Citogenética humana

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Citogenética humana 
A citogenética humana estuda os cromossomos, sua estrutura, suas anormalidades 
e seu comportamento, baseados em uma suspeita clínica 
O centrômero é uma estrutura de heterocromatina constitutiva, que é uma região 
de constrição primária 
-> Nos cromossomos, chamamos o braço curto de p e o braço longo de q. As 
extremidades dos cromossomos são chamadas de telômeros 
Tijo & Levan: determinaram o conjunto cariotípico da espécie humana, tendo 46 
cromossomos 
Cariótipo: conjunto cromossômico de cada espécie. Representa o número total de 
cromossomos das células somáticas (2n) 
Nos humanos temos: 
-> 23 pares de cromossomos 
-> 22 autossomos 
-> 1 par sexual 
- O padrão de bandas de um cromossomo não difere de um par de cromossomos 
para outro, nos ajudando a diferenciar um par de outro 
Baseado numa suspeita clínica de anomalias congênitas, o médico pode solicitar um 
diagnóstico pré-natal -> o médico pode medir o TN (translucência nucal) entre a 11º 
e 14º semanas, se for indicado 2,5mm de espessura significa a presença de alguma 
alteração no cariótipo (30% dos casos) 
Quando investigar: 
-> Idade materna avançada 
-> Genitores com translocação equilibrada 
-> Gestações anteriores com relatos de aneuploidias ou anomalias cromossômicas 
-> Malformação fetal 
-> Abortamentos de repetição – 2 ou mais abortos 
-> Ansiedade materna 
Alterações cromossômicas estão presentes em 0,7% dos NV, 6% dos NM e 60% 
dos abortos 
- Podem ter etiologia ambiental, idiopática ou genética, sendo as anomalias mais 
comuns as trissomias, a poliploidias e monossomias (principalmente monossomia do 
cromossomo X) 
Doenças genômicas 
Cromossomopatias podem ser numéricas, estruturais ou gênicas 
Na década de 60 havia a técnica de pré bandamento cromossômico conseguíamos 
enxergar os cromossomos corados, na década de 70 surgiu a técnica de 
bandamento G, que fez com que pudéssemos enxergar os pares cromossômicos 
de forma inequívoca, na década de 80 surgiu o bandamento de alta resolução, que 
deixava os cromossomos mais esticadinhos, na década de 90 surgiu a técnica de 
FISH, que nos permitia detectar pequenos rearranjos internos nos cromossomos e, 
nos anos 2000, surgiram as técnicas de cariotipagem molecular para avaliarmos o 
genoma de uma forma completa e análise de pequenas partes, como na técnica 
de Arrays. 
-> Cultivo de células 
-> Baixo custo (o mais caro é a mão de obra) 
-> Análise: profissionais qualificados 
-> Tempo para liberação de laudos diferenciados 
- Devem ter células em crescimento celular, evitar contaminações, células em 
metáfase para análise do cariótipo, bandamento cromossômico deve dar certo, não 
podendo haver perdas, tendo uma limitação técnica de 5Mb 
Cariotipagem - semeadura 
A cariotipagem serve para estudar alterações no nível citogenético, a partir de uma 
cultura de células – usamos qualquer célula que seja capaz de iniciar um ciclo 
celular e, usamos como material biológico: 
-> Sangue periférico (linfócitos) 
-> Medula óssea (diagnóstico de câncer hematológico) 
-> Biópsia cutânea (principalmente em suspeitas de mosaicismo) 
-> Amniócitos, biópsia de vilosidade coriônica, sangue de cordão umbilical e material 
de aborto 
-> Biópsia de tumores sólidos 
Coletar o sangue periférico num tubo à vácuo ou numa seringa com heparina 
sódica, colocamos o sangue num meio de cultura pois precisamos de células em 
metáfase para a análise dos cromossomos – a cultura é realizada dentro de uma 
capela de fluxo laminar. O meio de cultura que trabalhamos é o RPMI 1640. 
Colocamos um suplemento no meio de cultura enquanto estamos trabalhando na 
capela (reagentes para manter a célula vida durante o ciclo celular – 
fitohemaglutinina e soro fetal bovino), devemos adicionar 10 a 12 gotas de sangue 
total ou centrifugamos o sangue para usarmos apenas o creme leucocitário, 
fechamos o tubo e homogeneizamos o tubo em colocamos as amostras numa 
estufa por 72 horas a 37ºC para formar o número máximo de células no ciclo 
celular. 
-> A fitohemaglutinina é uma substância extraída do feijão e faz com que as 
nossas células, principalmente os linfócitos T entrem no ciclo celular, sendo um 
agente mitogênico 
-> O soro fetal bovino nos dá condições de as células se manterem vivas durante 
o processo de cultura 
Células devem parar em metáfase pois é quando os cromossomos estão em seu 
maior grau de condensação, devemos fazer a colchinização para que a célula 
pare em metáfase, adicionamos a colchicina (alcaloide), que impede a formação das 
fibras do fuso mitótico e, interrompendo o ciclo celular e impedindo a separação 
das cromátides irmãs, e colocamos a amostra na estufa. 
-> Na metáfase, os cromossomos se encontram em seu grau máximo de 
condensação, estão na zona equatorial da célula e estão unidos apenas pelos 
centrômeros 
Devemos centrifugar após as 72horas de incubação pois temos meios de cultura, 
colchicina e substâncias que não são mais importantes, assim, nós devemos retirar 
o sobrenadande e adicionamos uma solução hipotônica. Hipotonização (adição de 
uma substância para deixar a célula túrgida para os cromossomos se espalharem 
melhor na placa metafásica e, colocamos a substância na estufa por 20 minutos -> 
devemos fazer uma centrifugação para retirarmos a substância líquida e banhamos 
de uma solução hipotônica. 
Após a hipotonização, devemos adicionar 0,5ml de fixador 3:1 (metanol : ácido 
acético) para interromper a ação da hipotônica, para que a célula não fique túrgida 
e estoure, pois não podemos perder seus cromossomos – com a adição do 
fixador devemos homogeneizar cuidadosamente a solução e centrifugar 
Após isso, devemos retirar o sobrenadante e fazermos uma lavagem com 5ml do 
fixador 3:1 pois o fixador remove as substâncias que não são necessárias, deixando 
a membrana celular rígida, não tendo risco de romper as células e, centrifugar -> 
fazemos esse processo por 3 vezes. Devemos fazer isso até termos 1ml de 
suspensão celular claro, devemos pingar as lâminas no banho maria ou do alto, 
flambando no bico de Bunsen. 
Coloração das lâminas: usamos reagentes da banda G, trabalhamos com um 
corante chamado Wrigh (3ml tampão : 1ml Wrigh), deixamos agir de 10 a 15 minutos 
Resultado de um cariótipo possui uma nomenclatura que universaliza os resultados, 
normatizada pelo ISCN (Na International System for Human Cytogenetics 
Nomenclature) 
-> Começa com a contagem do número de cromossomos numa metáfase 
-> Cromossomos sexuais (se o resultado for normal, paramos a nomenclatura) 
-> Tipo de alteração 
-> Qual cromossomo envolvido 
-> Banda cromossômica com alteração 
Ex: 47, XY +21 (trissomia do cromossomo 21) 
45, X 
46, XY del (5) (p14->pter) 
Técnicas de coloração 
-> Coloração convencional: coloração única que nos permite identificar os 
cromossomos por grupos cromossômicos 
- Analisamos os cromossomos por grupos, levando em consideração a posição dos 
centrômeros (cromossomos metacêntricos, submetacêntricos e acrocêntricos) e o 
tamanho dos cromossomos) 
-> Bandamento G: cria padrões claros e escuros nos cromossomos – as regiões 
de bandas claras são ricas em citosina e guanina (genes ativos) e, as bandas 
escuras de adenina e timina 
- Conseguimos identificar os cromossomos em pares 
-> Bandamento C: cora a região de heterocromatina constitutiva de alguns 
cromossomos específicos, o par 1, par 9, par 16, a heterocromatina e o centrômero 
-> Bandamento NOR – RON: cora constrições secundárias dos cromossomos 
satélites (cromossomos do grupo D e G, menos o Y) 
- Destaca regiões organizadoras de nucléolos (regiões statélites) 
-> Bandamento Q: técnica fluorescente, em que usamos quinacrina mostarda, 
formando bandas brilhantes (AT) e opacas (CG) – fazemos a análise por 
microscopia de fluorescência 
-> Bandamento R: trabalha com salina e calor, criando um padrão inverso da técnica 
de bandamento G – é usada em laboratórios daeuropa, no Brasil é a técnica de 
bandamento G 
=> Um cromossomo marcador é um cromossomo que, pelo padrão de banda 
dele, não conseguimos classifica-los em nenhum dos grupos, é um cromossomo 
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