Diagnóstico laboratorial em microbiologia

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DIAGNÓSTICO LABORATORIAL EM MICROBIOLOGIA 
FOCO NAS BACTÉRIAS 
SUMÁRIO 
Agentes microbiológicos patogênicos .......................................................................................................................... 2 
Estrutura da célula bacteriana: breve revisão .............................................................................................................. 2 
Parede celular das bactérias..................................................................................................................................... 3 
Papel do laboratório CLÍNICO: isolamento .................................................................................................................. 4 
Fatores que influenciam no isolamento bacteriano .................................................................................................. 4 
Procedimentos adequados de coleta devem ser adotados para evitar o isolamento de um “falso” agente 
etiológico, resultando numa orientação terapêutica inadequada .......................................................................... 4 
Processamento de amostras ........................................................................................................................................ 4 
Esquema de identificação ......................................................................................................................................... 4 
Diagnóstico microbiológico direto ................................................................................................................................. 5 
Diagnóstico microbiológico indireto .............................................................................................................................. 5 
Colorações mais frequentes usados na bacteriologia clinica ....................................................................................... 6 
Enterobactérias gram - ................................................................................................................................................. 7 
Cocos gram + → Staphylococcus e Streptococcus...................................................................................................... 8 
urocultura ...................................................................................................................................................................... 9 
Coleta de urina .......................................................................................................................................................... 9 
urocultura .................................................................................................................................................................. 9 
Critérios diagnósticos ................................................................................................................................................ 9 
Interpretação de resultados .................................................................................................................................... 10 
Hemocultura ................................................................................................................................................................ 11 
Volume de sangue e intervalo de coleta ................................................................................................................. 11 
Frascos para hemocultura ...................................................................................................................................... 11 
Coleta de líquor........................................................................................................................................................... 12 
Microorganismos mais comumente relacionados à meningite ............................................................................... 12 
O que é importante analisar no líquor antes de fazer o isolamento bacteriano? ................................................... 12 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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AGENTES MICROBIOLÓGICOS PATOGÊNICOS 
− Bactérias 
• As bactérias são agentes causadores de doenças 
• Mas também tem inúmeras aplicabilidades na biotecnologia, como CRISPCAS9, indução de produção de 
proteínas recombinantes, produção de vacinas 
• Na indústria alimentícia elas fazem parte da fermentação de lácteos 
• Na indústria farmacêutica, pode ser usada na produção de insulina 
• Na energia, as bactérias ajudem a produzir metano, biogás 
• Ex: bactérias piogênicas 
ESTRUTURA DA CÉLULA BACTERIANA: BREVE REVISÃO 
− Todas as bactérias possuem: 
• Citoplasma* 
• Ribossomos* 
• Membrana plasmática* 
• Nucleoide contendo material genético* 
− Cápsula 
• Polímero viscoso e gelatinoso situado 
externamente à parede celular, composto de 
polissacarídeo e/ou polipeptídeo. 
• Protege a célula contra desidratação. 
• Aderência: auxilia a ligação da bactéria às 
superfícies bióticas ou abióticas. 
• Proteção – resistência a fagocitose pelas 
células de defesa do corpo (fator de 
virulência). 
• Bactérias encapsuladas são mais virulentas 
do que as não encapsuladas. 
− Fímbrias ou pili: está associado a conjugação bacteriana. 
• Tem natureza proteica (pilina), mais curtos que os flagelos 
− Plasmídeo 
− Flagelo 
− Parede Celular 
− Tamanho 
• Variam de 0,3 por 0,8 µm até 10 por 25 µm. 
• As espécies de maior interesse médico medem de 0,5 a 1,0 µm por 
2 a 5 µm. 
− Forma 
• Cocos (esféricas): homogêneos em relação ao tamanho sendo 
células menores (0,8 a 1,0 µm). 
• Bacilos (cilíndricos): forma de bastão, podendo ser longos ou 
delgados, pequenos ou grossos, extremidade reta ou arredondada. 
✓ Espiraladas: 
✓ Espirilos: possuem corpo rígido e se movem às custas de flagelos 
extensos. 
✓ Espiroquetas: são flexíveis e locomovem-se provavelmente às 
custas de movimento do citoesqueleto formando movimentos em 
ondulantes semelhantes a hélices. 
 
 
 
 
 
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− Arranjo: 
• Cocos: 
a) Diplococos: agrupados em pares (ex: Neisseria) 
b) Tétrades: agrupados em 4 cocos. 
c) Sarcina: 8 cocos em forma cúbica. 
d) Estreptococos: agrupados em cadeia (ex: 
Streptococcus); 
e) Estafilococos: arranjos irregulares – cachos de 
uva (ex: Staphylococcus). 
 
 
PAREDE CELULAR DAS BACTÉRIAS 
− 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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PAPEL DO LABORATÓRIO CLÍNICO: ISOLAMENTO 
− Para que isolar microorganismos? 
✓ Para conhecer os diferentes tipos microbianos 
✓ Identificação dos organismos 
✓ Avaliar susceptibilidade a antimicrobianos 
FATORES QUE INFLUENCIAM NO ISOLAMENTO BACTERIANO 
− Coleta do material, assepsia 
− Transporte livre de oxigênio 
− Técnicas cuidadosas de laboratório 
− Toda informação proveniente do serviço de microbiologia depende da qualidade o espécime. 
− O diagnóstico incorreto pode ter consequências diretas no curso do tratamento adequados ao paciente. 
− Colheita incorreta, escassez, contaminação ou transporte deficiente podem resultar em falhas na recuperação de 
patógenos predominantes ou responsáveis pelo processo infeccioso. 
PROCEDIMENTOS ADEQUADOS DE COLETA DEVEM SER ADOTADOS PARA EVITAR O 
ISOLAMENTO DE UM “FALSO” AGENTE ETIOLÓGICO, RESULTANDO NUMA ORIENTAÇÃO 
TERAPÊUTICA INADEQUADA 
− Colher antes da antibioticoterapia, sempre que possível; 
− Instruir claramente o paciente sobre o procedimento; 
− Observar a antissepsia na coleta de todos os materiais clínicos; 
− Colher do local onde o microrganismo suspeito tenha maior probabilidade de ser isolado; 
− Considerar o estágio da doença na escolha do material; 
− Patógenos entéricos, causadores de diarreia, estão presentes em maior quantidades e são mais facilmente 
isolados durante a fase aguda ou diarreica do processo infeccioso intestinal; 
− Quantidade adequada de material deve ser coletada para permitir uma completa análise microbiológica; 
− O pedido do exame deve conter dados como idade,doença de base e indicação do uso de antibióticos. 
PROCESSAMENTO DE AMOSTRAS 
− As amostras podem ser de vários tipos, como 
sangue, fezes, urina e biópsia 
− Os métodos podem ser: 
• Dependentes de cultivo 
✓ Usa meios seletivos e enriquecidos com 
substâncias que promovem crescimento 
bacteriano 
✓ Faz identificação bioquímica, imunológica e 
molecular e susceptibilidade a antimicrobianos 
• Métodos independentes de cultivo 
✓ Moleculares, PCR, hibridização de DNA 
• Métodos imunológicos 
✓ ELISA, ensaios de aglutinação 
 
 
 
ESQUEMA DE IDENTIFICAÇÃO 
− Quando se coleta uma amostra do paciente, há diversos tipos de testes que se pode fazer para conseguir identificar 
qual a espécie de bactéria é aquela 
− Depois de fazer o isolamento correto da bactéria, pode-se fazer os testes, como por exemplo: coloração de gram 
(identifica bactérias gram positivas e gram negativas), teste da coagulase, teste de catalase, teste de 
antimicrobiano, entre outros 
 
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DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DIRETO 
− O diagnostico microbiológico direto pesquisa a presença de agentes infecciosos na amostra clínica 
− Pode ser feito de 4 formas diferentes: 
1. Cultivo de microorganismos em meios de cultura específicos 
2. Visualização direta do patógeno por técnicas de microscopia 
3. Detecção de antígenos específicos do patógeno através do uso de técnicas imunológicas ou de 
biologia celular 
4. Detecção de sequencias de ácidos nucleicos do patógeno pela utilização de sondas ou amplificação 
gênica 
− A visualização e o cultivo são as técnicas mais usadas para realizar o diagnostico microbiológico 
o São simples 
o Requerem menor infraestrutura e tecnologia 
o Tem menor custo 
− O diagnóstico microbiológico por cultivo dos microorganismos (MO) permite a recuperação do agente etiológico e 
sua utilização futura para estudos científicos, epidemiológicos e de susceptibilidade a drogas 
− Contudo, alguns MO não podem ser visualizados sob o microscópio óptico, porque não crescem em meios 
de cultivo 
o Ex: Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae 
o Nesse caso, é necessário fazer as técnicas moleculares de diagnostico, ou as técnicas indiretas 
o As técnicas moleculares oferecem uma capacidade de discriminação muito maior, além de seus 
resultados representarem dados mais precisos, apesar da necessidade de técnicas especializadas 
− A detecção de antígenos e de ácidos nucleicos não permite recuperar células microbianas 
o Essas técnicas são mais eficientes na pesquisa de agentes não cultiváveis ou em concentração 
muito baixa nas amostras coletadas 
o Outra vantagem dessas técnicas é sua rapidez, se comparado com as outras 
o Apresentam um tempo de resposta muito menor do que as técnicas de cultivo, porque não 
dependem do crescimento in vitro do patógeno 
DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO INDIRETO 
− É possível diagnosticar uma infecção estudando o sistema imunológico do paciente, através da pesquisa de 
anticorpos específicos 
o Essa pesquisa permite a detecção de infecções agudas ou crônicas 
o Pode haver reações cruzadas, podendo ter falsos negativos 
− Procedimentos adequados de coleta devem ser adotados para evitar o isolamento de agente pertencente a 
microbiota, resultando em resultados errados 
 
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− Indicações: 
o Colher antes da antibioticoterapia, sempre que possível 
o Instruir o paciente sobre o procedimento 
o Observar a antissepsia na coleta de todos os materiais clínicos 
o Colher do local onde o microorganismo suspeito tenha maior probabilidade de ser isolado 
o Considerar o estágio da doença na escolha do material 
o Patógenos entéricos, causadores de diarreia, estão presentes em maior quantidade na fase aguda 
da doença/diarreica 
o Quantidade adequada de material deve ser coletado para permitir uma completa análise 
microbiológica 
o O pedido do exame deve conter dados como: idade, doença de base e indicação do uso de 
antibióticos 
COLORAÇÕES MAIS FREQUENTES USADOS NA BACTERIOLOGIA CLINICA 
− A importância das colorações é que, ao contrário das demais provas microbiológicas, fornecem um resultado 
rápido. 
− Coloração de gram 
o A coloração de Gram diferencia as bactérias com base nas características de suas paredes 
celulares. 
o As bactérias Gram-positivas possuem uma parede espessa de peptidoglicano e grandes 
quantidades de ácido teicoico, os quais retêm o corante inicial (cristal violeta), não sendo afetado 
pelo passo de descoloração com álcool absoluto (ou álcool acetona). 
o Dessa forma, as células apresentam ao final da coloração uma cor azul/roxa. 
o As Gram-negativas, por sua vez, possuem uma parede celular constituída de uma camada fina de 
peptidoglicano, que permite a descoloração do cristal violeta com o álcool absoluto (ou álcool 
acetona), e posterior coloração com o corante de fundo, a fucsina. 
o Ao final do processo, as bactérias Gram-negativas apresentam cor rosa/vermelha. 
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− Coloração de Ziehl Nielsen (BAAR) 
o A coloração de Ziehl-Neelsen é utilizada basicamente para micobactérias, cuja parede celular 
constituída por ácidos micólicos é resistente à descoloração por álcool-ácido, preservando a cor 
do corante inicial, fucsina concentrada. Por essa razão, os bacilos apresentam uma coloração 
vermelha ao final do procedimento. Essa coloração é o método mais rápido para detecção de 
micobactérias em amostras clínicas com suspeita de tuberculose ou hanseníase. 
o A pesquisa de micobatérias por baciloscopia pode ser realizada em amostras de escarro, lavado 
brônquico, lavado gástrico, linfa de lóbulo da orelha (hanseníase), urina, líquor, líquido pleural, 
biópsias e secreções. 
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o 
ENTEROBACTÉRIAS GRAM - 
− Essas bactérias são muito comuns, responsáveis por diversas patologias 
− São em sua maioria bactérias gram-negativas 
− As enterobactérias são isoladas em meios seletivos, como Ágar McConkey, o qual é específico para gram 
negativas 
o A presença de cristal violeta no Ágar McConkey impede o crescimento de bactérias GRAM + como 
estafilococos e enterococos. Fermentadores de lactose formam colônia rosa/vermelho e amostras 
lactose – apresentam-se incolores ou transparentes. 
o Obs.: ágar sangue é um meio não seletivo para bactérias gram + e – 
o Meio TSI: auxilia na diferenciação específica, ex: Salmonela-produção de H2S, Klebsiella e E.coli-
produção gás CO2. 
o 
 
 
 
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COCOS GRAM + → Staphylococcus E Streptococcus 
− Os cocos Gram-positivos são exemplos de bactérias frequentemente isoladas de amostras clínicas. Por essa 
razão, dependendo do quadro clínico do paciente, meios como ágar sangue e ágar manitol salgado (em caso de 
suspeita de Staphylococcus aureus) são muito utilizados para o semeio primário de amostras. 
− As provas bioquimicas separam os gêneros de staphylo e strepto 
− O esquema de identificação da bactéria da amostra pode seguir o esquema abaixo: 
o Depois que fizer o isolamento e a coloração da bactéria, se faz a semeadura da amostra na placa 
de ágar sangue (não seletivo) e depois se faz o teste da catalase e coagulase 
o OBS: existem diversos fluxogramas que podem ser seguidos → esse é apenas um exemplo 
 
 
 
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UROCULTURA 
COLETA DE URINA 
− Para coletar adequada amostra de urina é necessário avaliar as condições de higiene e normalidade da genitália, 
coletar a amostra preferencialmente no laboratório e proceder à limpeza da genitália com água e sabão (que deve 
ser totalmente removido), sem a utilização de antissépticos. 
− Nos pacientes com controle miccional, o jato médio é o modo ideal de coleta, com intervalo mínimo de duas horas 
após a última micção. 
− Nos pacientes sem controle miccional a urina pode ser coletada de três maneiras: saco coletor, punção 
suprapúbica e cateterismo vesical. 
− Quando for usado o saco coletor, as trocas devem ser realizadas no máximo a cada 30 minutos, até obtenção da 
amostra de urina. 
− A punção suprapúbica (PSP),método invasivo, seguro e de execução relativamente fácil, está indicada quando a 
coleta por via natural suscitar dúvidas ou quando estiver contraindicada, como nos quadros de diarreia, dermatite 
perineal, vulvogaginite, balanopostites e em algumas malformações genitais. 
− O cateterismo vesical (CV) preconizado por alguns autores, como rotina na coleta de urina, é um método invasivo, 
agressivo e podelesar a mucosa uretral. Oferece menos segurança e é pouco prático, considerando-se o elevado 
número de exames que são realizados. 
− É importante que a urina seja imediatamente processada para não haver perda dos elementos figurados, nem 
proliferação bacteriana. Portanto, a coleta de urina deve ser feita próxima do local do exame. 
UROCULTURA 
− A amostra de urina é semeada no meio CLED 
(Cystine Lactose Electrolyte Deficient) 
− A semeadura deve ser quantitativa → No semeio 
quantitativo, a alça bacteriológica calibrada (1 µL 
ou 10 µL) é introduzida em uma amostra de urina 
bem homogeneizada, fazendo-se movimentos 
para cima e para baixo verticalmente. A alça 
carregada é então utilizada para inocular o meio 
de cultura, fazendo-se, inicialmente, uma linha 
reta no centro da placa (correspondente ao 
diâmetro da placa) e completando-se o 
espalhamento com uma série de passagens em 
ângulo de aproximadamente 90° (em relação à 
estria inicial) 
− Embora a urina seja considerada um meio 
estéril, algumas pessoas tem uma microbiota 
comensal → o analista deve prestar atenção 
nesse quesito para que não tenha erros no teste 
− A identidade da bactéria isolada na urocultura 
não indica, necessariamente, infecção, pois existem bactérias que podem normalmente colonizar a porção distal 
do trato urinário sem causar infecções (microbiota local). Sendo assim, a quantificação é um aspecto essencial do 
exame bacteriológico da urina. 
CRITÉRIOS DIAGNÓSTICOS 
− Existem dois critérios diagnósticos 
o Critério diagnóstico de Kass > 105 UFC/ml 
o Critério diagnóstico de Stamm: de 102 a 104 UFC/ml 
▪ UFC – unidade formadora de colônia 
▪ Os pacientes do sexo feminino usam ambos os critérios 
− O resultado da urocultura deve ser avaliado juntamente com outros dados laboratoriais, como o sumário de urina 
(pesquisa de bacteriúria e/ou piúria) e clínicos (presença ou ausência de sintomas, fatores predisponentes, 
população de risco, etc) 
o OBS: piúria é a presença de leucócitos degenerados ou pus na urina 
− Esse exame demora, em média, 5-7 dias 
 
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INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS 
− A infecção do trato urinário (ITU) é uma das 
doenças bacterianas mais comuns; a 
conduta clínica adequada exige o 
conhecimento do número e tipos de 
bactérias envolvidas. Assim, quando 
métodos quantitativos ou semiquantitativos 
são usados, o exame bacteriológico de urina 
pode ser uma ajuda valiosa no diagnóstico e 
no controle terapêutico. 
• Leucócitos ou piócitos (piúria) são 
muito sugestivos de ITU 
• Outras condições também podem 
apresentar leucocitúria, sem significar 
ITU: febre, desidratação grave, 
inflamação de estruturas contíguas 
como na apendicite, injúria química do trato urinário, glomerulonefrites e tumores. 
• O teste da esterase leucocitária na fita reativa detecta mais de cinco leucócitos por campo de grande 
aumento e o teste da conversão do nitrato em nitrito detecta, indiretamente, bactérias Gram-negativas na 
urina. 
• Na bacterioscopia pelo Gram, uma ou mais bactérias Gram-negativas correlacionam-se fortemente com 
urocultura positiva. Apresenta sensibilidade de 94%, especificidade de 92% e valor preditivo de 85% quando 
associada à piúria. 
• A maioria dos episódios de ITU é causada por enterobactériascomo: Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, 
Citrobacter, Proteus, Serratiae outros. 
• A Escherichia coli é o agente etiológico mais comum, ocorrendo em 80-90% dos casos. 
• Bactérias da espécie Proteus são encontradas em 30% dos meninos com cistite e 
Staphylococcussaprophyticus em 30% dos adolescentes com ITU. 
• Em crianças imunodeprimidas, principalmente naquelas que estejam usando antibióticos potentes, de amplo 
espectro, pode ocorrer ITU por Candida albicans ou outros fungos. 
• Uma situação peculiar é a presença de bacteriúria significativa em crianças sem sintomatologia (bacteriúria 
assintomática). É caracterizada por três uroculturas positivas consecutivas em um período de três dias a 
duas semanas. Geralmente é transitória, 95% das meninas com bacteriúria assintomática ficam livres dela 
sem tratamento em um ano. Pode tornar-se- -se sintomática se a criança é submetida a tratamento com 
antibióticos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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HEMOCULTURA 
− A hemocultura é um exame de grande importância clínica 
− O que é bacteremia? É a presença de bactérias na corrente 
sanguínea → ela pode ser causada por diversos processos, 
como: 
o Drenagem de abcessos 
o Transplantes 
o Perfurações, punções, etc 
o OBS: o sangue é um meio estério → não 
deve ter nenhum tipo de bactéria nele 
 
− Material clínico usado: sangue 
o Deve-se fazer uma punção venosa 
o Evite retirar sangue de cateter, pois pode 
levar a contaminação – há exceções 
o O número de amostras varia: 
▪ Em crianças: 2 amostras ou 3 amostras de punções diferentes 
▪ Dependendo da doença suspeita, o numero de amostras é outro 
− Cerca de 30% das hemoculturas pedidas dão positivo, os outros 70% dão negativo 
o Isso ocorre por diversas razões 
o A bacteremia pode ser intermitente aparece e desaparece 
o A bacteremia pode não estar tão elevada 
o Pode haver erros de procedimentos 
o Mesmo com hemocultura negativa, há protocolos de tratamento 
VOLUME DE SANGUE E INTERVALO DE COLETA 
− 
FRASCOS PARA HEMOCULTURA 
− Deve-se respeitar os volumes de cada frasco 
− É uma metodologia que pode ser manual ou automatizada 
o Quando se tem uma metodologia automatizada, pode-se usar aditivos para neutralizar e inativar 
agentes antimicrobianos. Assim, pode-se fazer coleta para hemocultura mesmo que o paciente já 
tenha iniciado a antibioticoterapia 
o O transporte desses frascos precisa ser feito em temperatura de 20° - 25° C e em até 12 horas após 
a coleta no máximo 
 
− Nas metodologia automatizada: 
o Se tem um processamento mais eficiente 
o Maior rapidez na liberação dos resultados – 24 horas (maioria) até 5 dias 
 
 
 
 
 
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COLETA DE LÍQUOR 
− Líquor é a amostra de escolha quando se tem suspeita de meningite, meningoencefalite e leishmaniose visceral 
MICROORGANISMOS MAIS COMUMENTE RELACIONADOS À MENINGITE 
 
O QUE É IMPORTANTE ANALISAR NO LÍQUOR ANTES DE FAZER O ISOLAMENTO BACTERIANO? 
− Celularidade, nível de glicose e proteínas 
o Valores de proteínas acima de 100 mg/dL indicam provável infecção bacteriana 
o Contagem normal de leucócitos no líquor é < 5 células/mm3, todos mononucleares 
▪ Se houver polimorfonucleares, provavelmente se tratará de uma infecção bacteriana 
o Valores de glicose menores que 30mg/dL ou menos que 50% dos níveis séricos, em 50% dos 
pacientes, sugerem meningite bacteriana, fúngica ou por micobactérias