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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA MBI 150 – Microbiologia do Solo Os microrganismos do solo - importância e distribuição - Total de espécies no mundo Grupo Espécies descritas Espécies estimadas Animais -peixes -pássaros -mamíferos -répteis -insetos Nematóides 19.000 9.000 4.000 9.000 800.000 15.000 21.000 9.100 4.000 9.500 2.000.000 a 80.000.000 500.000 Plantas -dicotiledôneas -monocotiledôneas -fetos -musgos e hepáticas 170.000 50.000 10.000 17.000 250.000 a 300.000 Fungos Algas Protozoários Bactérias Vírus 69.000 40.000 30.000 4.000 5.000 1.500.000 60.000 100.000 30.000 130.000 Diversidade Microbiana do Solo Características Gerais dos Microrganismos do Solo 1. Capacidade metabólica diversa, codificada pelo genoma e não necessariamente expressa fenotipicamente; 2. Reprodução; 3. Estrutura celular definida; 4. Formam estrutura de repouso ou dormência; 5. Catalisam reações no solo; 6. Constituem elo entre os processo do solo e e os demais processos que ocorrem no ambiente 2 Populações microbianas do solo • Autóctones ou indígenas • Alóctones ou invasoras • Estrategistas k (estáveis, permanentes na comunidade) • Estrategistas r (flutuações na população) • Oligotróficos • Copiotróficos Vírus Polio, adeno Herpes TMV Influenza Parainfluenza “Rabies” Poxivírus Fago-T 3 Presença de bacteriófagos infectantes de Sinorhizobium meliloti (rizóbio de alfafa Solo pH Idade do “stand” Bacteriófago Florestal 4,9 NS - Florestal 5,0 NS - Pastagem 5,3 NS - Alfafa 5,3 6 + Alfafa 5,9 3 + Alfafa 6,1 8 + Trigo 6,1 NS + Pastagem 6,2 NS - Alfafa 7,4 1 + Tipos de metabolismo dos organismos do solo Fontes de elétrons Fonte de Carbono Fonte de energia Inorgânica CO2 Luz Química Fotolitoautotróficos (bactérias púrpuras do S) Quimiolitoautotróficos (bactérias nitrificadoras) Orgânica Substâncias Orgânicas Fotorganoheterotróficos (bactérias que não metabolizam o S) Quimiorganoheterotróficos ou Heterotróficos (decompositores: fungos, bactérias, animais) Água CO2 Fotolitoautotróficos (plantas superiores, algas verdes, cianobactérias) Comparação estrutural das células eucarióticas e eucarióticas Organela Procariotos Eucariotos Bactérias & Archaeas Fungos Algas Protozoários Membrana citoplasmática + + + + Divisão celular + + + + Membrana nuclear - + + + Ribossomos 70S + + + Retículo endoplasmático - + + + Complexo de Golgi - + + + Mitocôndria - + + + Citoesqueletos - + + + Cloroplastos - + + + Vacúolos - + + + Comparação estrutural das células procarióticas e eucarióticas Organela Procariotos Eucariotos Bactéria & Archaea Fungos Algas Protozoários Membrana citoplasmática Divisão nuclear Membrana nuclear Ribossomos Retículo endoplasmático Complexos de Golgi Mitocôndria Citoesqueletos Cloroplastos Vacúolos Parede celular + + - 70S - - - - - - + + + + 80S + + + + - + + + + + 80S + + + + + + + + + + 80S + + + + - + + 4 Bactérias Bactérias & Archaeas) (Nitrosomonas, Rhizobium, Bacillus, Pseudomonas, etc) Cianobactérias Actinomicetos Exemplos de bactérias mais comuns no solo: - Pseudomonas - Bacillus – B. thuringiensis – B. antracis - Clostridium – C. Tetani – C. botulinum – C. butyricum – C. pateuranum - Fixadores de N2 – Rhizobium, Bradyrhizobium, Azotobaxter, Azospirillum, Beijerinkia - Formadores de galha - Agrobacterium - Fermentadores – Lactobacillus Exemplos de bactérias quimioautotróficas I. Compostos de nitrogênio • Nitrosomonas • NH4+ +1 1/2 O2 NO2- + 2H+ + H2O • Nitrobacter • NO2- + 1/2 O2 NO3- II.Compostos inorgânicos de enxofre convertido para sulfato • Thiobacillus, alguns estritos • S0 + 1 ½ O2 H2SO4 III. Ion ferroso convertido para férrico • Thiobacillus ferrooxidans • Fe++ + O2 + 4H+ 4Fe+++ + 2H2O IV.Oxidantes de hidrogênio - vários gêneros • Nutrição autotrófica facultativa: • 2H2 + O2 2H2O Actinomicetos 5 Actinomicetos Actinomicetos • São competidores fracos • Decomposição de certos componentes resistentes à degradação • Formação de húmus • Transformações que ocorrem a altas temperaturas (esterqueiras e compostagens) Thermoactinomyces • Doenças em plantas Streptomyces scabies e S. spomoede • Infecções em animais e homens Nocardia asteroides, N. otitidiscaviam • Produção de antibiótico Principais características dos gêneros de actinomicetos mais encontrados nos solos Gênero Características Micromonospora Filamentos não crescem sobre o meio; produção de esporos simples dentro ou no meio; crescimento lento das colônias Nocardia Filamentos instáveis; fragmentação em unidades semelhantes às bactérias; geralmente os fragmentos não crescem sobre os meios e raramente produzem esporos Streptomyces Esporos em cadeias longas sobre filamentos crescendo sobre os meios; espécies muito numerosos nos solos e produtores de muitos antibióticos Streptosporangium Esporos produzidos em esporângios ou em cadeias sobre filamentos sobre o meio; colônia semelhante a de Streptomyces Thermoactinomyces Esporos simples formado nos filamentos sobre ou dentro dos meios; esporos resistentes a altas temperaturas; todas as espécies são termófilas Cianobactérias 6 Cianobactérias Fungos PAREDE CELULAR presente ausente Mixomycota/ Plasmodiophoromycota Composição da parede celular Celulose QuitinaΒ-Glucana Oomycota Reino fungi Eumycota Reino ProtozoaReino Chromista Classificação Reprodução sexuada Ausente Presente Anamorfo Ascomycota Basidiomycota Endógenos Exógenos Teleomorfo Esporossexuais Ascomycota e alguns basidiomycota que se reproduzem assexuadamente Eumycota Hifa Cenocítica Apocítica Esporo assexuado móvel Zygomycota Glomeromycota Biotrófico FMAs Arbúsculos Esporo assexuado imóvel Chytridiomycota Esporos sexuais Ausente Presente 7 Fungos Fungos Micélio Filo Esporo assexual Esporo sexual Cenocítico Chytridiomycota Ex. Allomyces Zoósporos (endógenos e móveis) Variável (ex. oósporos) Ausentes na maioria Zygomycota Ex.: Rhizopus sp. Aplanósporos (endógenos e imóveis) Zigósporos Apocítico Ascomycota (Ex: Neurosopora sp. Conídios (exógenos) Ascósporos (endógenos em ascos) Basidiomycota Ex: Agaricus bisporus) Conídios (exógenos) Basidiósporos (exógenos em basídios) Leveduras • Exemplos: Candida; Pichia, Torulopsis, Saccharomyces, Zygosaccharomyces • Contagem: 200 a 100.000 comum 103/g de solo Persistência de estruturas fúngicas viáveis no solo Estrutura Fungo Persistência (anos) Clamidósporos Tilletia >5 Oósporo Aphanomyces >10 Escleródio Phymatotrichum >12 Microescleródio Verticillium até 14 8 Algas • Fotoautotróficos • Eucariotos • Unicelulares ou filamentosas • Mais abundantes em regiões mais úmidas • Nos solos: na superfície 5-10 cm • Tolerância ao sal (0 a 100%) • Colonizadores primários • 100 a 50.000/g de solo mais freqüente: <10.000 Líquens Associação fungo:alga ou fungo:cianobactéria •Colonizadores primários •Membros fúngicos: Ascomycota (principal) ±15.000 espécies Basidiomycota e Deuteromycota ± 3.000 espécies • A associação permite a sobrevivência dos simbiontes em ambientes inóspitos, onde cada um, individualmente, não sobreviveria Protozoários - Três grupos: 1. Mastigophora: um ou mais flagelos 2. Sarcodina: rizópodos ou amebas 3. Ciliata: cílios curtos ao redor das células - Efeito sobre a estrutura e funcionamento da comunidade microbiana - Auxiliam na decomposição de resíduos orgânicos Artrópodes 9 Nematóides Vida livre x parasitas Interação espacial entre os componentes bióticos e abióticos do solo Diâmetro de poro de 1,0 mm permite a entrada de todos os microrganismose da maioria dos invertebrados do solo (mesofauna), exceto minhocas e artrópodes maiores Diâmetro de 0,005 mm permite somente a entrada de microrganismos. Dias Diâmetro do mesh (mm) 0,005 1,00 % do material decomposto 7 2 4 14 4 8 28 8 14 56 20 28 112 30 60 224 35 85 Interação entre a microbiota e a fauna do solo Profundidade Controle Lumbricus rubellus Lumbricus terrestris Apporectodea trapezoides P. fluorescens (células/g de solo) (x1000) 0-5 5248 5888 3236 6760 5-10 35 616 813 724 10-15 0 19 93 178 15-20 0 0,2 64 96 20-25 0 0 5 63 25-30 0 0 5 10 30-35 0 0 0,9 1,6 35-40 0 0 0,9 1,4 Adaptado de Daane et al., 1996) Transporte de Pseudomonas fluorescens através do perfil do solo associado à atividade de minhocas 10 Tamanho, número e biomassa dos grupos de microrganismos encontrados no solo Grupo Exemplo Tamanho (m) Número (nº. g-1) Biomassa (Kg massa fresca ha-1 ) Vírus Bactérias Actinomicetos Fungos Algas Protozoários Nematóides Minhocas TMV Pseudomonas Streptomyces Mucor Chlorella Euglena Pratylenchus Lumbricus 0,02 x 0,3 0,5 x 1,5 0,5 x 2,0 8,0* 5 x 13 15x 50 1.000** 100.000** 1010 - 1011 108 – 109 107 – 108 105 – 106 103 – 106 103 – 105 101 – 102 300 – 3.000 300 – 3.000 500 – 5.000 10 – 1.500 5 –200 1 – 100 10 – 1.000 *diâmetro; ** comprimento Total: 1.200 – 14.000 Kg ha-1 Principais funções dos microrganismos do solo • Decomposição da matéria orgânica do solo • Produção de húmus • Ciclagem de nutrientes • Reservatório de nutrientes • Fixação do N atmosférico • Agregação do solo • Decomposição de compostos xenobióticos • Controle biológico de pragas e doenças • Indicador de qualidade do solo • Diversidade metabólica/diversidade genética A biomassa microbiana do solo Importância: Kg ha-1, g g-1 •Ciclagem (decompositores) •Reservatório de nutrientes •Indicador da qualidade do solo •Diversidade metabólica/diversidade genética A biomassa microbiana pode ser analisada por meio de: • Contagem direta de células microbianas; • Análises de componentes celulares específicos tais como o trifosfato de adenosina (ATP), fosfolipídeos ou ácido murâmico; • Medição de processos microbianos específicos tais como a mineralização de nitrogênio ou a redução de dimetilsulfóxido a dimetilsulfeto; • Medição da taxa de respiração; • Análise direta de componentes celulares solubilizados pela fumigação com clorofórmio (método da fumigação-incubação, método da fumigação-extração) e pelo método da irradiação extração. 11 Diversidade Microbiana do Solo 1 – 10% da diversidade de espécies é conhecida. Diversidade da comunidade bacteriana do solo é 170 vezes maior do que a observada in vitro. 4.000 a 7.000 genomas diferentes g-1 de solo (Torsvik et al., 1990). Solo pode conter, em alguns casos, até 10.000 espécies de bactérias (Torsvic et al., 1996). Limitações da avaliação da diversidade microbiana do solo in vitro Meios de cultura não são capazes de suprir todas as condições físico-químicas necessárias ao crescimento de todas as espécies microbianas presentes no solo; As populações microbianas do solo mantêm entre si relações ecológicas de interdependência (cooperação, simbiose etc) que não são reproduzidas nos meios de cultura de laboratório; Microrganismos de crescimento lento ou que formam colônias microscópicas são ignorados; Medidas de biomassa microbiana Constitui parte da fração da M.O. ativa do solo, contendo em média de 2 a 5% do C orgânico (Jenkinson & Ladd,1981) e de 1 a 5% do N total do solo (Smith & Paul, 1990) A BM tem sido proposta como um indicador do estado e das mudanças da matéria orgânica total do solo. Mudanças graduais e pequenas na M.O. do solo podem ser difíceis de monitorar e detectar no curto prazo (Sparling, 1992). A BM, a qual possui, uma taxa de giro (formação e decomposição) rápida (1 a 2 anos) (Jenkinson & Ladd,1981), tem sido sugerida como uma medida mais sensível de aumento ou decréscimo na quantidade total da M.O. do solo. C e N da Biomassa Microbiana - Parte da matéria orgânica do solo constituído de organismos vivos menores que 5 a 10 µm3. - O processo de fumigação com clorofórmio ou a aplicação do microondas mata e lisa as células com a liberação do material citoplasmático para o solo. Assim, o material pode ser extraído do solo. - A fumigação do solo mata os microrganismos mas não afeta a matéria orgânica morta.assim, o fluxo de CO2 origina somente da biomassa microbiana; - O número de microrganismos mortos nos solos não fumigados é muito pequeno comparado com solo fumigado 12 250 de solo ou sedimento Amostras de solo 50 mL de CHCl3 ou micronda Fumigação por 18 a 24 horas Remover CHCl3 Adicionar 1g de solo fresco Repetir com solo não fumigado (controle) FUMIGAÇÃO-INCUBAÇÃO RESPIRAÇÃO - Incubar por 10 dias a 25ºC - Coletar o CO2 evoluído no NaOH 1 N - Quantificar o CO2 por titulação com HCl Biomassa microbiana = CO2 solo fumigado - CO2 solo não fumigado K 250 de solo ou sedimento Amostras de solo 50 mL de CHCl3 ou microondas Fumigação por 18 a 24 horas Remover CHCl3 Repetir com solo não fumigado (controle) FUMIGAÇÃO-EXTRAÇÃO EXTRAÇÃO DO C, N, P, ETC Extração com K2Cr2O7 0,17M + H2SO4 concentrado; Realizar a digestão de um composto com quantidade de C conhecida (sacarose); Medir a absorção em espectrofotômetro; Calcular o CTMB CTMB = CEXTMW / KME Onde: CEXTMW = fluxo líquido de C (diferença entre o C extraído do solo submetido à fumigação, menos o C extraído do solo não fumigado) KME = 0,213, a fração de CTMB extraível por K2SO4 0,5M (pH 6,5 a 6,8) Biomassa Microbiana Carbono da Biomassa = FC - KC FC = (CO2-C evoluído de solos fumigados - CO2-C evoluído de solos não fumigados) KC = 0,45 calibração obtida a partir da fumigação de uma quantidade conhecida de microrganismo. Nitrogênio da biomassa = FN - KN FN de uma quantidade conhecida de microrganismo = (N-NH4 +NO3 mineralizado solos fumigados - N-NH4 +NO3 mineralizado de solos não fumigados) KN=0,57 calibração obtida a partir da fumigação Quociente microbiano (qMIC): C da biomassa microbiana x 100 C orgânico do solo 13 Teoria da “Sucessão de Ecossistemas” (Odum, 1969) Um baixo coeficiente indica uma economia na utilização de energiaa e, supostamente, reflete um ecossistema mais estável. Quociente Metabólico (qCO2) Relação entre a Tx. Respiração microbiana e o C biomassa Anderson & Domsch (1985) qCO2= C-CO2 evoluído do solo (mg/mg) C da biomassa Quociente metabólico (qCO2) À medida que a determinada BM se torna mais eficiente na utilização do recursos do ecossistema, menos C é perdido e maior proporção de C é incorporada aos tecidos microbianos. Uma BM eficiente (< qCO2) tem menor taxa de respiração em relação a uma mesma BM ineficiente (>qCO2). Resposta a um estresse (ex. pH baixo) ou distúrbio no solo (ex. aração) Alta tx. respiratória Alta produtividade do ecossistema
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