Estudo dirigido aula V - respostas

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Estudo dirigido aula V – respostas
Nome: Luca Mendes Lampert
Matrícula: 201911869
1. A hibridização é uma técnica utilizada para rastrear de forma específica uma sequência de combinações entres os ácidos nucléicos do DNA. É comumente usada para determinar a distância genética entre espécies diferentes.
2. As sondas podem ser de três tipos:
 DNA: são originadas por amplificação de PCR e clonagem baseada no DNA.
 RNA: são obtidas a partir da transcrição de inserções de DNA em vetores como plasmídeos, por clonagem.
 Oligonucleotídeos: são obtidas a partir de síntese química.
3. As sondas podem ser detectadas por diversas maneiras, como por exemplo.
 Radioativas: nucleotídeos com radioisótopos são incorporados na sonda. São detectados por meio da técnica de autorradiografia. Exemplos de radioisótopos: carbono 14, fósforo 32 (mais utilizado), fósforo 33, enxofre 35.
 Não-radioativas: nucleotídeos que possuem moléculas ou substâncias que podem ser facilmente detectadas são incorporados na sonda. Exemplos: inserção de fluoróforos (como fluoresceína e rodamina), digoxigenina (com um anticorpo específico para a detecção), biotina/estreptavidina.
A detecção também pode ser feita por métodos colorimétricos ou de quimioluminescência. 
4. Os nucleotídeos podem ser marcados por Nick translation ou por Random priming:
 Nick translation: ocorre quebra de fita simples através da DNA polimerase. Ocorre também adição de nucleotídeos marcados no lugar de nucleotídeos antes existentes, porém não marcados, a partir da extremidade 3’ OH. Tem ação da exonuclease, ela substitui os nucleotídeos não marcados pelos marcados.
 Random priming: inserção de hexanucleotídeos como primers. A DNA polimerase I, através da subunidade Klenov, vai atuar apenas como polimerase, ou seja, vai originar uma nova fita com os nucleotídeos marcados, sem ação da exonuclease.
5. Os ácidos nucléicos são apoiados em um suporte sólido, eles são misturados com uma solução aquosa contendo as sondas com nucleotídeos marcados, podendo ou não ocorrer hibridização, a depender da complementaridade de base. 
Logo após isso, são feitas lavagens para remover o que não foi hibridizado para deixar apenas a parte da amostra que hibridizou por ter semelhança com a sonda. 
6. São conjuntos de milhares de sondas não marcadas de DNA ou oligonucleotídeos que estão fixadas em locais específicos de uma superfície. Essas sondas, aos serem misturadas com a solução contendo as amostras, podem fazer hibridização.
Após o processo de hibridização, o resultado pode ser obtido por meio de um scanner que detecta o sinal emitido por cada um dos pontos de mistura. Esse sinal é analisado e quantificado por um software de imagem.
 Se não houve hibridização, a cor que o software mostra é branco. 
 Se o trecho está presente em ambas as populações, ou seja, se hibridizou com a amostra x e y, a cor é amarela.
 Se ocorreu hibridização apenas na amostra x, a cor é vermelha. Se ocorreu apenas com a amostra y, é verde.
7. 1. (b) Southern Blot 
2. (d) Northern Blot 
3. (c) Dot Blot 
4. (a) Colony Blot 
5. (c) Slot Blot 
6. (c) Microarray 
a) colônias de bactérias 
b) hibridação de DNA 
c) amostras de DNA 
d) hibridação de RNA
8. Letra b)
9. Letra d)
	
	Molécula/substância a ser identificada
	Preparação da amostra
	Sonda
	Método de detecção
	Southern Blotting
	DNA
	O DNA é purificado e digerido por enzimas de restrição. Os fragmentos são separados em gel de agarose.
	Nucleotídeo marcado por radioatividade ou por moléculas que podem ser detectadas
	Raios-X
	Northern Blotting
	RNA
	O RNA é apenas extraído e isolado, não é digerido por enzimas de restrição. É separado em gel de agarose.
	Nucleotídeo marcado por radioatividade ou por moléculas que podem ser detectadas
	Raios-x, quimioluminescência
	Western blotting
	Proteína
	Separado em gel de eletroforese.
	Proteínas
	Anticorpos
	Hibridização em dot blot
	DNA/RNA/proteínas
	É aplicado diretamente em uma membrana.
	Oligonucleotídeos
	Anticorpos
	Colony blot
	Colônias de bactérias com molécula de DNA relacionada à sonda
	Prepara-se uma placa de Ágar contendo colônias de bactérias individuais.
	DNA
	Autorradiografia
	Hibridização in situ
	DNA ou RNA
	Usa-se uma lâmina com um cromossomo /célula/tecido.
	DNA ou RNA
	Autorradiografia