relatorio biotec 1

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
DEPARTAMENTO DE ANÁLISES CLÍNICAS E BIOMEDICINA
DISCIPLINA: Biotecnologia aplicada a Biomedicina
ALUNOS: Alana Naira Pavan 104018
 Giovana Silva Hila 104381
Purificação e Quantificação de Proteínas
Maringá
2019
1. INTRODUÇÃO
		Quando falamos de proteína recombinante significa que são proteínas produzidas artificialmente a partir de um gene clonado (DNA humano + E. coli = proteína recombinante). A purificação de proteínas tem o objetivo de obter uma proteína a partir de alguma amostra biológica, por exemplo, vindo de um tecido ou microrganismo.
		Existem várias técnicas para purificação, como a cromatografia por exclusão de peso molecular ou gelficação, que é uma separação das proteínas baseados nos seus pesos moleculares; a cromatografia de troca iônica, baseado nas cargas liquidas; a cromatografia por afinidade, baseado nas suas afinidades específicas para outras moléculas ou proteínas.
		A purificação ocorre em três etapas: na etapa I ocorre lise celular, sonicação e centrifugação; na etapa II ocorre a ligação da proteína à resina e lavagens e, por fim, na etapa III faz-se uma eluição. 
		Após ser feita a purificação, fazemos a quantificação, que pode ser tanto direto pelo espectro na região UV quanto por métodos colorimétricos (Método do Biureto, Método de Lowry e Método de Bradford).
		O método de Bradford usa um corante, Coomassie Brilliant Blue (BG-250), que interage com a porção N terminal da proteína. Essa interação provoca um deslocamento do equilíbrio do corante para uma forma chamada de aniônica, essa forma absorve fortemente em 595nm e assim é possível quantificar a proteína.
		As vantagens desse método são várias, como a sensibilidade do método, rapidez, com menos interferentes, a possibilidade de utilização em vários meios, como plasma e soro sanguíneo, líquor, saliva humana, entre outros. Entretanto, como qualquer outro método, também existem as desvantagens, as quais são a variação da absortividade específica quando se tem diferentes proteínas, resultados que nem sempre são reprodutíveis por conta do grau de pureza do corante BG-250 e falta de linearidade na lei de Beer-Lambert.
2. PROCEDIMENTOS
Para a purificação da proteína:
Procedimento experimental:
		1. Foi adicionado 8mL do tampão de lise ao botão de células armazenado no -20ºC e foi incubado em banho de gelo, por 20 minutos. Foi homogeneizado.
 	2. Foi submetido as células a lise por sonicação. Programação: 10 pulsos (10 seg) e intervalos de 59 seg. 
		3. Foi centrifugado por 30 minutos a 8.000 x g, 4ºC. 
		4. Foi recolhido o sobrenadante e transferido para um tubo novo.
		5. Equilibrou-se a coluna passando 4mL do tampão de lise. 
		6. Adicionou-se o sobrenadante a coluna, com cuidado, para que fosse evitado a ressuspensão da resina. 
		7. Foi deixado passar todo o conteúdo. Coletou-se o que passou na coluna em um frasco novo.
		8. Realizou-se 3 lavagens da coluna com tampão de lavagem utilizando 4mL. Coletou-se cada uma das lavagens em tubos separados. 
		9. Foi deixado passar todo o conteúdo da última lavagem. 
		10. Realizou-se a eluição da coluna com tampão de eluição (1mL). Foi feito 5 eluições, coletando em tubos de 1,5mL, separadamente. 
		11. Realizou-se a quantificação pelo método de Bradford.
Para a quantificação de proteínas pelo Método de Bradford:
		1. Preparou-se 10mL a solução estoque de BSA (albumina). 
	2. Preparou-se 11 diluições da proteína padrão em um volume final de 20µL e adicionou-se 4ul a placa. 
3. Foi adicionado 200 µL do reagente CBB (Bradford) 
4. Foi incubado o sistema a temperatura ambiente por 5 minutos. 
5. Realizou-se a leitura no espectrofotômetro, comprimento de onda 595nm e os valores de absorbância foram anotados. 
6. Utilizou-se as concentrações e os valores de absorbância para construir um gráfico de concentração versus absorbância.
7. Foi determinado a equação da reta e os valores de ângulo de inclinação da reta e ponto de intercepção da reta no eixo y. 
8. Preparou-se as amostras, cujo teor de proteínas totais, serão determinadas conforme os passos anteriores. 
9. Utilizou-se a equação da reta para determinar a concentração de proteínas nas amostras.
3 RESULTADOS
	Concentração (mg/mL)
	Absorbância
	2
	0,350
	1,5
	0,342
	1
	0,298
	0,75
	0,249
	0,5
	0,250
	0,25
	0,131
	0,125
	0,166
	Eluição
	Concentração (mg/mL)
	0,177
	0,19
	0,172
	0,15
	0,162
	0,08
	0,152
	0,008
	0,154
	0,02
Equação da reta:
Então:	 		
4 REFERÊNCIAS
ZAIA, Dimas A. M.; ZAIA, Cássia Thaïs B. V.; LICHTIG, Jaim. DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS VIA ESPECTROFOMETRIA: VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS MÉTODOS EXISTENTES. Química Nova, São Paulo, p.787-793, jun. 1998.
2	1.5	1	0.75	0.5	0.25	0.125	0.35	0.34200000000000003	0.29799999999999999	0.249	0.25	0.13100000000000001	0.16600000000000001