02 - Técnicas Laboratoriais Utilizadas em Micologia Médica

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Técnicas Laboratoriais Utilizadas
em Micologia Médica
2
Valéria Maria de Souza Framil
INTRODUÇÃO
Várias técnicas são utilizadas para estabele-
cer ou confirmar o diagnóstico de uma infec-
ção fúngica. A interpretação correta dos re-
sultados laboratoriais depende não só de um
profissional de laboratório experiente como
Fig. 2.1 Escamas de pitiríase versicolor coleta das com
lâmina de bisturi.
também da qualidade da coleta e processa-
mento do material clínico analisado (Figs.
2.1 a 2.7). Um diagnóstico errôneo pode ser
consequência de material inadequadamen-
te coletado, estocado e processado. Informa-
ções essenciais como idade, profissão, local
em que o.material foi coletado, residência ou
Fig. 2.2 Pelo tonsurado coletado com pinça.
8
viagem recente do paciente podem auxiliar,
no laboratório, para o diagnóstico correto e
sugerir a seleção de outras técnicas laborato-
riais para identificação do fungo. O laborató-
Fig. 2.3 Local para coleta de material ungueal - área de
transição entre a região sã e a região doente da lesão
(seta).
Fig. 2.4 Técnica de onicoabrasão, utilizada para diminuir a
espessura da unha e melhorar a coleta de material ungueal
- área de transição entre a região sã e a região doente da
lesão (seta).
TécnicasLaboratoriais Utilizadas em Micologia Médica
rio deve ser informado de riscos inerentes a
algum tipo de material clínico (por exemplo,
se ° paciente é portador de hepatite viral ou
é Hlv-positivo).
Fig. 2.5 Material de mucosa oral coletado com lâmina de
bisturi para diagnóstico de lesão oral.
Fig. 2.6 Material de gânglio coletado com seringa estéril.
Fig. 2.7 Secreção e grãos branco-amarelados obtidos após
expressão de fístula.
TécnicasLaboratoriais Utilizadas em Micologia Médica
PRINCIPAIS TÉCNICAS PARA
DIAGNÓSTICO EM MICOLOGIA
MÉDICA
Exame micológico
A técnica é simples, barata e largamente uti-
lizada. Vários materiais clínicos podem ser co-
letados para esse exame, como escamas, pelos,
unhas, secreção, pus, crostas, grãos, espécime
de biópsia, liquor, urina e escarro. É útil no
diagnóstico das micoses superficiais, cutâneas
e subcutâneas. Em algumas situações, pode es-
tabelecer o diagnóstico de micoses sistêmicas,
como a detecção de Cryptococcus neoformans
no liquor e de Paracoccidioides brasiliensis no
escarro. °material coletado pode ser proces-
sado de várias maneiras: a fresco, em solução
fisiológica, clareado com KOHIDMSO, corado
com nanquim, Gram, Leishman, entre outras
(Figs. 2.8 e 2.9).
1. Exame micológico direto
2. Cultura
3. Cultivo em lâmina
4. Testes biológicos
5. Testes bioquímicos
6. Anatomopatológico
7. Inoculação em animais
8. Lâmpada de Wood
9. Intradermorreação
10. Sorologia
11. Hemocultura
12. Viabilidade
Fig. 2.8 Coleta de escamas de pele e exame micológico direto - presença de hifas septadas hialinas (40x).
Fig. 2.9 Coleta de escamas de lesão verrucosa e exame
micológico direto - presença de corpúsculos fumagoides
"'------'-=---_ (40x).
9
10
~
I
Novos métodos diagnósticos para
fungos
Outros procedimentos têm sido empregados
como estratégias para aumentar a sensibili-
dade e eficiência no diagnóstico das onicomi-
coses.
Exame histopatológico
A coleta do material ungueal pode ser feita
de várias formas: biópsia da unha, clippings,
shaving da lâmina ungueal ou curetagem de
unha. O material é corado pelo ácido periódi-
co de Schiff(PAS) ou pela prata, em situações
especiais em que o exame micológico de rotina
não é possível de ser realizado (Fig. 2.10).
Exame direto corado com calcoflúor white
O calcoflúor white é um agente clareador am-
plamente utilizado nas indústrias têxteis e de
papel, que se liga naturalmente à celulose e à
Técnicas laboratoriais Utilizadas em Micologia Médica
quitina. A técnica utilizada para preparar a
solução de calcoflúor white consiste em dissol-
ver 10 g de KOH em 90 mL de água destilada
e adicionar 10 mL de glicerol. Em seguida, dis-
solve-se 0,1 g de calcoflúor em 100 mL de água
destilada em aquecimento brando. A solução
preparada clarifica os debris celulares e cora
as estruturas fúngicas. Após coleta do material
clínico, pingar 1 a 2 gotas da solução de cal-
coflúor white - KOH e observar as estruturas
fúngicas em microscópio de fluorescência (Fig.
2.11). A técnica é bastante sensível, é simples e
demonstra o fungo viável, porém não é prática
para rotina, pois o corante é caro e há necessi-
dade do uso de microscópio de fluorescência.
Cultura
É indispensável para o isolamento e a identi-
ficação do fungo patogênico. A macroscopia já
nos permite a identificação do fungo filamen-
toso e fungo leveduriforme (Fig. 2.12). O iso-
lamento de fungos oportunistas de sítios esté-
Fig. 2.10 Coleta do material ungueal pela técnica de c/ipping (A), presença de filamentos fúngicos corado pela prata (B)
e PAS(C).
Fig. 2.11 Presença de filamentos fúngicos no pelo. (Cola-
boração Prof. Dr. Benedito Correa (lCB/USP).)
Fig. 2.12 Aspecto macroscópico de fungo filamentoso (A)
e fungo leveduriforme (B).
10
Novos métodos diagnósticos para
fungos
Outros procedimentos têm sido empregados
como estratégias para aumentar a sensibili-
dade e eficiência no diagnóstico das onicomi-
coses.
Exame histopato/ógico
A coleta do material ungueal pode ser feita
de várias formas: biópsia da unha, clippings,
shaving da lâmina ungueal ou curetagem de
unha. O material é corado pelo ácido periódi-
co de Schiff (PAS) ou pela prata, em situações
especiais em que o exame micológico de rotina
não é possível de ser realizado (Fig. 2.10).
Exame direto corado com calcoflúor white
O calcoflúor white é um agente clareador am-
plamente utilizado nas indústrias têxteis e de
papel, que se liga naturalmente à celulose e à
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quitina. A técnica utilizada para preparar a
solução de calcoflúor white consiste em dissol-
ver 10 g de KOH em 90 mL de água destilada
e adicionar 10 mL de glicerol. Em seguida, dis-
solve-se 0,1 g de calcoflúor em 100 mL de água
destilada em aquecimento brando. A solução
preparada clarifica os debris celulares e cora
as estruturas fúngicas. Após coleta do material
clínico, pingar 1 a 2 gotas da solução de cal-
coflúor white - KOH e observar as estruturas
fúngicas em microscópio de fluorescência (Fig,
2.11). A técnica é bastante sensível, é simples e
demonstra o fungo viável, porém não é prática
para rotina, pois o corante é caro e há necessi-
dade do uso de microscópio de fluorescência.
Cultura
É indispensável para o isolamento e a identi-
ficação do fungo patogênico. A macroscopia já
nos permite a identificação do fungo filamen-
toso e fungo leveduriforme (Fig. 2.12). O iso-
lamento de fungos oportunistas de sítios esté-
Fig. 2.10 Coleta do material ungueal pela técnica de c/ipping (A), presença de filamentos fúngicos corado pela prata (8)
e PAS(e).
Fig. 2.11 Presença de filamentos fúngicos no pelo. (Cola-
boração Prof. Dr. Benedito Correa (ICB/USP).)
Fig. 2.12 Aspecto macroscópico de fungo filamentoso (A)
e fungo leveduriforme (8).
TécnicasLaboratoriais Utilizadas em Micologia Médica
reis, tais como liquor e sangue, tem significado
importante de infecção, mas, quando isolado
de materiais como pus, escarro ou urina, deve
er interpretado com muita cautela. O meio
de cultura mais utilizado é o âgar-Sabouraud-
dextrose, que pode ser modificado (ciclo-hexi-
mida e cloranfenicoÍ para dermatófitos; bile
de boi para Malassezia spp. e outros).
Cultivo em lâmina
Também conhecida como microcultivo, essa
técnica é utilizada para estudo dos aspectos
microscópicos característicos: micélio vegeta-
tivo e micélio reprodutivo ou de frutificação.
técnica consiste em uma câmara úmida
contendo uma lâmina de microscópio coloca-
da\sobre bastão de vidro em U. Um pequeno
quadrado (1 cm'') de ágar-batata sobre a lâ-
mina é semeado com o fungo a ser estudado.
Uma lamínula estéril é colocada sobre o bloco
de ágar, e, após o crescimento satisfatório, a
lamínula é retirada e colocada em lâmina co-
rada com lactofenol azul de algodão e subme-
tida ao estudodas estruturas microscópicas
do fungo (Fig. 2.13).
Fig. 2.13 Preparo de cultivo em lâmina para fungo fila-
entoso (microcultivo) (A) e lâmina já corada com lac-
tofenol azul de algodão para observação das estruturas
fúngicas (B).
11
Testes biológicos para diferenciação
entre alguns dermatófitos: teste de
perfuração do pelo fn vítro
É uma prova biológica para diferenciação
entre Trichophyton mentagrophytes e Tricho-
phyton rubrum. Incubam-se pelos estéreis em
placa de Petri contendo caldo Sabouraud e
inóculo de T mentagrophytes. A cada 24 ho-
ras, um pelo da placa é retirado e examinado
ao microscópio corado com lactofenol azul de
algodão. O T mentagrophytes perfura o pelo
radialmente, enquanto o T rubrum não é ca-
paz de perfurá-lo (Fig. 2.14).
Teste de pigmentação em ágar-batata
Prova nutricional para diferenciação entre T
mentagrophytes e T rubrum. O repique dos
dermatófitos é feito em ágar-batata, no qual o
T rubrum pigmenta o meio em vermelho; o T
mentagrophytes não é capaz de produzir esse
pigmento (Fig. 2.15).
Prova da urease
Prova bioquímica usada para diferenciação
entre T mentagrophytes e T rubrum. O repi-
que do dermatófito é feito em meio de Chris-
tensen, rico em ureia, e a atividade ureásica
produz alteração alcalina do pH (de amarelo
a vermelho). Somente o T mentagrophytes al-
tera a coloração desse meio, tornando-o róseo
(Fig.2.16).
Fig. 2.14 Teste de perfuração do pelo in vitro - T.mento-
grophytes é capaz de perfurar o pelo.
12
Trichophyton
rubrum +
ágar-batata Trichophyton
mentagrophytes -
Fig. 2.15 Teste de pigmentação em ágar-batata.
Trichophyton
rubrum-
meio de Trichophyton
Christensen mentagrophytes +
Fig. 2.16 Prova de urease.
Anatomopatológico
A demonstração de elementos fúngicos em
tecidos é útil para o diagnóstico das micoses
subcutâneas e sistêmicas.
Inoculação em animais
As culturas em estudo podem ser inoculadas
em animais suscetíveis, comocobaias, camun-
dongos, coelhos e outros. A inoculação em
animais tem comofinalidade o isolamento de
determinados fungos, a determinação de sua
virulência e a obtenção de soros hiperimunes.
Técnicas Laboratoriais Utilizadas em Micologia Médica
lâmpada de Wood
A luz de Woodé empregada para auxílio diag-
nóstico e controle de tratamento de tinha do
couro cabeludo, pitiríase versicolor e entras-
ma. O filtro de Wood é formado por placa
que contém 9 a 10% de sais de níquel, o que
permite a passagem de radiações entre 340
e 450 nm. O exame é feito em local escuro, e
observam-se:
a. tinha do couro cabeludo: pelos infecta-
dos com alguns dermatófitos emitem
fluorescência de cores variadas, como:
M. canis ou M. audouini - verde-azula-
da; T. schoenleini - verde-palha.
b. Pitiríase versicolor: escamas infectadas
comMalassezia spp. emitem fluorescên-
cia em tom prateado.
c. Eritrasma: escamas infectadas com
Corynebacterium minutissimum emitem
fluorescência em tom vermelho-coral.
M. canis - verde-azulada
Malassezia spp. - tom prateado
Fig. 2.17 Lâmpada de Wood.
TécnicasLaboratoriais Utilizadas em Micologia Médica
Fig. 2.18 Reação intradérmica - injeção intradérmica de
0,1 mL de esporotriquina. A leitura foi feita 48 horas após
a injeção, e o diâmetro da pápula eritematosa foi igual a
14 mm (positiva).
Intradermorreação
Prova realizada com injeção intradérmica,
de 0,1 mL do antígeno padronizado, na face
anterior do antebraço. A leitura é feita 48 ho-
ras após a injeção, e considera-se positivo o
aparecimento de pápula eritematosa igualou
maior do que 5 mm. O resultado dessa prova
deve ser bem interpretado, pois pode indicar
infecção ativa, infecção passada ou apenas
sensibilização ao antígeno em questão. Émui-
to utilizada em inquéritos epidemiológicos
para pesquisar regiões endêmicas de micoses.
Tem valor prognóstico quando analisada ao
longo do tratamento de determinadas doen-
ças (Fig. 2.18).
Sorologia
As provas sorológicas são uma valiosa opção
para auxílio no diagnóstico e na avaliação
prognóstica de determinadas infecções fún-
gicas, como coccidioidomicose,paracoccidioi-
domicose, histoplasmose, etc. Os resultados
dessas provas devem ser interpretados junta-
mente com os dados epidemiológicos, quadro
clínicoe exame micológico.
Hemocultura
Essa prova pode ser realizada em todos os ca-
sos suspeitos de infecção fúngica sistêmica.
13
Paracoccidioides brasiliensis
Malassezia spp. - pseudo-hifas
Fig. 2.19 Viabilidade em material clínico (40x) - células
vivas (em verde), células mortas (em afaranjado).
Viabilidade
Técnica indicada para observar a viabilidade
de células fúngicas através do método de fluo-
rocromasia, no qual células fúngicas vivas
acumulam a solução de diacetato de fluores-
ceína (DF), corando-se em verde, e células
fúngicas mortas impregnam-se da solução de
brometo de etídio (BE),corando-se em alaran-
jado (Fig. 2.19).
ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DAS
ESPÉCIES DE LEVEDURAS DO GÊNERO
MALASSEZIA
Vários meios de cultura podem ser utiliza-
dos para isolamento da Malassezia spp.; como
ágar Dixon modificado, ágar Littman e ágar
Mycosel acrescido de extrato de levedura e
14
Meio de cultura
1 1•••••••••••••••••••••• ·······1
t t
1. Provas Bioquímicas 2. Estudo morfológico
(método de Gram)
[ L··············r····················:. . .
a) Reação b) Teste Tween c) Prova
da catalase 20, 40, 60, 80 da esculina
Fig. 2.20 Fluxograma da identificação das espécies de le-
veduras do gênero Malassezia. Metodologia proposta por
Guillot e cols., 1996.
azeite de oliva. A incubação para isolamen-
to das colônias varia de uma temperatura de
32° a 35°C por um período máximo de 15 dias.
Após o isolamento da cultura, segue-se o es-
tudo microscópico da forma e do tamanho das
células, como primeiro critério para identifi-
cação das espécies.
Provas bioquímicas para identificação
de espécies de Malassezia
Reação da catalase
Para identificação de Malassezia restricta,
utiliza-se a prova da catalase, já que essa é a
única espécie lipodependente com resultados
negativos nesse teste. A reação da catalase é
realizada pela adição de uma gota de peróxi-
do de hidrogênio 10 volumes sobre uma colô-
nia, depositada sobre uma lâmina de micros-
copia. A produção de "bolhas de gás" indica
reação positiva (Fig. 2.21).
Teste Tween 20, 40, 60, 80
A partir de cada uma das espécies de Malas-
sezia, uma suspensão de 2 mL na concentra-
ção de 105 células/mL é adicionada a 16 mL
de ágar Mycosel (Difco),à temperatura de 40°
a 50°C, A mistura deve ser homogeneizada e
a seguir adicionada a placas de Petri. Após a
solidificação do meio, adiciona-se ao ágar 4 !J,L
de cada polissorbato, a saber: Tween 20, 40,
60 e 80 (Sigma), em pontos equidistantes. A
seguir, a incubação das placas é realizada a
•••
TécnicasLaboratoriaís Utilizadas em Micologia Médica
Malassezia restrieta:
não é capazde produzir
bolhade ar
M. globosa, M. sympodialis,
M. furfur, M. slooffiae,
M. obtusa: capacidade
de produzirbolhade ar
Fig. 2.21 Fluxograma da reação da catalase. (Colaboração
Dra. Márcia Melhemjlnstituto Adolfo Lutz.)
uma temperatura de 32°C, durante período
de 5 a 7 dias. Após esse período, observa-se
crescimento da levedura ao redor de cada po-
lissorbato, indicando assimilação do suhstra-
to e resultado positivo. A interpretação dos re-
sultados positivos permite a diferenciação de
três espécies: Malassezia furfur; Malassezia
slooffiae e Malassezia sympodialis (Fig. 2.22).
A espécie Malassezia pachydermatis é a única
levedura do gênero que cresce em meio de cul-
~
~
M. sympodialis e M. sloffiae -
ambas absorvem Tween 40, 60 e 80
~
~
M. globosa-
não há absorção Tween 20, 40, 60 e 80
~
~
M. furfur-
há absorção Tween 20, 40, 60 e 80
Fig. 2.22 Fluxograma do teste Tween 20, 40, 60, 80.
p'"
TécnicasLaboratoriais Utilizadas em Micologia Médica
tura simples (fonte de carbono e nitrogênio)
sem adição de lipídios.
Prova da esculina
A avaliação da atividade de ~-glicosidase é
realizada com a prova dá esculina, na qual a
cultura é semeada naquele caldo e mantida
à temperatura de 30°C por um período de 15
dias. A hidrólise da esculina,por ação enzimá-
tica, promove o escurecimento do caldo, indi-
cando resultado positivo. Esse teste permite
a diferenciação entre as espécies Malassezia
sympodialis e Malassezia slooffiae.
Estudo morfo/ógico
A espécie Malassezia globosa foi diferenciada
da espécie Malassezia obtusa pelo formato
globoso de suas células, coradas pelo método
de Gram e observadas ao microscópio óptico
comum (Fig. 2.24).
Negativa - M. s/ooffiae
Fig. 2.23 Fluxograma da prova da esculina. (Colaboração
Ora. Márcia Melhem/lnstituto Adolfo Lutz.)
Estudo morfológico
(método de Gram)
[ * ······1
•
Malassezia globosa Malassezia obtusa
Fig. 2.24 Fluxograma do estudo morfológico das levedu-
ras Malassezía glabosa e Malassezía obtusa.
15
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