Slides de Aula - Unidade I (3)-convertido

Prévia do material em texto

UNIDADE I
Estudos Disciplinares Cariotipagem Clássica e FISH
Prof. Dr. Alexandre Dias
O que é citogenética?
· “Estudo dos cromossomos, sua estrutura, suas anormalidades e seu comportamento, baseados em uma suspeita clínica”.
Relembrando… o DNA e sua estruturação
Cromossomo
A	T
C	C
A	T
Medical Cell Biology Fonte: Adaptado de: Goodman, S.R.
Histona DNA
A estrutura cromossômica
A determinação do número cromossômico da espécie humana
 (
Figure 4 | Joe Hin Tijo. Reproduced with permission from REF. 25 © (1979) Springer Verlag.
) (
Figure 3 | Albert Levan. Reproduced with permission from REF. 25 © (1979) Springer Verlag.
)
Fonte: Adaptado de: Tijo, J. H. & Levan, A. The chromosome
number of man. Hereditas 42, 1-6 (1956)
Figure 5 | A human metaphase plate, from the original Tijo and Levan paper, showing 46 chromosomes. Reproduced with permission from REF. 14 © (1956) Blackwell Publishing.
Fonte: Adaptado de: Gartler Nature Reviews Genetics 7, 655-660 (August 2006) | doc 10.1038/nrg1917
O que é o cariótipo?
· Cariótipo é o conjunto cromossômico de cada espécie. Representa o número total de uma célula somática (2n).
Espécie humana:
· Células somáticas = 2n (diploide) – 46 cromossomos.
Constituição cariotípica da espécie humana
· Células somáticas = 2n (diploide) – 46 cromossomos.
· 23 pares de cromossomos
· 22 autossomos
· 1 par sexual
· XX – Mulheres
· XY – Homens
Fonte: Montenegro e Dias, 2011.
Tipos de cromossomos na espécie humana
Quando fazer o cariótipo?
· Idade materna avançada.
· Genitores com translocação balanceada.
· Gestações anteriores com relatos de aneuploidias ou anomalias cromossômicas.
· Malformação fetal.
· Abortamentos de repetição – dois ou mais abortos.
· Ansiedade materna.
· Outras indicações.
Interatividade
Assinale a alternativa em que teste de cariotipagem deve ser realizado:
a) Casais com perdas reprodutivas recorrentes.
b) Recém-nascidos com malformações congênitas.
c) Feto visualizado pela ultrassonografia com anormalidades indicativas de aneuploidias.
d) Pacientes com câncer hematológico (leucemias).
e) Em todas as situações propostas acima.
Resposta
Assinale a alternativa em que teste de cariotipagem deve ser realizado:
a) Casais com perdas reprodutivas recorrentes.
b) Recém-nascidos com malformações congênitas.
c) Feto visualizado pela ultrassonografia com anormalidades indicativas de aneuploidias.
d) Pacientes com câncer hematológico (leucemias).
e) Em todas as situações propostas acima.
Cariotipagem – Coleta
· Material biológico utilizado para a realização do cariótipo.
· metafase
· Sangue (linfócitos).
· Medula óssea (diagnóstico de câncer hematológico).
· Biópsia cutânea.
· Amniócitos, biópsia de vilosidade coriônica, sangue de cordão, material de aborto (pré-natal).
· Biópsia de tumores sólidos.
Cariotipagem – Semeadura
Seringa heparinizada (Heparina sódica)
Tubo a vácuo (Heparina sódica)
Meio de cultura
· *Todos os materiais utilizados devem ser estéreis.
Fonte: Bortolai e Dias, 2005
Cariotipagem – Semeadura
Meio de cultura e sangue identificados
Fluxo laminar
 (
Suplementação do meio de 
cultura :
 
SORO FETAL BOVINO: vai dar todos os nutrientes importantes para manter as celulas vivas 
Fito-hemaglutinina
: estimulador
 
do crescimento celular ela tem afinidade por linfocitos T , então essa subs age nos linfocitos T fazendo com que esse tipo de célula entre no ciclo celular fazendo com que eu possa isar essas celulas la nafrente que estão na mitose 
)
Suplemento para meio de cultura
Enriquecimento
do meio de cultura
Fonte: Bortolai e Dias, 2005
Cariotipagem – Cultura de células
10 a 12 gotas de sangue
ou camada de linfócitos
Homogeneizar
cuidadosamente
Estufa de cultura
por 72 horas a 37°
3 dias depois...
Fonte: Bortolai e Dias, 2005
Condensação máxima dos cromossomos
 (
72hs: entra
 
no ciclo celular e tem mair numero de celulas no ciclo , mairo numero de celuals em mitose. O sucesso de maior numerode celulas analisadas terá mais sucesso. 
)
 (
Metáfase
) (
Anáfase
) (
Mitose
Final da anáfase
)
Final da prófase
 (
Telófase
)
Prófase
Intérfase
Molecular Biology of the Cell.
Fonte: Adaptado de: Alberts, B.; Bray, D.; Lewis, J.; Raff, M.; Roberts, K.; Watson, J.
Cariotipagem – Colchicina
80 a 100 ul de colchicina
 (
COLCCHICINA: é um alcoloide q tem como principal função inibir a formação das fibras do fuso mitotico Ela não permite que mihhas cr
omatides irmas do 
me
u cromossomo duplicado se 
separe ,
 entã
o o cromossomo não passa pra fas
e de anafase permanecendo na fase de metafase que é a faze que os cromossomos se encontram nas fase equatorial . 
e
 tem o maior grau de condensação . Quanto mais condesado estiver meu cromossomo melhor minha capacidade de enxerga-lo na lamina corada
)
	
Estufa por 45 a 60 min.
Fonte: Bortolai e Dias, 2005
Inibição da formação das fibras do fuso
 (
Fuso mitótico
)
 (
Centríolos
) (
Cromossomos
)
Fonte: Adaptado de: EPM, UNIFESP
Cariotipagem – Hipotonização
 (
Usa-se uma solução de cloreto de potassio hipotonica com uma tonicidade menor que 
meio meio
 permitindo que agua entre dentro da celula . 
Melhorar espalhamento de cromossomo dentro da celula.
Deixar a celula mais turgida 
)
Após 72hs de incubação
centrifugar
Após centrifugação
Fonte: Bortolai e Dias, 2005
Retirar sobrenadante Adicionar 5ml hipotônica
Estufa por 20 min
Cariotipagem – Fixação
Retirar sobrenadante Adicionar 5 ml fixador 3:1
 (
Interroper a ação da solução, pq se não a celula vai se 
romper ,
 e ai vai perder cromossomo. Pra interroper adciona uma solução chamada fixadorr, que é composto por 
dois ´produtos
 quimicos um é o metanol e o outro é o acido acetico. 
)Centrifugar
	
Repetir por mais 3 vezes
Fonte: Bortolai e Dias, 2005
Cariotipagem – Preparo das lâminas
Deixar 1 ml de suspensão
 (
Celulas estão prontas para colocar na lamina e ser analisadas.
)
	
Pingar as lâminas no banho-maria e deixar secar
Fonte: Bortolai e Dias, 2005
Cariotipagem – Coloração das lâminas
Deixar agir por 10 a 15 min.
Lâminas coradas
Fonte: Bortolai e Dias, 2005
Cariotipagem – Análise
Fotomicroscópio
Análise
Fonte: Bortolai e Dias, 2005
Interatividade
Qual a finalidade da fitohemaglutinina?
a) Estimular a proliferação celular no processo do cultivo de linfócitos de sangue periférico.
b) Inibir a formação das fibras do fuso mitótico.
c) Melhorar o espalhamento cromossômico.
d) Interromper o ciclo celular em metáfase.
e) Evitar o crescimento e proliferação bacteriana no cultivo celular.
Resposta
Qual a finalidade da fitohemaglutinina?
a) Estimular a proliferação celular no processo do cultivo de linfócitos de sangue periférico.
b) Inibir a formação das fibras do fuso mitótico.
c) Melhorar o espalhamento cromossômico.
d) Interromper o ciclo celular em metáfase.
e) Evitar o crescimento e proliferação bacteriana no cultivo celular.
Técnicas de coloração das lâminas
· Coloração convencional – coloração única.Pinta o cromossomo em uma unica tonalidae a classificação e feita de acordo com o tamanho e onde se localiza o centromero 
· Bandamento G – padrões claros (CG – “genes ativos”) e escuros (AT).- enzimas e corantes especificos 
· Bandamento C – heterocromatina constitutiva.- destaca regiões de cntromeros e regioões de blocos heterocormaticos de DNA repetitivo de alguns pares específicos destacando o par cromossomo n° 1,9,16,cromosso y nos homens 
· Bandamento NOR – RON – constrições secundárias dos cromossomos com satélites.
· Bandamento Q – quinacrina mostarda (fluorescente) – bandas brilhantes (AT) e opacas (CG) – Y.
· Bandamento R – salina e calor (inverso da G).
Coloração convencional
Identificação dos cromossomospor grupos.
 (
Coloração convecional é usado o corante GIENSA este corante faz com 
ue
 todos os cormossos tenha um coloração unica e permite que façamos sua identificação em grupos cromossomicos , grupos baseados em tamanho dor cromossomo e posição do centromero 9 metacentricos, submetacentricos, acrocentricos 
)Fonte: Arquivo pessoal
Coloração – Bandamento G
 (
Cariotipo pareado
 
cromossomos ja estão par a par separados . 
ex
: PAR 1, PAR 2 ....
Nehum par é igaul 
)
46,XX
Identificação dos cromossomos por pares.
46,XY
Fonte: Montenegro e Dias, 2011
Coloração – Bandamento C
Identificação de regiões de heterocromatina e centrômero.
 (
Tecnica de coloração por bandamento C: é a tecnica que evidencia as regiões de 
heterocromatina ,
 todos centromeros estão destacados , muito usada quando se tem um cromosso em formato de anel , tem uma aleração estrutirais, 
)
	
Fonte: Labgen, 2009
Coloração – Bandamento NOR
Identificação de regiões
organizadoras de nucléolos.
 (
Tecnica de bandamento NOR
 :
 RESSALTA a regiões organizadoras de nucleolos dos cromossomos com satelites dos cromossomos acroscentricos . 
cromossomo
 mar ; não sei de qual par é, descobrir sua origem marca a região organizadora de nucleola , cromossomo derivado de um acroscentrico 
)
Cromossomos acrocêntricos satelitados.
Fonte: Labgen, 2009
Cariotipagem – Bandamento R
 (
Nosso cromossomo numero 
1
 tem uma banda clara( bang ) na banda R é ao contrario 
)
	
Fonte: Software Ikaros
Cariotipagem – Bandamento Q
 (
Observa bandamensto mais luminosos e outros opacos
 
)
	
Fonte: Software Ikaros
Atenção!
Cariotipagem
1. Cultivo de células.( precisa de celulas em metafase- medula- ossea , mas a celulade sangue ja esta diferenciada, precisa estimular para entrar no ciclo celular ) 
2. Baixo custo.
3. Análise: profissionais qualificados.
4. Tempo para liberação de laudos diferenciados.
( dependendo da celula o tempo de cultivo é diferente 
Concluindo
Pontos de atenção para o teste de Cariotipagem
Processo de cultura de células – depende de diversos fatores para o sucesso:
· Crescimento celular;
· Evitar Contaminações;
· Células em metáfase para análise do cariótipo;
· Bandamento cromossômico;
· Limitação técnica – resolução 5 Mb.
( 5 milhoes de nucleotideos consegue enxergar )
Interatividade
Qual a técnica de coloração utilizada na cariotipagem que permite identificar as regiões de heterocromatina constitutiva e centromérica dos cromossomos?
a) Bandamento NOR.
b) Bandamento R.
c) Bandamento Q.
d) Bandamento C.
e) Bandamento G.
Resposta
Qual a técnica de coloração utilizada na cariotipagem que permite identificar as regiões de heterocromatina constitutiva e centromérica dos cromossomos?
a) Bandamento NOR.( cora regiões organizadoras de necleolos)
b) Bandamento R( inverso da banda G).
c) Bandamento Q.(corante florescente)
d) Bandamento C.
e) Bandamento G.(permite que estudamos todas as alterações acima de 5mb)
Coloração convencional – Classificação cromossômica
Localização do centrômero:
· Metacêntrico, submetacêntrico e acrocêntrico.
Tamanho do cromossomo:
· Maiores, grandes, intermediários e pequenos.
Coloração convencional – Classificação cromossômica
Classificação cromossômica:
· Coloração convencional:
· Grupo A 
· Grupo B
· Grupo C
· Grupo D
· Grupo E
· Grupo F
· Grupo G
Coloração convencional – Classificação cromossômica
Grupo A
Pares cromossômicos: 6 cromossomos
· 1 braço curto e longo semelhante
· Maiores cromossomos metacêntricos
· 2 braço curto menor que o braço longo
· Maiores cromossomos submetacêntricos
· 3 braço curto e longo semelhante ( menor que o par n°1)
· Grandes cromossomos metacêntricos
Coloração convencional – Classificação cromossômica
Grupo B
Pares cromossômicos: 4 cromossomos
· 4 e 5 braço curto é muito menor que o braço longo
· Grandes cromossomos submetacêntricos
· p<<<q
Coloração convencional – Classificação cromossômica
Grupo C
Pares cromossômicos: 14 cromossomo autossomo, mulheres 2 cromossomos x, homens 1 cromossomo x 
· 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 e X 
· Cromossomos submetacêntricos intermediários. Menor que cromossomos do tipo A e B
· Homens: 15 cromossomos
· Mulheres: 16 cromossomos
Coloração convencional – Classificação cromossômica
Grupo D
Pares cromossômicos:6 CROMOSSOMOS
· 13, 14 e 15
· Grandes cromossomos acrocêntricos.
· Possuem satélites. Não tem quase nada de braço curto. 
Coloração convencional – Classificação cromossômica
Grupo E
Pares cromossômicos:6 cromossomos no total.
· 16, 17 e 18
· Pequenos cromossomos submetacêntricos.
· 16 – “ligeiramente metacêntrico”.(Proporção do braço curto e longo não é tão evidente)
Coloração convencional – Classificação cromossômica
Grupo F
Pares cromossômicos:4 crossmossomos no total
· 19 e 20
· Pequenos cromossomos metacêntricos.
· “gravatinhas”
Coloração convencional – Classificação cromossômica
Grupo G
Pares cromossômicos:4 cromossomos autossomos 
· 21, 22 e Y
· Pequenos cromossomos acrocêntricos.
· 21 e 22 – possuem satélites
· Y – NÃO possui satélites
Coloração convencional – Análise
Ordem de análise
1º – Grupo A 2º – Grupo B 3º – Grupo D 4º – Grupo G 5º – Grupo E 6º – Grupo F 7º – Grupo C
Coloração convencional – Análise
 (
18
) (
2
)Primeiro passo:conta quantos cromossomos tem
16
· Dividir a figura em 4 quadrantes
· Contar o número de cromossomos
 (
[Digite uma citação do documento ou o resumo de um ponto interessante. Você pode posicionar a caixa de texto em qualquer lugar do documento. Use a guia Ferramentas de Desenho para alterar a formatação da caixa de texto de citação.]
)
 (
22
)
 (
4
)
Fonte: Arquivo pessoal
Coloração convencional – Grupo A
 (
Par
:
 
n°
 1 – maiores meta
n°
2 – maiores submeta
n°
3 – grande meta
)
Fonte: Arquivo pessoal
Coloração convencional – Grupo B
 (
Quatros cromossomos 
submetacentricos(
 braço lungo e curto bem distinto)
Grandes cromossomos.
Apenas identifica pela letra B
)
Fonte: Arquivo pessoal
 (
grande
 cromossomo acroscentricos – 6 cromossomo no total . 
identifica
 com a letra D
)
Coloração convencional – Grupo D
	
Fonte: Arquivo pessoal
Coloração convencional – Grupo G
 (
Pequenos acroscentricos 
Mulheres so tem
 par 21 e 22
Homesn tem 
par 21 e 22
 e Y
Cariotipo do sexo masculino- 
5 cromossomo
 no total.
)	
Fonte: Arquivo pessoal
Coloração convencional – Grupo E
 (
Cromosomo submetacenrico
6
 no total
)
	
Fonte: Arquivo pessoal
Coloração convencional – Grupo F
 (
Pequenos cromossomo
 metacentricos
Pareidos com gravatinhas
4
 cromossomos 
Par 19, 20
)
	
Fonte: Arquivo pessoal
Coloração convencional – Grupo C
 (
Sub metacentricos de tamanho intermediario, proporção de braço curto e longo bem definido.
No 
total 15
 cromossomos 
Definido esse cariotipo como sendo 46 xy por coloração convencional
Se fosse mulher teria 16 cromossomos perfazendo 46 xx 
)
Fonte: Arquivo pessoal
Nomenclatura
· ISCN – An International System for Human Cytogenetics Nomenclature. Mitelmam F.(ed): S. Karger, Basel, 2016.
· Função: Universalização das interpretações do resultado citogenético.
 (
Nº de 
cr
) (
,
) (
Cr Sx
) (
,
) (
Tipo Alt.
) (
(Cr.
 )
) (
(Banda
 )
)
 (
Se tiver normal escreve só ate aqui
)
Exemplo:
46,XX ou 46,XY – normal 47,XY,+21 – sindrome de dowl
45,X
46,XY, del (5) (p14®pter)
Interatividade
Qual a finalidade diagnóstica da identificação/classificação cromossômica por coloração convencional?
a) Identificar cada par cromossômico com exatidão.
b) Detectar microdeleções e microduplicações cromossômicas.
c) Identificar alterações numéricas e grandes anormalidades estruturais.
d) Identificar as regiões de heterocromatina dos cromossomos acrocêntricos.
e) Investigar alterações cromossômicassubmicroscópicas (menores que 5 Mb).
Resposta
Qual a finalidade diagnóstica da identificação/classificação cromossômica por coloração convencional?
a) Identificar cada par cromossômico com exatidão.
b) Detectar microdeleções e microduplicações cromossômicas.
c) Identificar alterações numéricas e grandes anormalidades estruturais.
d) Identificar as regiões de heterocromatina dos cromossomos acrocêntricos.
e) Investigar alterações cromossômicas submicroscópicas (menores que 5 Mb).
ATÉ A PRÓXIMA!