Citogenética Clínica

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CITOGENÉTICA
Prof. Dr. Anderson Garcia
Um breve histórico...
Walther Flemming
1892
As primeiras ilustrações dos cromossomos humanos
Denominou a parte corável do núcleo de CROMATINA
E foi o primeiro a utilizar o termo mitose
Em 1888 Waldeyer introduziu a palavra CROMOSSOMO, oriundo das palavras gregas 
Corpo colorido.
Os cientistas da época atribuíram então que os determinantes da herança genética eram transportados pelos 
Após a “redescoberta” da herança mendeliana, Sutton desenvolveu a 
TEORIA CROMOSSÔMICA DA HERANÇA
.
GENÉTICA
CITOGENÉTICA
ESTUDO DOS CROMOSSOMOS
Com os avanços na área da microscopia no início do século XX, os citologistas:
Começaram a estudar o número de cromossomos
Contribuições de Painter
Determinou que o número de cromossomos em humanos é 46, mais 2 cromossomos sexuais.
Em 1952, Hsu, cultivou células humanas e conclui que o número de cromossmos
Humanos era realmente 48.
Mas um erro de laboratório aconteceu
As células ao invés de ser lavadas com: 
Solução hipertônica
Foram lavadas com 
Solução hipotônica
Separou os cromossomos e gerou uma melhor visualização 
Assim, com o aperfeiçoamento da técnica, Tijo e Levan relataram diplomaticamente que:
2n = 46
Este dogma perdurou por mais de 30 anos e foi derrubado por Ford e Hamerton
onde constataram que esse número cromossômico não pode ser generalizado.
“ não queremos generalizar, mas nossos achados, mas informamos que o número cromossômico do homem é 2n=46”
Assim iniciou-se a era da CITOGENÉTICA CLÍNICA
Quando três anos depois, identificou-se quatro síndromes cromossômicas:
DOWN
TURNER
KLINEFELTER
XXX
A constatação de que nas síndromes de Turner e Klinefelter e XXX, ocorrem 1 e 2 corpusculos de Barr esclareceu o mecanismo de determinação do sexo, onde: 
A presença do cromossomo Y que determina a masculinização
A partir da análise do cariótipo descobriu-se vários tipos de anomalias autossômicas, assim como anomalias genéticas envolvendo cromossomos sexuais.
O avanço em técnicas utilizando corantes fluorescentes como derivados de quinacrina mostarda (QM), coloração com Giemsa, possibilitou a identificação dos pares de bases, assim como uma gama de anormalidades e síndromes cromossômicas: aneuploidias, deleções, microdeleções, translocações, inversões, inserções e mosaicos, além de uma crescente coleção de rearranjos e outras anomalias citogenéicas. 
Citogenética molecular
Através da FISH
BANDEAMENTO CROMOSSÔMICO
Estes corantes tem afinidade afinidades por DNA, sendo cada um específico para região e fluorescem sob a luz ultravioleta.
Após tratamento adequado com esses corantes, cada cromossomo mostra zonas brilhantes e escuras, ou bandas, que são específicas em tamanho e localização para este cromossomo. 
Bandeamento cromossômico: Técnica de coloração que permite identificar regiões específicas do cromossomo, utilizando uma variedade de corantes. 
Cromossomos corados pela técnica de bandeamento de alta resolução
A técnica de bandeamento cromossômico permite:
A análise de cariótipo (montagem através do pareamento cromossômico);
Identificar alterações cromossômicas, permitindo detectar pequenas variações estruturais como deleções, inversões, translocações etc.;
Localizar uma região cromossômica diretamente afetada;
Compreensão da evolução cariotípica entre as espécies
As técnicas de bandeamento podem ser divididas em duas categorias:
1 Aquelas que produzem bandas ou faixas ao longo de toda a extensão do cromossomo ( bandas Q, G e R)
2 Aquelas que marcam regiões específicas de alguns cromossomos ou de todos os cromossomos (bandas C, RON, T, G-11, Cd e coloração DAPI/DA).
BANDEAMENTO Q (Caspersson, 1970) 
Primeiro método de marcação longitudinal desenvolvido para cromossomos humanos.
Tratamento com fluorocromos, o primeiro a ser utilizado foi a quinacrina mostarda (QFQ)
Possui maior afinidade sequencias ricas em AT (banda brilhante)
O bandeamento Q é útil para estudar polimorfismos e detectar a presença de material genético do cromossomo Y.
Desvantagens
A maioria dos fluorocromos não é permanente;
A preparação e a observação das lâminas tem de ser feita no escuro;
Uso de microscópio de fluorescência;
Não é viável como rotina na maioria dos laboratórios.
BANDEAMENTO G
Método de diferenciação longitudinal dos cromossomos. (mais utilizado nos laboratórios de citogenética)
Utiliza-se:
Tripsina no tramento das lâminas;
Coloração com Giemsa
Produz :
Bandas Escuras – sequencias ricas em AT 
Bandas Claras – sequencias ricas em GC
Vantagens
Custo razoavelmente baixo;
Durabilidade das bandas nas preparações citológicas;
Possibilidade de uma análise mais apurada das metáfases ao microscópio
BANDEAMENTO R
As bandas reversas possuem um padrão de marcação cromossômico oposto ao produzido pelas bandas Q e G. 
Podem ser produzidas por:
Tratamento das lâminas em altas temperaturas e vários tampões;
Coloração com Acrilamida laranja ou Giemsa.
Desta forma as bandas fluorescentes e escuras possuem mais maior afinidade por regiões mais ricas em bases CG, e as bandas opacas e claras, por sequencias ricas em bases AT. Ao contrário do bandeamento G, são as bandas R positivas que contém uma maior quantidade de genes ativos.
TÉCNICAS QUE MARCAM REGIÕES ESPECÍFICAS DO CROMOSSOMO
BANDEAMENTO C
O DNA dos seres humanos possuem diferentes composições que podem ser especificamente coradas. O número de métodos que coram estas regiões tem aumentado enormemente. 
Estas técnicas permitem ao pesquisador determinar ou investigar a estrutura primária destas bandas específicas.
Este conhecimento possibilita também, o entendimento do papel da heterocromatima na organização do genoma humano. São utilizadas quando as técnicas rotineiras de bandeamento longitudinal não são informativas.
Cora especificamente a heterocromatina constitutiva (HC) que fica localizada ao redor dos centrômeros. Marca também regiões polimórficas pericentroméricas dos cromossomos 1, 9 e 16 e a porção distal do braço longo do cromossomo Y
Procedimento:
Com o bandeamento CBG ( C-bands using barium hydroxide and Giemsa) o DNA é desnaturado por Hidróxido de bário ou àlcalis.
Ao renaturar ( na presença de soluções salinas mornas) a dupla fita, no local em que o DNA é repetitivo, ele o faz muito separadamente, produzindo a banda. 
Para estudar cromossomos marcados (que identificam a linhagem do doador em caso de transplantes de medula, em alguns tipos de cânceres)
Variantes polimórficas.
Aplicação:
BANDEAMENTO RON
Permite corar as regiões organizadoras de núcleolos (RONs), que estão localizadas na constrição secundária dos cromossomos humanos como satélites. ( grupo D e E). 
Estas regiões contêm sítios de DNA moderadamente repetitivo, com sequências de genes ribossômicos.
As proteínas existentes nas RONs que estavam em atividade no ciclo celular anterior, tem afinidade por prata. Desta forma um dos protocolos que pode ser usado é submeter as laminas ao tratamento com nitrato de prata. Este método é chamado de Ag-NOR-banding.
Outra maneira de obter essa marcação é submeter o material citológico a duas soluções ácidas (ácido tricloroacético 5% e ácido clorídrico 0,1N) e corar com Giemsa. Desta maneira é possível detectar todas as RONs presentes nos 10 cromossomos acrocêntricos do cariótipo humano, pois o que cora são as proteínas nucleolares.
BANDEAMENTO T
As bandas T apresentam um conjunto das bandas R, já que elas são menores que as bandas R, marcando somente as porções cromossômicas terminais ou telômeros.
 
Os cromossomos são submetidos a desnaturação por uma solução de hidróxido de bário antes de serem corados pelo Giemsa.
Promove a formação de um padrão de Bandas T nas regiões teloméricas.
Muito utilizado na avaliação da evolução cariotípica. 
BANDEAMENTO Cd
Esta técnica produz dois pontos em cada centrômero correspondente a cada uma das cromátides, supostamente na região dos cinetócoros.
Assim:
O material citológico é mergulhado em uma solução salina básica (BSS) de Earleaquecida a 85°C e corado com Giemsa.
A banda Cd é observada somente nos centrômeros ativos ou funcionais ao contrário das bandas C, que marcam tanto regiões ativas como inativas.
COLORAÇÃO COM FLUOROCROMOS
Esta técnica utiliza-se de corantes fluorescentes que possuem afinidades por regiões do DNA ricas em bases AT ou GC, produzindo um padrão fluorescente característico.
Dependendo de sua afinidade os fluorocromos apresentam um padrão característico a bandas Q ou bandas R.
Estes métodos utilizam dois produtos químicos diferentes ou dupla coloração, são chamados contra-coloração (Counterstaining techniques).
Neste sentido o fluorocromo cuja fluorescência é observada n sentido de examinar os cromossomos, é chamado de corante primário, enquanto o outro que se liga ao DNA é denominado contra-corante, sendo fluorescente ou não.
Existem 3 tipos de combinações de corante primário e contra corante, baseado em suas afinidades pelas bases de DNA
Corante primário específico-AT e contra-corante específico-AT
Corante primário específico-AT e contra-corante específico-GC
Corante primário específico-GC e contra-corante específico-AT
Os principais fluorocromos utilizados nestas técnicas são:
1 DAPI-4,6-Diamino-2-Phenole-Indole (afinidade por bases AT)
2 Hoechst 33258 – 2-[hidroxyphenyl]-5-[4-methyl-1-piperazinyl]-2,5 bi-1 H-benzimidazole (afinidade por bases AT)
3 Quinacrina (bases GC)
4 CMA3 – Cromomicina A3 (bases GC)
5 Olivomicina (bases GC)
Principais combinações:
1 DAPI/DA (Distamicina A; bases AT)
2 DAPI/MG (Methyl –Green; bases AT)
3 Hoechst 33258/DA
4 Hoechst 33258/AMD ( Actinomicina D; bases GC)
5 Quinacrina/AMD
6 CMA3/MG
7 CMA3/DAPI/DA
8 Olivomicina/DA 
Bandeamento com endonucleases de restrição (ERs)/Giemsa
Nesta técnica faz se a digestão do cromossomo com diversas ERs e posterior colocaração com Giemsa.
O tratamento dos cromossomos com ERs produz um padrão característico de extração.
O padrão produzido por cada enzima é característico e reproduzível, fazendo com que ela possa ser usada em estudos clínicos e ainda aumentando o conhecimento sobre a natureza e as características das porções da heterocromáticas do gene humano.