 – Decomposição. Fonte: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/2/27/ DecayingPeachSmall.gif. Micologia Clínica 7 Reprodução Os fungos podem apresentar reprodução assexuada ou sexuada, sendo que essa variação reflete-se diretamente na morfologia apresentada. A reprodução pode originar-se do micélio germinativo por brotamento, fragmentação ou esporulação, ou, ainda, do micélio reprodutivo com a formação dos propágulos assexuados e sexuados. A estrutura reprodutiva possui papel fundamental na identificação e classificação do fungo. Sendo assim, é muito importante entendermos como as fases assexuadas e sexuadas ocorrem e quais são as estruturas responsáveis e ca- racterísticas dessas fases. Reprodução assexuada A reprodução assexuada pode ser proveniente de uma célula ou micélio vegetativo, formando blastoconídeos, artroconídeos, clamidoconídios e esclerotos, ou ter ori- gem em células ou micélios com funções reprodutivas, originando conídios, picnidioconídios e esporangiósporos. A fase assexuada dos fungos é denominada anamórfi- ca ou imperfeita. Vamos conhecer cada estrutura reprodutiva assexuada e suas interações morfológicas. Blastoconídeos – originam-se pelo brotamento ou ge- mulação da célula mãe, podendo ficar ou não ligados a ela. Quando ligados, formam a pseudo-hifas. Estas são frequentemente encontradas na gemulação das leve- duras quando em pH e temperatura adequados. Artroconídeos – originam-se da fragmentação aciden- tal ou espontânea de uma hifa. Figura 6 – Blastoconídeos. Fonte: http://biomedicinaunic.blogspot.com. br/2010/09/os-fungos.html. Figura 7 – Artroconídeos. Fonte: http://biomedicinaunic.blogspot.com. br/2010/09/os-fungos.html. Clamidoconídios – é a formação de esporos dentro de uma célula fúngica que possui seu tamanho aumenta- do com o surgimento de paredes duplas e espessas, conferindo ao fungo resistência a condições ambien- tais adversas. Pode ser localizado no corpo da hifa, denominado clamidoconídio intercalar, ou na região apical, denominado clamidoconídio terminal. Figura 8 – Clamidoconídio. Fonte: http://biomedicinaunic.blogspot.com. br/2010/09/os-fungos.html. Micologia Clínica 8 Esclerotos – também conhecido como escle- rócios, são corpúsculos rígidos formados por um conjunto de hifas em estado de dormên- cia até possuir condi- ções adequadas para germinação, conferindo ao fungo grande resis- tência a condições ambientais impróprias. Conídios – são gerados por células conidiogênicas, que, por meio de estruturas denominados conidiófo- ros, podem ser ou não ramificadas, formando os co- nídios. Os conídios apresentam formas variáveis e po- dem ou não apresentar pigmentação. Picnidioconídio – algumas células conidiogênicas for- mam um corpo frutificativo piriforme denominado picnídio e, dentro dessa estrutura há a formação dos conidióforos e conídios. Esporangiosporos – são estruturas originadas por um processo interno de clivagem do citoplasma dos pro- págulos assexuados, denominados esporângios, que é sustentado pelo esporangióforo. Reprodução sexuada A reprodução sexuada é caracterizada pela formação dos propágulos sexuados, que podem ser internos, deno- minados ascósporos, ou estruturas externas, denomina- das basidiósporos. Ocorre com a fusão de duas células haploides forman- do um zigoto, com posterior divisão meiótica, que leva à formação de até oito núcleos haploides. A fase de reprodução sexuada é denominada de tele- mórfica ou perfeita e é responsável pelas inúmeras espé- cies e variações morfológicas existentes. Pode gerar, em algumas fases, estruturas assexuadas e, posteriormente, retornar à fase sexuada. Figura 9 – Escleroto. Fonte: http:// s ian . in ia .gob.ve/ repos i tor io/ revistas_ci/Agronomia%20Tropical/ at2102/imagen/polanco_4.jpg Figura 10 – Conídios. Fonte: http://www.aloj.us.es/carromzar/Botanica_I/ Temas_Botanica_I/T6_Deuteromicetos.html. Figura 11 – Picnidioconídio. Fonte: http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/ disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/const_microorg/fungos.htm. Figura 12 – Esporangiosporos. Fonte: http://www.enq.ufsc.br/labs/ probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/const_microorg/fungos.htm. Micologia Clínica 9 Vamos conhecer cada estrutura reprodutiva sexuada e suas interações morfológicas. Figura 13 – Reprodução sexuada. Fonte: http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/const_microorg/fungos.htm Ascósporos – são propágulos formados dentro de uma estrutura reprodutiva chamada asco. Esses ascos podem ser simples, distribuindo-se nas cavidades do micélio, ou ainda constituir o corpo de frutificação, denominado o asco- carpo. Temos três tipos de ascocarpos conhecidos, com variação em suas formas e na distribuição dos ascos em seu interior. Figura 14 – Ascósporos. Fonte: http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/const_microorg/fungos.htm. Micologia Clínica 10 Basidiósporos – são propágulos externos formados dentro de uma estrutura reprodutiva denominada basídio. Esse tipo de reprodução é comumente encontrada nos fungos macroscópicos. Taxonomia A taxonomia dos fungos não é uma tarefa fácil e está em constante adequação devido às descobertas recentes proporcionadas por novas técnicas de estudo moleculares e morfológicas. Eles classificam-se basicamente em dois gru- pos, os fungos verdadeiros (Eumycota) e os fungos imperfeitos (Deuteromycota). Sua classificação taxonômica segue a mesma padronização dos outros reinos, partindo de reino para filo, classe, ordem, família, gênero e espécie. O nome do fungo é constituído de gênero e espécie. A divisão mais difundida baseada nas características reprodutivas é a proposta por McGinnis em 1990, segundo a qual o reino Fungi possui cinco divisões ou filos: Cythridiomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota e Deute- romycota Figura 15 – Basidiósporos. Fonte: http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/const_microorg/fungos.htm. Micologia Clínica 11 Apenas quatro divisões possuem interesse clínico: Ascomycota - são chamados de ascomicetos e abran- gem a metade de todas as espécies descritas de fungo. Sua principal característica é a formação de asco (hifas septadas em forma de saco). Algumas espécies de asco- micetos vivem associadas a algas ou cianobactérias, for- mando os liquens. As classes que apresentam interesse clínico nessa divisão são Hemiascomycetes, Loculoasco- mucetes e Plectomycetes. Basidiomycota - são chamados de basidiomicetos, denominados fungos superiores ou cogumelos. Sua re- produção sexuada é caracterizada pela formação de ba- sidiósporos. A classe que apresenta interesse clínico é Teliomycetes. Deuteromycota - são chamados de deuteromicetos ou fungos imperfeitos, por não apresentarem reprodução sexuada. Sua reprodução assexuada é caracterizada pela formação de conídios. Muitos fungos que foram classifi- cados como deuteromicetos foram ou estão sendo reclas- sificados em outros filos. As três classes que apresentam interesse médico são Blastomycetes, Coelomycetes e Hyphomycetes. Zygomycota - chamados de zigomicetos ou ficomi- cetos, os fungos pertencentes a esse filo não formam o corpo de frutificação, pois seu micélio é cenocítico. A re- produção sexuada é por zigósporos, e a assexuada, por esporangiosporos. Essa divisão engloba duas classes, Tri- chomycetes e Zygomycetes, esta última de grande inte- resse médico. Figura 16 – Filos de fungos com interesse clínico. Fonte: http://ambiors. spaceblog.com.br/197619/Reino-Fungi/ Micologia Clínica 12 Micoses O hospedeiro pode desencadear uma resposta imuno- lógica inespecífica, mediada por barreiras físicas – pele, membranas ecélulas imunológicas não específicas –, ou ainda, uma resposta imunológica específica, mediada por macrófagos, linfócitos e anticorpos. A prevenção consiste em uso de máscara para evi- tar aerossóis em ambientes propícios, uso de calçados e roupas para evitar traumatismos. A fim de minimizar as infecções fúngicas hospitalares, é importante o emprego de higiene local e assepsia, assim como o uso de filtros e isolamento em casos mais graves. As micoses são infecções causadas por fungos. Con- siderando que os fungos são ubíquos, a não exposição a eles é improvável, portanto, as condições de higiene, umidade, calor e resistência imunológica serão os fatores determinantes para o desenvolvimento dessas infecções. A contaminação pode ocorrer por fontes endógenas ou exógenas. Endemias e epidemias são regionalizadas e concentradas em grupos de mesmas atividades. Idade, sexo e raça desempenham papel importante no desenvol- vimento de certas micoses. As micoses são classificadas conforme os tecidos e ór- gãos atingidos: superficiais, cutâneas, subcutâneas, sistê- micas e oportunistas. Micoses Superficiais São as micoses com comprometimento da camada mais superficial da pele e dos pelos. As micoses superficiais são causadas geralmente por fungos saprofíticos. As principais micoses representadas por esse grupo são: pitiríase versicolor, tinea nigra, piedra negra e piedra branca. Pitiríase versicolor Micose causada pela Malassezia furfur. Esse microrga- nismo, na forma leveduriforme, está presente na micro- biota da pele, tornando-se patógeno quando na forma filamentosa. É um fungo lipofílico, portanto, seu cultivo requer substâncias oleaginosas. Geralmente, ao meio de cultivo é adicionado azeite de oliva para melhor resultado do crescimento. Em meio de cultura, as colônias de Malassezia furfur são de cor branca a creme, de aspecto cremoso e brilhoso. Figura 17 - Malassezia furfur. Fonte: http://www.gefor.4t.com/hongos/ malasseziafurfur.html. Micologia Clínica 13 Essa micose de pele é caracterizada por lesões hipo ou hiperpigmentadas, furfuráceas (farinhosas), de bordas delimitadas. Geralmente são localizadas em tórax, abdo- me, pescoço, face, membros inferiores e superiores, axi- las e coxas. Também podem atingir áreas cobertas com pelo, tornando-se reservatórios do fungo. Alguns casos estão relacionados à dermatite seborreica. Tem incidên- cia em regiões tropicais e subtropicais, sendo conhecida como micose de praia. do-se filamentosa, aveludada e de coloração verde-escura com o tempo. Essa micose é caracterizada por infecções assintomá- ticas na sola do pé ou na palma da mão, formando uma mancha escura fuliginosa. O tratamento consiste no uso tópico de iodo e agentes ceratinofílicos. Piedras brancas e piedras pretas As piedras brancas são causadas por Trichosporon bei- gelii e geralmente afetam os pelos das regiões genitais. As colônias de crescimento rápido possuem característi- ca leveduriformes. Seus micélios são compostos por hifas septadas e ramificadas, formando artroconídeos e blasto- conídeos. Figura 18 – Pitiríase versicolor. Fonte: http://geriderme. blogspot.com.br/2011/11/sera-que-e-pano-branco. html. O tratamento baseia-se na aplicação tópica de hipos- sulfito de sódio 40% e/ou uso oral de imidazólico. Tinea nigra Também conhecida como tinha negra, é causada por Phaeoannelomyces werneckii ou Stenella araguata, fun- gos filamentosos que, quando em meio de cultura, apre- sentam colônia úmida, brilhante e leveduriforme, tornan- Figura 19 – Hifas de tinea nigra. Fonte: http://piel-l.org/blog/339. Figura 20 - Lesão de tinea nigra. Fonte: http://www.healthhype.com/ tinea-nigra-black-fungus-on-palm-or-sole-information-and-pictures.html. Micologia Clínica 14 A piedra negra é causa por Piedraia hortae e geralmen- te afeta a região capilar. As colônias são escuras, formadas por hifas unidas contendo asco que possuem ascósporos típicos, fusiformes com filamento polar. As piedras são infecções caracterizadas pela presen- ça de nódulos – trama de hifas irregulares – nos pelos, podendo ser claros ou negros, de acordo com o agente etiológico. Figura 21 – Piedra branca. Fonte: http://scielo.sld.cu/img/revistas/mtr/ v61n2/f0115209.jpg. Figura 23 – Piedra negra. Fonte: http://www.doctorfungus.org/thefungi/ img/pie1_l.jpg. O tratamento é à base de álcool sublimado 1/2.000 e corte dos pelos das regiões infectadas. Micoses Cutâneas Também conhecidas como dermatomicoses, são as micoses causadas por dermatófitos, fungos filamentosos que comprometem pele, pelos, unhas e mucosas. As lesões cutâneas geralmente ramificam; após sete dias, iniciam uma reação cutânea com formação de ve- sículas ao redor e, posteriormente, descamação e bordas eritematosas de propagação radial. A infecção do pelo pode ser externa, classificada como ectothrix, na qual o fungo fica circunscrito à bainha ex- terna, ou interna, classificada como endothrix, na qual o fungo destrói a bainha externa, proliferando no interior do pelo. Ela ainda ser caracterizada pelas duas fases, com classificação endoectothrix. Quando a infecção é no nível da unha, as infecções iniciam-se na margem lateral ou distal da placa ungueal e resultam em inflamação paroniquial com radiação subun- gueal, tornando-a quebradiça e porosa, com alteração na coloração. Os dermatófitos são taxonomicamente relacionados, pertencentes aos gêneros Trichophyton, Microsporum, Epidermophyton, Arthroderma e Candida. Os Trichophyton apresentam colônias de crescimento rápido, algodonosas com reservo multicor, e possuem hi- fas claviformes multisseptadas. O Trichophyton rubrum possui crescimento lento, co- lônia branca de consistência algodonosa, aveludada ou granular. A principal característica é a produção de um pigmento hidrossolúvel de coloração vinho no reverso da colônia que se difunde no ágar. Esse fungo pode causar nódulos ou abscessos subcutâneos em pacientes imuno- deprimidos. Micologia Clínica 15 O Trichophyton mentagrophytes possui crescimento rápido e dois tipos de colônias: algodonosa ou granular. As colônias apresentam coloração branca a amarelo- -forte, tornando-se acastanhadas e marrons. Pigmentos avermelhados podem ser observados, mas nunca são tão intensos quanto a vermelhidão do T. rubrum. É causa co- mum de pé de atleta. O Trichophyton tonsurans possui crescimento len- to, exigindo de 7-10 dias para a maturidade. As colônias apresentam superfície amarelo-clara granular caracterís- tica, com o desenvolvimento de profundas rugas radiais no amadurecimento. Macronídios nunca são observados nos isolados laboratoriais, e os microconídios assumem formato de baqueta ou balão. Causa tinha do couro cabe- ludo, tinha capilar com pontos pretos e às vezes dermato- fitose do corpo, dos pés e das unhas. No Brasil, os dermatófitos mais frequentes são T. ru- brum e M. canis. Os Microsporum apresentam colônias de crescimen- to rápido, algodonosas ou pulverulentas, com reverso de amarelo a marrom. Possuem hifas fusiformes, isoladas, multisseptadas. Figura 26 - Trichophyton mentagrophytes. Fonte: http://www.mold.ph/ trichophyton-mentagrophytes.htm. Figura 25 - Trichophyton rubrum. Fonte: http://www.provlab.ab.ca/ mycol/tutorials/derm/trub.htm. Figura 27 - Pé de atleta causada por Trichophyton mentagrophytes. Fonte: http://podologasidasidonia.blogspot.com.br/2011/08/infeccoes- por-dermatofitos-pe-de-atleta.html. Figura 28 - Trichophyton tonsurans. Fonte: http://www.provlab.ab.ca/ mycol/tutorials/derm/ttons.htm Figura 29 – Micose ungueal. Fonte: http://www.skinatlas.com/ onychomycosis/english/tonsurans2.htm. Micologia Clínica 16 O Microsporum canis possui crescimento rápido. As colônias são brancas e lustrosas e, com o tempo, desenvolvem um pigmento amarelo-limão na região periférica, com reverso amarelo acastanhado. O Microsporum gypseum possui crescimento rápido com colônias achatadas brancas, com o tempo tornando-se castanho-claras a vermelho-acastanhadas.A superfície torna-se granular à medida que são produzidos os conídios. Os Epidermophyton apresentam colônias de crescimento lento, aveludadas, com sulcos radiados de cor amarelo- -esverdeado. Suas hifas possuem macroconídios clavados, multisseptados em microcachos ou isolados. Figura 30 – Exame direto Microsporum. Fonte: http://labmed.ucsf. edu/education/residency/fung_morph/fungal_site/dermatpage.html Figura 31- Lesão causada por Microsporum. Fonte: http://www.saber. ula.ve/micosis/contenido/capitulo2/figuras/2-0015-de.html. Figura 32 – Epidermophyton. Fonte: http://www.mold.ph/epidermophyton.htm. No caso do Epidermophyton floccosum, as colônias crescem rapidamente, em 3-5 dias, e inicialmente apresentam coloração cinza-esbranquiçada, desenvolvendo um pigmento cáqui-esverdeado característico quando maduros. Fitas amarelo-esbranquiçadas podem ser observadas irradiando do centro da colônia para a periferia. A superfície torna-se granular, com amadurecimento adicional à medida que os conídios são produzidos. Microconídios nunca são produ- zidos, portanto, se estes forem observados, a hipótese de se tratar de amostra de E. floccosum pode ser descartada. Causa dermatofitose epidêmica (pé de atleta) e dermatofitose inguinal. Os Arthroderma são a fase sexuada do Trichophyton e do Microsporum. Segue quadro com as principais ocorrências de dermatofitoses: Micologia Clínica 17 Agente Pele Unhas Pelo invasão ectotrix Pelo invasão endotrix Microsporum + + (raro) + - Epidermophyton + - - - Trichophyton mentagrophytes + + + - Trichophyton rubrum + + + (raro) - Trichophyton tonsurans + + - + O tratamento para dermatofitose baseia-se nos tópi- cos imidazólicos e miconazol, ou medicação oral itracona- zol, griseofulvina e terbinafina. As dermatomicoses ocasionadas por Candida possuem como representante a Candida albicans, que infecta teci- dos, unha e mucosas. É caracterizada por lesões úmidas, esbranquiçadas ou avermelhadas, de bordas descamati- vas. O tratamento de dermatomicoses por Candidas con- siste no uso tópico de iodo, violeta de genciana, nistatina e imidazólico. Figura 34 – Micose oral por Candida. Fonte: http://www.scielo.org.ve/ scielo.php?pid=s0001-63652000000300015&script=sci_arttext. Micoses Subcutâneas São micoses que comprometem a camada subcutânea da pele na ocorrência de infecção por traumatismo com material infectado. As micoses subcutâneas são classificas conforme o patógeno e a etiologia da infecção. São espo- rotricose, cromoblastomicose, feo-hifomicose, micetoma, rinosporidiose, lobomicose e zigomicose subcutânea. Vamos conhecer um pouco de cada uma dessas pato- logias. Esporotricose Causa infecção linfocutânea que compromete pele, tecido e gânglios linfáticos regionais, caracterizada por lesões ulceradas e nódulos exsudativos. A contaminação dá-se por traumatismo com materiais contaminados por Sporothrix schenckii ou por inalação de propágulos do fungo, em caso de imunodeprimidos. Figura 35 – Candida em coloração de Gram. Fonte: http://www.asm.org/ division/c/fungi.htm. Micologia Clínica 18 O Sporothrix schenckii é um fungo dimórfico, possui uma colônia branca acinzentada que escurece com o tem- po da periferia para o centro e apresenta células levedu- riformes e/ou hifas septadas com a formação de conídios isolados ou agrupados em pétalas. O tratamento consiste em iodeto de potássio por via oral ou intravenosa. Anfotericina B, itraconazol e ceto- conazol também podem ser utilizados, com acompanha- mento do resultado. Cromoblastomicose Também conhecida como dermatite verrucosa cro- moparasitária, é uma infecção de pele e tecidos princi- palmente dos membros inferiores, podendo invadir a re- gião linfática, caracterizada pelo surgimento de nódulos cutâneos de desenvolvimento lento que podem ou não ulcerar. Essa patologia é ocasionada pelos fungos pertencen- tes à família Dematiaceae (Fonsecaea, Phialophora, Cla- dosporium e Rhinocladiella). A contaminação dá-se por trauma com materiais contaminados. Os fungos representados por essa família apresentam colônias de aspecto aveludado, variando de cor verde a marrom e preto. Possuem hifas e corpos escleróticos es- curos. A identificação da espécie é possível por meio da morfologia do corpo de frutificação ou conidiação. Figura 36 – Esporotricose. Fonte: http://smsdccfisabeldossantos. blogspot.com.br/2013/01/voce-sabe-o-que-e-esporotricose.html. Figura 37 - Sporothrix schenckii. Fonte: http://lib.jiangnan.edu.cn/ asm/326-introduce.htm. Figura 38 – Família Dematiaceae. Fonte: http://www.micologiaemfoco.com/2012/08/a-cromoblastomicose-constitui-uma.html. O tratamento envolve desde antifúngicos como 5-fluorocitosina, tiabendazol, anfotericina B a eletrocoagulação, crioterapia e cirurgias. A associação de diversas técnicas reflete-se em um efeito mais favorável. Micologia Clínica 19 Feo-hifomicose São micoses subcutâneas caracterizadas pela presença de micélios septados escuros. São causadas por diversos agentes; entre os principais, destacam-se os representan- tes dos gêneros Phialophora, Cladosporium e Exophiala. A contaminação dá-se por traumatismo e, em geral, possui baixa patogenicidade. O diagnóstico é realizado pelo achado de hifas escuras septadas em exame direto, porém a técnica para identifi- cação mais indicada é o estudo histológico. O tratamento consiste no uso de anfotericina B, 5-fluo- rocitosina, itraconazol e, quando necessário, procedimen- to cirúrgico. Rinosporidiose É uma infecção do tecido mucocutâneo, como micose nasal, ocular e genital. É caracterizada por pólipos friáveis, sésseis ou pedunculados de coloração avermelhada, po- dendo desenvolver sangramento. É causada pelo Rhinosporidium seeberi. Não se conhe- ce o mecanismo de contaminação ao homem, visto que essa patologia é considerada como uma infecção de pei- xes. Fungo caracterizado por células redondas contendo grandes números de esporos-esporângios. O tratamento baseia-se em remoção cirúrgica e uso de quimioterápicos com acompanhamento. Eumicetonas São infecções causadas por fungos com formação de grãos, compostos por emaranhados de hifas, denomina- dos micetomas. Infectam os tecidos de pés, pernas e bra- ços por traumatismo. Os agentes mais frequentes nessa infecção são Ma- durella grisea, Madurella mycetomatis (grãos negros) e Pseudoallescheria boydii (grãos brancos). Figura 39 – Cladosporium. Fonte: http://www.anaisdedermatologia.org. br/public/figuras.aspx?figura=4&id=100221. Figura 40 – Lesão de rinosporidiose. Fonte: http://www.stanford.edu/ class/humbio103/ParaSites2002/rhinosporidiosis/ Figura 41 – Rhinosporidium seeberi. Fonte: http://www.allposters. com/-sp/Cross-Section-of-Human-Nasal-Tissue-Showing-Sporangia-with- Spores-of-Rhinosporidium-Seeberi-Posters_i9012050_.htm. Micologia Clínica 20 O tratamento consiste em drenagem cirúrgica e uso de quimioterápicos com acompanhamento. Alguns casos com infecção avançada necessitam da amputação do membro atingido. Lobomicose Infecção subcutânea caracterizada por aspectos der- matológicos variados, porém com predominância de le- sões queloidiformes gomosas, ulceradas, verruciformes e/ou infiltrativas. A infecção ocorre por traumatismo da pele com material infectado por Paracoccidioides loboi, geralmente na região da orelha em indivíduos que carre- gam cargas sobre os ombros. Também conhecida como doença de Jorge Lobo ou blastomicose queloidiana, seu diagnóstico caracteriza-se por achado de células redondas que se unem por pontes tubulares, formando um rosário. O tratamento consiste em remoção cirúrgica e uso de antifúngicos convencionais. Figura 42 - Madurella mycetomatis. Fonte: http://www.mycology.adelaide.edu.au/Fungal_Descriptions/Hyphomycetes_ (hyaline)/Madurella/mycetomatis.html. Figura 43 - Paracoccidioides loboi. Fonte: http://www.doctorfungus.org/ Thefungi/img/par1_l.jpg. Micoses Sistêmicas São micoses profundas com comprometimento de ór- gãos e vísceras. A infecção geralmente é provenienteda inalação de propágulos. Quando é crônica, pode desen- cadear uma resposta celular granulomatosa semelhante à tuberculose. Possui maior ocorrência na América. São fungos di- mórficos, e as principais infecções conhecidas são: para- coccidioidomicose, coccidioidomicose, blastomicose, his- toplasmose e criptococose. Paracoccidioido Essa infecção é causada pela inalação de fragmentos do Paracoccidioides brasiliensis, geralmente infectando o pulmão, onde lesa o tecido formando abcessos ou in- flamações granulomatosas com centros necróticos. No tecido infectado, podemos observar células redondas le- veduriformes com brotamento, que podem formar uma estrutura semelhante a “roda de leme”. A infecção pode ter longos períodos de incubação as- sintomáticos. O diagnóstico consiste em estudo histopatológico e exame direto de secreção e escarro. Quando cultivado, Micologia Clínica 21 esse fungo apresenta crescimento de colônias brancas lisas com o desenvolvimento de micélios aéreos curtos. Conforme a variação da temperatura, pode-se observar hifas septadas, conídios e clamidioconídios. O tratamento consiste em associações terapêuticas de sulfamidas, trimetoprima, anfotericina B, miconazol e itraconazol. Coccidioidomicose Essa infecção é causada pela inalação de artroconídios do Coccidioides immitis, geralmente infectando o pul- mão, onde lesa o tecido gerando uma infecção de aguda à crônica. No tecido infectado, podemos observar células redondas contendo numerosos endósporos globosos de tamanho irregular. A infecção pode ter longos períodos de incubação de forma assintomática. O diagnóstico consiste em estudo histopatológico e as- pectos clínicos e epidemiológicos. Quando cultivado a 37 °C, esse fungo apresenta crescimento de colônia branca, algodonosa, rica em artroconídios, nos quais podemos observar as hifas. O tratamento consiste no uso de anfotericina B. Blastomicose Essa infecção é causada pela inalação de propágulos do Blastomyces dermatidis, que é disseminado hemato- genicamente. Geralmente infecta pulmão, pele e ossos, onde lesa o tecido iniciando uma infecção granulomatosa com a formação de microabscesso, no qual podemos ob- servar células leveduriformes com unibrotamento. A infecção possui sin- tomas semelhantes aos de tuberculose, gripe severa, carcinoma, oste- omielite, periostite e ar- trite. O diagnóstico consiste em exame direto do material clínico. Quando cultivado em temperatura ambiente, esse fungo apresenta crescimento de colônia branca filamen- tosa. O tratamento consiste no uso de anfotericina B e itra- conazol. Histoplasmose Essa infecção é causada pela inalação de fragmentos de Histoplasma capsulatum. Desenvolve-se uma infecção primária pulmonar que pode afetar outros órgãos por meio das células do sistema reticuloendotelial. Podemos Figura 44 - Paracoccidioides brasiliensis. Fonte: http://botit.botany.wisc. edu/toms_fungi/jan2005.html. Figura 45 – Infecção de tecido por Coccidioides immitis. Fonte: http:// precisionpath.us/education/case/09-06-05/June_09_Coccidioides.aspx. Figura 46 - Blastomyces dermatidis. Fonte: http://pathmicro.med.sc.edu/ mycology/mycology-6.htm. Micologia Clínica 22 observar no interior dos macrófagos células levedurifor- me pequenas. A infecção pode ser assintomática ou com discretos sintomas semelhantes aos de uma gripe. Também pode formar nódulos calcificados no pulmão. O diagnóstico consiste em exame microscópico corado por Giemsa e observação de células leveduriformes com a presença de um halo claro em volta. A melhor técnica para identificação é a realização da cultura a 22 °C, na qual se observa o crescimento de uma colônia branca algodo- nosa com micélios aéreos e se visualizam hifas septadas com microconídios lisos e macroconídios equinulados. Quando cultivadas a 36 °C, as colônias são claras e cremo- sas com leveduras em brotamento. O diagnóstico é feito por meio de exame direto do ma- terial biológico (LCR, escarro, secreção) com a adição de tinta da China ou nanquim. Visualizam-se células leveduri- formes encapsuladas de tamanho irregular, algumas com brotamento. Quando cultivado, o fungo apresenta crescimento rá- pido de colônias cremosas, brilhantes e mucoides de cor clara branca a marrom. O tratamento da histoplasmose disseminada é basea- do no emprego de anfotericina B. Criptococose A criptococose é causada pela inalação do fungo Cryp- tococcus neoformans, encontrado nas fezes de pombos. Pode desenvolver-se uma infecção subaguda ou crônica, em que podemos observar células leveduriformes capsu- ladas. A infecção inicial é no pulmão, podendo desenvolver- -se para sistêmica principalmente em indivíduos imuno- deprimidos. Sua característica encapsulada confere grande poder de virulência e grande resistência a ambientes inóspitos. Esse fungos divide-se em quatro sorogrupos, A, B, C e D, sendo A e D os mais frequentes. Figura 47 – Histoplasmose. Fonte: http://www.gefor.4t.com/hongos/ histoplasmacapsulatum.html. Figura 48 - Cryptococcus neoformans. Fonte: http://thunderhouse4-yuri. blogspot.com.br/2010/09/cryptococcus-neoformans.html. O tratamento consiste na associação de anfotericina B com 5-fluorcitosina. Micoses Oportunistas e Outras Micoses oportunistas são infecções por fungos de bai- xa virulência. Alguns deles são pertencentes à microbiota, outros estão presente no meio ambiente. A infecção por esses fungos só ocorre quando o organismo sofre previa- mente de condições favoráveis de supressão do sistema Micologia Clínica 23 imunológico. Sendo assim, podemos listar alguns fatores de risco que podem proporcionar tais condições: • Neoplasia. • Diabetes. • Hemopatias. • AIDS – síndrome de imunodeficiência adquirida. • Gravidez. • Prematuridade. • Velhice. • Antibioticoterapia. • Corticoidoterapia. • Antiblásticos. • Transplantes. • Infecção hospitalar. Um fungo não virulento pode ser considerado o pa- tógeno em uma infecção quando isolado em amostras clínicas recorrentes, nas quais não há outro agente pato- gênico. Diversos fungos podem compor as micoses oportunis- tas, destacando-se Aspergillus spp., Candida spp., Mucor spp., Rhizopus spp. e Cryptococcus neoformans. Este últi- mo, vimos em micose sistêmica devido a suas característi- cas de virulências invasiva. Candidíase A candidíase é causada por fungos representantes do gênero Candida spp. A C. albicans é o patógeno mais co- mum nas infecções de mucosas e tecidos, seguida de C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. guillier- mondii, C. lusitanae e C. kefyr. Essa infecção pode acometer diversos órgãos e teci- dos, desenvolvendo micoses específicas conforme a re- gião, como: estomatite (mucosa oral e gastroestomacal), balanite (glande), candidíase vaginal (órgãos genitais), candidíase cutaneomucosa (pele e mucosas) e candidíase sistêmica (órgãos e sangue). O diagnóstico consiste no achado de células leveduri- formes em exame direto ou colorações diversas. Quando cultivada, podemos observar colônias claras e cremosas. O tratamento é bem amplo e depende do estágio e da região da infecção. Observamos o emprego de anfoterici- na B, pimaricina e imidazólico. Violeta de genciana e ácido bórico também podem ser empregados em uso tópico. Mucormicose As mucormicoses são infecções graves em seios para- nasais, cérebro, pulmões, aparelho digestivo etc., tendo como principal patógeno o Rhizopus spp. Essa micose caracteriza-se pela invasão dos vasos san- guíneos por hifas, que também podem atingir cartilagens e nervos. O diagnóstico baseia-se no achado de hifas em tecidos, visualizadas em exames diretos ou colorações por hema- toxilina. Quando cultivado, os rizoides e esporangióforos podem ser visualizados e utilizados na classificação das espécies. Figura 49 – Células fúngicas de Candida. Fonte: http://www. cafebiomedico.com/cgi-sys/suspendedpage.cgi. Micologia Clínica 24 O tratamento consiste no emprego precoce de anfo- tericina B.Entomoftoromicose A entomoftoromicose é uma zigomicose subcutânea causada por fungos da ordem Entomophthorales spp. Essa infecção origina-se da picada de inseto ou da ina- lação de propágulos, comprometendo a mucosa nasal e podendo evoluir até a faringe, o que se denomina rinoen- tomoftoromicose. O diagnóstico baseia-se no achado direto de fungos em material de biópsia. Aspergilose A aspergilose é uma micose visceral, geralmente uma infecção secundária causada pela inalação de propágulos de Aspergillus spp., que acomete pulmão, ouvido, sistema nervoso central, olhos e outros órgãos. A evolução dessa infecção pode causar o aspergiloma intracavitário, tam- bém conhecido como bola fúngica. A aspergilose alérgica também pode ser desenvolvida, devido a sua característi- ca morfológica e tóxica. O diagnóstico consiste no achado de hifas septadas, ramificadas, dicotômicas, irradiando de um ponto. Quan- do cultivado, podemos observar o corpo de frutificação, característica da espécie. Figura 50 – Rhizopus. Fonte: http://thunderhouse4-yuri.blogspot.com.br/2010/06/rhizopus-species. html. Figura 51 – Entomoftoromicose, Fonte: http://www.mold.ph/basidiobolus.htm. O tratamento baseia-se no emprego de anfotericina B. Figura 52 – Aspergillus. Fonte: http://micol.fcien.edu.uy/atlas/Deuteromycetes.htm. Micologia Clínica 25 O tratamento baseia-se na forma clínica e na região da infecção, porém o uso de anfotericina B destaca-se no caso de aspergiloma pulmonar. Outras micoses oportunistas podem surgir em pacientes com alguma supressão da resposta humoral ou celular, como micoses oculares, otomicoses, sepses fúngicas, infecções hospitalares. Diversos fungos menos virulentos podem ser os agentes infecciosos, portanto, o exame direto, o cultivo e o aspecto clínico são fundamentais para um diagnós- tico assertivo. Antifúngicos Para um tratamento efetivo de micose, os seguintes aspectos devem ser avaliados: • Tipo de micose. • Agente etiológico. • Estado do paciente. • Mecanismos de ação dos antifúngicos. • Espectro de ação dos antifúngicos. • Efeitos colaterais do tratamento. Principais Antifúngicos Utilizados no Tratamento das Micoses Micoses Antifúngios Pitiriase versicolor Hipossulfito de sódio, sulfeto de selênio, cotoconazol, tolciclato, tonaftato e itraconazol Piedras Solução de bicloreto de mercúrio, mercúrio amoniacal e álcool sublimado Tinha negra Solução de enxofre, ácido salicílico e tintura de iodo Dermatofitoses Griseofulvina, tolciclato, tolnaftato, clotrimazol, miconazol, cetoconazol, tiabendazol, itraconazol e terbinafina Esporotricose Iodeto de potássio, Anfotericina B e itraconazol* Cromoblastomicose Anfotericina B, 5-fluorocitosina, cetoconazol e itraconazol* Maduromicose Sulfonamidas* e Anfotericina B Rinosporidiose Anfotericina B Paracoccidioidomicose Sulfametoxazol-trimetoprima, Anfotericina B, cetoconazol, miconazol e itraconazol* Histoplasmose Sulfamidas, Anfotericina B e cetoconazol Criptococose Anfotericina B, 5-fluorocitosina, fiuconazol Candidíase Nistatina, violeta de genciana, miconazol, cetoconazol, Anfotericina B, 5-fluorocitosina, fiucona- zol e itraconazol Zigomicose Anfotericina B Doença de Jorge Lobo Ausência de antifúngicos eficazes Ceratomicose Natamicina, Anfotericina B, nistatina e primaricina Otomicose Sulfanilamida e acetato de metacresil Aspergilose Anfotericina B e itraconazol Micologia Clínica 26 Os antifúngicos podem ser divididos em dois grupos, conforme sua atuação: drogas que atuam sobre a mem- brana celular e drogas que atuam intracelularmente. A seguir, algumas drogas que atuam na membrana: • Derivados de poliênicos: rompem a membrana celular, ocasionando desequilíbrio hídrico e perda de componentes essenciais a célula. São eles anfo- tericina B, nistatina e pimaricina. • Derivados de imidazólicos: inibem a síntese de esteroides da membrana fúngica. São clotrimazol, miconazol, cetoconazol, itraconazol e fluconazol. • Outros derivados, como saperconazol, tercona- zol, tiaconazol, butoconazol, também estão sendo empregados como antifúngicos que atuam sobre a membrana celular. Drogas que atuam intracelularmente: • São os antimicóticos de maior eficácia e também de maior toxicidade ao homem. Agem nos micro- túbulos e na síntese de ácido nucleico. São eles: griseofulvina (dermatófitos), imidazólico, 5-fluo- rocitosina, tolnaftato, tolciclato, hipossulfato de sódio, sulfeto de selênio, etruscomicina, violeta de genciana, permanganato de potássio, H2O2, ácidos orgânicos (acido caprílico, propiônico e undecilêni- co), ácido benzoico, salicílico e paraidroxibenzoico, iodetos e sulfamídicos. O emprego desses antifúngicos pode ser tópico ou oral, conforme quadro abaixo: Classificação dos Antifúngicos 1. Sistêmicos 2. Tópicos Caspofungina Cetoconazol Flucitosina Ciclopirox Griseofulvina Haloprogina Itraconazol Miconazol Fluconazol Nistatina Cetoconazol Terbinafina Anfotericina B Tolnaftato Micologia Clínica 27 Técnicas Laboratoriais A forma mais usual de diagnóstico microbiológico de micoses é a análise do material clínico. Testes indiretos como reações intradérmicas e pesquisa de antígenos e anticorpos também podem ser empregados. As amostras biológicas para realização dos testes laboratoriais variam com o tipo de hipótese diagnóstica. Segue quadro resumido abaixo. Suspeita clínica de micoses Material biológico a ser estudado Superficiais e cutâneas Escamas de pele, pelos e unhas. Subcutâneas Secreção, biópsia, pus e sangue. Sistêmicas Escarro, fezes, urina, biópsia e líquidos cefalorra- quidiano. O procedimento diagnóstico de identificação de uma micose no laboratório inicia-se na coleta, seguido do exame direto, da cultura e, quando aplicável, do antifungigrama. Vamos conhecer um pouco dessas técnicas. Coleta A primeira etapa do diagnóstico laboratorial é a coleta, e, em micologia, não é diferente. A qualidade da amostra é de suma importância para não comprometer do resul- tado final. Alguns cuidados e técnicas devem ser seguidos para obtenção de uma amostra adequada para o exame direto e/ou a cultura. Pele: realizar assepsia do local. Amostras de lesões de pele descamativas ou crostas devem ser colhidas com uma lâmina de bisturi descartável ou com a borda da lâ- mina de vidro, raspando em vários pontos. Para as lesões cutâneas com vesículas (bolhas pequenas) e pústulas (bo- lhas pequenas inflamadas com pus), coletar o líquido e realizar uma lâmina em forma de esfregaço. Couro cabeludo: as amostras de lesões no couro ca- beludo devem ser obtidas pela raspagem do local. Devem conter folículos capilares e escamas de pele. Cabelos e pelos: coletar fios com presença e/ ou au- sência de nódulos. Unhas: coletar fragmentos de unhas raspando-as com o bisturi ou com o auxílio de uma tesoura limpa. O mate- rial embaixo da unha pode ser retirado com o bisturi, com um palito (tipo de manicure) previamente esterilizado ou com outro objeto pontiagudo estéril. Mucosas e secreções: coletar secreções com swab e realizar lâmina em forma de esfregaço. Fluidos orgânicos: coletar em recipiente estéril ade- quado, conforme quadro a seguir: Micologia Clínica 28 Exame Material Biológico Onde Colher Pesquisa de fungos (ou Exame Direto ou Exame Micológico Direto) Cultura para fungos Pele, couro cabeludo, unha Cabelo Secreções Escarro Líquido pleural Aspirado ou lavado brônquico Sangue Medula óssea • em placa de Petri estéril ou em envelo- pe de papel impermeável estéril; • em seringas, ou swab; • em pote ou frasco com boca larga es- téril; • em frasco estéril; • em frasco estéril; • em frasco próprio de hemocultura; • em frasco contendo 0,5ml de heparina diluída 1:1000 Pesquisa ou cultura para BLASTOMICOSE ou Paracoccidioides brasiliensis Raspado das lesões Escarro, Lavado ou aspirado brônquico • em placa de Petri estéril; • em pote descartável próprio • em frasco estéril Imunodifusão dupla (IDD) para BLASTO- MICOSE ou Paracoccidioides brasiliensis Sangue(soro) • em tubo seco - 5ml Imunodifusão dupla (IDD)Aspergilus fumigatus Sangue (soro) • em tudo seco - 5ml Pesquisa direta ou cultura para Candida albicans Qualquer material biológico • próprio para cada tipo Imunodifusão dupla para Candida albi- cans ou CANDIDÍASE Sangue (soro) • em tudo seco - 5ml Pesquisa de Criptococcus neoformans pelo método direto LCR (líquor) ou qualquer outro material biológico • em frasco estéril Pesquisa de Criptococcus neoformans, pelo método da tinta da china LCR (líquor) • em frasco estéril Cultura para Criptococcus neoformans, LCR (líquor) ou qualquer outro material biológico a critério médico • em frasco estéril Prova do Látex para Criptococcus neofor- mans LCR (líquor) Sangue (soro) • em frasco estéril • em tudo seco Identificação Exame direto É a técnica mais difundida na micologia. Essa metodologia, também conhecido como exame microscópico direto, consiste na clarificação do material biológico com uso de soluções como KOH (hidróxido de potássio) 10% a 20% ou DMSO (dimetilsulfóxido) sobre uma lâmina coberta com lamínula e visualização em microscópio em aumento de 40x e 100x. Permite a visualização do fungo e a classificação de acordo com sua morfologia e célula reprodutiva. Algumas variações podem ser utilizadas para melhor visualização. Parker – exame direto com clarificação utilizando KOH 20% e tinta azul permanente Parker na proporção 2:1. Micologia Clínica 29 Tinta da China – sobre uma lâmina, misturar uma gota de nanquim com o material biológico (escarro e LCR), co- brir com lamínula e realizar a visualização em microscópio com aumento de 40x. Permite a visualização da cápsula do Cryptococcus neoformans. Colorações Algumas colorações são mais específicas para identifi- cação de algumas espécies. Coloração Giemsa: também conhecida como panótico, consiste na coloração do material em lâmina com prepa- rado do corante Giemsa e visualização em microscópio por imersão. Permite a visualização do Histoplasma cap- sulatum. Coloração de Gram: coloração difundida na microbio- logia pela qual as leveduras se coram de roxo, Gram-po- sitivas. Imunofluorescência: com uso de soros hiperimunes específicos e marcadores com fluorocromos. Permite a visualização de Cryptococcus neoformans, Sporothrix sce- ckii, Coccidioides immitis e Candida albicans. Colorações como Gomori, Grocott, Pas e Meyer são de uso para estudo histológico de biópsia. Classificação Patologia Microorganismo Material Clínico Técnica Labora-torial Resultado Micose Superfícial Pitiríase Versicolor Malassezia furfur Raspado de Pele Exame direto com Parker células levedurifor- mes ovaladas ou filamentos septa- dosom azulado Tinea Negra Phaeoannelomyces werneckii Stenella araguata Raspado de Pele Exame direto hifas septadas de coloração escura, com septos irregu- lares Piedra Branca Trichosporon beigelli Pêlos genitais Exame direto micélio de hifas septadas, artroco- nídeos e blastoco- nídeos Piedra Negra Piedraia hortae Fios de cabelos Exame direito hifas escuras com ascos, constituídos por ascósporos fusiformes com filamento polar Micologia Clínica 30 Micose Cutâneas Dermatofitose Trichophyton rubrum, Tricho- phyton menta- grophytes, Tricho- phyton tonsurans e Trichophyton spp Microsporum ca- nis, Microsporum gypseum Raspado de Pele, Unha, pêlos Exame direto com Parker Macroconídios cla- viformes multisep- tados e microconí- dios redondos ou piriforme Dermatofitose Epidermophyton floccosum Raspado de Pele, Unha, pêlos C. albicans Coloração de Gram Exame direto Macroconídios cla- vados, multisepta- dos isolados ou em pequenos cachos Dermatofitose Candida spp. Raspado de Pele, Unha, pêlos Coloração de Gram ou Giemsa Células levedurifór- micas pequenas, esféricas com for- mato de charutos. Hifas septadas e conídios pirifor- mes isolados ou agrupados como pétalas Micoses Subcutâ- neas Esporotricose Sporothrix schen-ckii Pus e secreção Coloração de Gram e Giemsa Células levedurifór- micas pequenas, esféricas com for- mado de charutos. Hifas septadas e conídios piriformes isolados ou agru- pados com pétalas Cromoblastomi- cose Dematiaceae (Fon- secaea, Philophora, Cladosporium e Rhinocladiella Pus e descamação da região afetada Exame direto Corpos muriformes ou escleróticos de cor escuras Feo-Hifomicose Phialophora, Cladosporium e Exophiala Tecido Exame direito e histopatológico Hifas septadas de coloração escura Rinosporidiose Rhinosporidium seeberi Mucosa nasal, ocular e genital Histopatológico Células arredonda- das de parede es- pessa com grande número de esporos (esporângios) Eumicetomas Madurella grisea Madurella myceto- matis Pseudoallescheria boydii Tecido Histopatológico Micromorfologia dos grãos Lobomicose Paracaccidioides loboi Tecido eesudatos Histopatológico Células redondas que se unem por pontes tubulares formando um rosário Micologia Clínica 31 Micoses Sistêmicas Paracoccidioidomio Paracoccidioides brasiliensis Secreção e escarro Exame direto Histopatológico Células levedurifor- mes, caliciformes com três ou mais brotamentos liga- dos a célula mãe. Quando cultivada, pode-se observar hifas septadas, conídios e clamido- conídios. Coccidioidomicose Coccidioides im-mitis Secreção, escarro e tecido Histopatológico Células redondas contendo numero- sos edosporos de tamanhos irregu- lares Blastomicose Blastomyces der-matidis Secreção, escarro e tecido Exame direto Histopatológico Células redondas com unibrota- mento, quando cultivado formação de micélio Histoplasmose Histoplasma capsu-latum Secreção e tecido Coloração de Giemsa Células levedu- riformes com a presença de um halo claro envolta, quando cultivado hifas septadas com microconídeos lisos e macronídios equinilados. Criptococose Cryptococcus neo-formans LCR, escarro, secre- ção e tecido Tinta da China/ Nankin leveduriformes encapsuladas de tamanho irregu- lar, algumas com brotamento. Micoses oportu- nistas Candidíase Candida spp. Tecido, mucosa e sangue Exame direto Grocott PAS Células levedu- riformes e hifas septadas. Murcomicose Rhizópus spp. Tecido Exame direto Coloração Hemato- xilina Hifas retas, quando cultivado observa- ção de rizóides e esporangiósforo Entomoftomicose Entomophthorales Tecido Exame direto Histopatológico Hifas largas sepa- tadas com ramifi- cação Aspergilose Aspergillus spp. Tecido e secreção Exame direto Histopatológico Hifas retas septa- das, ramificadas e discotomicotica, quando cultivada observa-se corpo de frutificação Identificação de leveduras Há várias técnicas de identificação de leveduras. A mais antiga é o teste de tubo germinativo, que consiste na identi- ficação de C. albicans com o crescimento em hifas (tubos germinativos) quando inoculada em soro humano/de coelho e incubada a 37 °C por duas horas. Micologia Clínica 32 Técnicas baseadas no auxanograma (pesquisa do me- tabolismo dos açúcares) são muito utilizadas para identifi- cação das leveduras. Alguns kits comerciais e de automa- ção para fungos também adotam essas técnicas. Identificação dermatófito O microcultivo é a técnica mais efetiva utilizada em mi- cologia clínica para identificação de dermatófitos. Consis- te na cultura do fungo em pequenos pedaços de meio de cultura – ágar Sabouraud –, entre lâmina e lamínula, onde o crescimento se expande e se fixa na porção inferior da lamínula. Quando esta é retirada, apresenta as estruturas do corpo de frutificação, que auxiliam na identificação do fungo. O material deve ser analisado em microscopia 40x com emprego de uma gota de corante de azul de algodão para auxílio na visualização das estruturas fúngicas. O macrocultivo é a cultura de fungo propriamente dita, na qual são analisados critérios como: • Velocidade do crescimento. • Aspecto da colônia (cor, topografia, textura, pig- mento). • Microscopia (hifas, conídios, ascos etc.). • Termorresistência.• Dimorfismo. Recomenda-se ter uma micoteca e um atlas, para uso comparativo nas identificações. Outras técnicas também podem ser usadas, como es- pectrofotometria de massa, cromatografia com pesqui- sa de antígenos circulantes para candidíases sistêmicas, testes intradérmicos e pesquisa de anticorpos séricos por Elisa e Western-blot em micoses sistêmicas. Isolamento/semeadura A técnica mais utilizada para isolamento de um fungo é a cultura, porém as dificuldades ocasionadas pelo lento crescimento e pela contaminação por outros microrganis- mos inviabilizam esse procedimento para algumas amos- tras. O meio de cultura seletivo indicado para o isolamento de fungos é o ágar Sabouraud dextrose com cloranfenicol, devido a seu pH ácido (pH= 5,8), alta concentração de gli- cose e uso de antibiótico para inibição de contaminação por bactérias. O meio de ágar Mycosel é específico para dermatófi- tos. Em uma cultura de fungos, devem ser utilizados sem- pre os dois meios (Sabouraud e Mycosel), sendo que o primeiro a ser semeado deve ser o Sabouraud. Realizar a semeadura do fungo ou material biológico utilizando cotonete, alça estéril e/ou alça L. Fazer uma pequena perfuração no início da inclinação para melhor isolamento. Os repiques para fungos de crescimento len- to devem ser feito em tubos, pois em placa há o resseca- mento do ágar. A incubação deve ocorrer de 19 °C a 25 °C. Para suspeita de Malassezia, acrescentar uma gota de azeite para melhor isolamento. Antifungigrama Diversas técnicas de antifungigrama podem ser reali- zadas, como diluição em caldo, diluição em ágar, difusão em ágar com disco, E-test em meio sólido (MIC) e automa- ção. Porém algumas técnicas e antifúngicos não possuem padronização normativa. Portanto, é recomendado sem- pre utilizar os padrões e concentrações preconizados pelo CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute e pelo EUCAST - European Committee on Antimicrobial Suscep- tibility Testing. Segue quadro com os antifúngicos e as concentrações utilizados para teste de sensibilidade de Candida. Micologia Clínica 33 Correlação entre os testes de microdiluição em caldo e difusão em disco para as espécies de Candida Espécies (n) Antifúngicos Microdiluição Disco difusão (%) Correlação (%) S SDD R S SDD R C. albicans (38) Anfotericina B 100 0 0 97,4 0 2,6 97,4 Itraconazol 97,4 2,6 0 89,5 10,5 0 86,8 Fluconazol 100 0 0 100 0 0 100 Voriconazol 100 0 0 100 0 0 100 Anidulafungina 100 0 0 - - - - C. tropicalis (23) Anfotericina B 100 0 0 100 0 0 100 Itraconazol 100 0 0 47,8 52,2 0 43,5 Fluconazol 95,7 0 4,3 95,7 0 4,3 100 Voriconazol 95,7 0 4,3 95,7 0 4,3 100 Anidulafungina 100 0 0 - - - - C. glabrata (16) Anfotericina B 100 0 0 100 0 0 100 Itraconazol 25 31,2 43,8 6,2 25 68,8 31,3 Fluconazol 75 18,8 6,2 37,5 12,5 50 37,5 Voriconazol 93,8 6,2 0 56,3 6,2 37,5 56,3 Anidulafungina 100 0 0 - - - - C. parapsilosis (10) Anfotericina B 100 0 0 100 0 0 100 Itraconazol 100 0 0 70 30 0 70 Fluconazol 100 0 0 100 0 0 100 Voriconazol 100 0 0 100 0 0 100 Anidulafungina 100 0 0 - - - - C. krusei (4) Anfotericina B 100 0 0 100 0 0 100 Itraconazol 50 50 0 0 75 25 0 Fluconazol 0 100 0 0 0 100 0 Voriconazol 100 0 0 50 50 0 50 Anidulafungina 100 0 0 - - - - Assim como na microbiologia, são conhecidas resistências de fungos a agentes antimicóticos, como C. lusitaniae, C. krusei e C. glabrata para anfotericina B. Micologia Clínica 34 Referências LACAZ, C. S. et al. Tratado de micologia médica. 9ª ed. São Paulo: Sarvier, 2002. LEVEDURAS. Disponível em: http://www.enq.ufsc.br/ labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_grad2004/ microorganismos/leveduras.htm, acesso em: 13.abr.2013. MICOSES cutâneas. Disponível em: http://www.icb.ufmg. br/mic/index.php?secao=material&material=27, acesso em: 27.abr.13. MINAMI, P.S. Micologia: métodos laboratoriais de diag- nóstico das micoses. 1ª ed. São Paulo: Manole, 2003. MURRAY, P. R. et al. (eds.). Manual of clinical microbiolo- gy. 9th ed. Washington: ASM, 2007. RAVEN, P. H. et al. Biologia vegetal. 6ª ed. Rio Janeiro: Guanabara Koogan, 2001. RODRIGUES, Acácio Gonçalves. Introdução à micologia. Disponível em: http://users.med.up.pt/cc04-10/ Microdesgravadas/22_Intro_Micologia.pdf, acesso: em 13.abr.13. SEÇÃO de micologia. Disponível em: http://lacen.saude. sc.gov.br/arquivos/doc/micologia.pdf, acesso em: 19.mai.13. TRABULSI, L. R. et.al. Microbiologia. 3ª ed. 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