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Microbiologia Clínica Conceitos Gerais Prof. Me. Ana Cláudia Alves de Oliveira Santos Especialização em Microbiologia Aplicada ao Laboratório Clínico Rotinas Laboratoriais Prof. Me. Ana Cláudia Alves de Oliveira Santos O que é possível fazer no laboratório de Microbiologia Clínica? Rotinas Laboratoriais • Pesquisar e identificar, direta ou indiretamente, os • microrganismos relevantes e potencialmente infectantes. • Através do estudo suas características morfológicas, • bioquímicas e o controle do crescimento bacteriano. Para isso.... • Técnicas de microscopia. • Coloração de Gram. • Cultura de bactérias aeróbias e anaeróbias. • Avaliar as características do metabolismo. bacteriano. • Identificação. A Rotina do laboratório de Microbiologia ✓Urocultura ✓Hemocultura ✓Cultura de líquidos cavitários ✓Cultura de secreções e cateter ✓Cultura de fungos ✓Cultura para micobactérias ✓Antibiograma ✓Controle interno de Qualidade ✓Ensaio de proficiência A rotina • Envolve exposição tanto com material clínico e reagentes químicos como com potenciais agentes patogênicos. • Para evitar contaminação e riscos a saúde a conduta do profissional é fundamental no laboratório. Obrigatório! • Biossegurança • Boas Práticas Laboratoriais • Organização • Atenção e Cautela Boas práticas • Uso do jaleco e EPIs • Cabelos presos • Evitar relógio, colares, brincos longos.... • Vestimenta adequada • Não comer ou beber • Não pipetar com a boca • Evitar colocar as mãos na boca • Proibido re -encapar e entortar agulhas após o uso. • Descartar em recipiente apropriado • Lavar as mãos antes e depois das aulas práticas Urocultura Umas Rotinas mais Frequentes • A urocultura, também chamada de cultura de urina ou urinocultura, serve para diagnosticar a infecção no trato urinário (ITU); • Detecção do agente etiológico envolvido e o número de colônias existentes. • Material biológico é a urina de preferencia a primeira urina da manhã, no entanto, o exame pode ser feito durante o dia. Meios de cultura Utilizados Ágar Mac Conkey Ágar CLED CHROMagar Principais Agentes Etiológicos Isolados • Os principais agentes das ITU são geralmente limitados aos componentes da própria microbiota intestinal do paciente. • Entre os bacilos Gram-negativos, a maioria é causada por Escherichia coli e, em menor frequência, por Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp e Pseudomonas aeruginosa. • Entre os micro-organismos Gram-positivos, destacam-se, em relação à frequência, Enterococcus spp e Staphylococcus saprophyticus. Hemocultura Infecção na Corrente sanguínea • Hemoculturas são usadas para detectar a presença de bactérias ou fungos no sangue. • Identificar os microrganismos presentes e orientar o tratamento. • Em geral, são pedidas duas ou mais hemoculturas e colhidas como amostras consecutivas. Meios de cultura Utilizados Os frascos específicos para hemocultura contêm o anticoagulante polianetolsulfonato sódico (SPS) em concentrações que variam de 0,025 a 0,05%. • Os microrganismos identificados mais frequentes foram: • Staphylococcus epidermidis(20,6%). • Staphylococcus aureus (12,6%). • Acinetobacter baumannii (8,6%). • Staphylococcus haemolyticus (8,3%). • Staphylococcus hominis (8%). • Pseudomonas aeruginosa (6%). Cultura de Líquidos Cavitários • Existem no humano vários líquidos em determinadas cavidades, que são normalmente estéreis, mas que podem ser invadidos e infectados por bactérias, fungos, vírus e parasitas. • Por serem normalmente estéreis, o achado de qualquer quantidade de micro- organismos nesses líquidos é importante para configurar um processo infeccioso Cultura de Líquidos Cavitários Tipos de Líquidos Cavitários • Líquido pleural. • Líquido Peritoneal. • Líquido Pericárdico. • Líquido Sinovial. • Líquido Cefalorraquidiano. Principais Agentes Etiológicos Isolados Líquido pleural: Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Entorobacteriaceae e anaeróbios estritos. Líquido Peritoneal: Pneumococos e Streptococos, Klebsiella, Staphylococcus aureus. Líquido Pericárdico: Estreptococos, Estafilococos, Pneumococos, Meningococos e Haemophillus. • Líquido Sinovial: Staphylococcus aureus é a causa mais frequente de artrite infecciosa em adultos. • Líquido Cefalorraquidiano (LCR) Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli . Principais Agentes Etiológicos Isolados https://www.msdmanuals.com/pt-pt/profissional/doen%C3%A7as-infecciosas/cocos-gram-positivos/infec%C3%A7%C3%B5es-estafiloc%C3%B3cicas Cultura de secreções e cateter • Fungos e bactérias que compõem o meio ambiente ou a microbiota normal podem causar doenças em indivíduos severamente comprometidos. • A utilização de cateter venoso central é um fator de risco importante para infecções da corrente sanguínea, cujos agentes mais prevalentes são os que compõem a microbiota da pele. Cultura de secreções e cateter Cultura de secreções • Trato Respiratório: ✓Secreção de orofaringe ✓Secreção de nasofaringe ✓Secreção nasal ✓Escarro ✓Aspirado traqueal ✓Amostras broncoalveolares ✓Feridas e abscessos Cultura de secreções • Trato Genital: ✓Secreção vaginal. ✓Secreção uretral. ✓Secreção prostática. Infecção relacionada ao cateter • A implantação do cateter há o rompimento da barreira do tecido cutâneo, colocando o paciente em risco de desenvolver infecções relacionadas a esse tecido. • O local da inserção do cateter torna-se colonizado com baterias da pele do paciente, principalmente estafilococos ou com as carreadas pelos profissionais de saúde. ✓Staphylococcus aureus. ✓ Staphylococcus coagulaase Negativa. ✓Enterobacter sp. ✓Pseudomonas aeruginosa. Principais Agentes Etiológicos Isolados de Cateter Meios de cultura Utilizados Ágar Mac Conkey Ágar Manitol Salgado Ágar Sangue Cultura de Fungos Cultura de Fungos • O principal objetivo do laboratório de micologia clínica é o isolamento e a correta identificação dos fungos patogênicos. • A coleta adequada, o transporte, o processamento e o cultivo das amostras clínicas são etapas essenciais para que esse objetivo seja alcançado. • Os profissionais do laboratório clínico devem ter conhecimento sobre os critérios de obtenção da amostra a fim de obterem os melhores resultados que correlacionem com a suspeita clínica Tipos de Amostras Micológicas Considerações sobre Biossegurança • Toda amostra processada em micologia deve ser considerada potencialmente patogênica, devendo ser manipulada em uma cabine de segurança biológica. • Para fungos filamentosos observados em crescimentos bacteriológicos usuais, as placas devem ser seladas com película Parafilm M® para prevenir a contaminação acidental com esporos potencialmente infectantes. Processamento das Amostras para Exame Microscópico Direto • Uma amostra encaminhada para o cultivo em micologia pode ser examinada em microscopia direta quanto à presença de estruturas fúngicas, sendo uma análise complementar, e nunca substitutiva à cultura. • O exame direto é uma análise primária da amostra, que pode fornecer ao médico-assistente informações preliminares que contribuem para o início do tratamento, podendo ajudar na determinação do significado do micro-organismo que virá a ser isolado na cultura. • Os métodos de exame microscópico direto de amostras em micologia são: • Preparo e clarificação em KOH. • Pesquisa direta para Cryptococcus. • Colorações. Processamento das Amostras para Exame Microscópico Direto Cultivo dos Fungos • As amostras para cultivos em micologia devem ser inoculadas em meios combinados que garantam o crescimento de todos os agentes de significado clínico. • Em todos os casos, alguns fatores devem ser considerados e uma complementariedade entre os meios deve ser garantido • Adição de cloranfenicol e/ou gentamicina na formulaçãodos meios de cultura para inibir a contaminação bacteriana. • Incorporar a ciclo-hexamida ao meio de cultura para inibir o crescimento de fungos saprófitas de crescimento rápido que possam atrapalhar o surgimento de patógenos importantes e de crescimento mais lento. • Deve ser ressaltado que a ciclo-hexamida inibe o crescimento de fungos patogênicos importantes. Cultivo dos Fungos Meios de Cultura Ágar Sabouraud Dextrose Ágar Batata Ágar Mycosel Isolamento Fúngico • Cryptococcus neoformans/gattii. • Penicillium marneffei. • Aspergillus fumigatus. • Scedosporium prolificans. • Algumas espécies de Candida e zigomicetos. ciclo-hexamida inibe o crescimento de fungos patogênicos Cultura de Micobactérias Cultura para Micobactérias • Tuberculose (TB) é, ainda nos dias de hoje, uma doença devastadora e um grande desafio de saúde pública, pois é a segunda principal causa de morte a partir de um único agente infeccioso, ficando atrás apenas do vírus da imunodeficiência humana (HIV). • A TB é causada pelos membros do complexo ✓Mycobacterium tuberculosis (CMTB). ✓M. africanum. ✓M. bovis ✓M. bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG). ✓M. microti. ✓M. canettii. ✓M. pinnipedii. ✓M. mungi. Agentes Etiológicos da Tuberculose • O principal agente da TB humana é o M. tuberculosis, enquanto M. africanum é mais encontrado na África. • M. bovis causa doença em bovinos e em vários outros mamíferos, além de atingir também o homem. • M. microti é patogênica para roedores, M. caprae, para caprinos e a M. pinnipedii causa infecção em leões marinhos. Agentes Etiológicos da Tuberculose • As micobactérias não tuberculose (MNT) são comumente encontradas no meio ambiente e possuem patogenicidade variável conforme a espécie. • As espécies potencialmente patogênicas podem causar uma variedade de doenças em humanos, que diferem em gravidade e importância em saúde pública. Agentes Etiológicos da Tuberculose •Aspectos clínicos (sinais e sintomas) •Raio X •Baciloscopia (Ziehl-Neelsen) •Cultura- Lowenstein-Jensen, Middlebrook •PPD Diagnóstico http://www.google.com.br/url?sa=i&rct=j&q=Cultura-+Lowenstein-Jensen,&source=images&cd=&cad=rja&docid=JT8Ms1ojqVvb9M&tbnid=GGhitV8IO74faM:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Fwww.scientia.blog.br%2Fwordpress%2F%3Fp%3D2505&ei=O01LUbvdCcTOrQGk6YC4CA&bvm=bv.44158598,d.dmQ&psig=AFQjCNGzoYFJV7Cizl_yI6P85SkzsWpf2w&ust=1363975860310717 Diagnóstico Laboratorial De acordo com a suspeita clínica (escarro) • Coloração: Ziehl Neelsen (visualização de BAAR) Observar ~ 300 campos (objetiva de 100 X) Sensibilidade da técnica de esfregaço: 104 céls/mL ➢Negativo, ausência de BAAR no esfregaço ➢+ <1 bacilo por campo em 100 campos ➢++ 1 – 10 bacilos por campo em 50 campos ➢+++ > 10 bacilos por campo em 20 campos • Falso positivos: Nocardia, Legionella e Rhodococcus Diagnóstico Laboratorial INVESTIGAÇÃO DE TUBERCULOSE EM CASOS NOVOS (NUNCA ANTES TRATADOS) COM TRM -TB Diagnóstico Laboratorial INVESTIGAÇÃO DE TUBERCULOSE EM CASOS NOVOS (NUNCA ANTES TRATADOS) EM POPULAÇÕES MAIS VULNERÁVEIS, COM TRM -TB Diagnóstico Laboratorial INVESTIGAÇÃO DE TUBERCULOSE EM CASOS DE RETRATAMENTOS (RECIDIVA OU RETORNO APÓS ABANDONO) COM TRM-TB Antibiograma Introdução • Técnica destinada à determinação da sensibilidade bacteriana in vitro frente a agentes antimicrobianos, também conhecido por Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos (TSA). • Utilizado para microrganismos cuja sensibilidade às drogas normalmente não seja previsível. • Realizado em um isolado bacteriano de cultura recente. • Não se trata de uma tarefa fácil, por suas limitações. • Descoberta de novos mecanismos de resistência. Introdução • Existem vários comitês que trabalham na padronização dos testes de sensibilidade: ✓Clinical laboratory Standards Institute (CLSI); ✓ European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST); ✓Brazilian Comittee on Antimicrobial Susceptibility Testing (BrCAST). Introdução • Para cada método são preconizados aspectos que dizem respeito ao: ✓ inoculo, ✓meio de cultura, ✓temperatura, ✓tempo e atmosfera de incubação, ✓bem como cepas-padrão utilizadas no controle de qualidade do teste. Introdução • Em cada combinação micro-organismo e droga são também estabelecidos os critérios interpretativos de acordo com o seguinte: ✓ Sensível: o isolado é inibido quando doses usuais dos antimicrobianos são utilizadas; ✓ Intermediário: inclui isolados cuja CIM possa ser atingida por níveis de antimicrobianos no sangue e nos tecidos, mas a taxa de resposta possa ser menor que para aqueles classificados como sensíveis. A categoria intermediária implica eficácia clínica em sítios aonde fisiologicamente as drogas são mais concentradas como por exemplo, as quinolonas e beta-lactâmicos na urina, ou quando doses maiores possam ser utilizadas (beta-lactâmicos); introdução ✓Sensível dose dependente (SDD): Implica que a susceptibilidade do isolado é dependente do regime terapêutico utilizado. Estas doses são superiores àquelas referendadas para classificação da categoria sensível; ✓Resistente: refere-se a isolados que não são inibidos por concentrações de antimicrobianos utilizados em doses habituais ou que os limites indicam a presença de um mecanismo de resistência como, por exemplo, a produção de beta-lactamases. Métodos de desenvolvimento • Kirby-Bauer: Difusão com disco (disco-difusão); • Diluição em caldo (macro ou micro); • • Etest®; • Automação. Kirby-Bauer: Difusão com disco (disco-difusão) • Utilização de discos de papel filtro impregnados com concentração padrão de antibiótico; • Os discos são colocados na superfície do ágar Mueller- Hinton semeado com uma suspensão padronizada da bactéria a ser testada; • O método informa se a bactéria é resistente, sensível ou se possui sensibilidade intermediária à determinado antibiótico pela medição do halo de inibição. Disco difusão Técnica • Teste indireto: realizado com cultura pura de 24 horas de crescimento de bactérias devendo ser feito Gram antes do antibiograma; • Teste direto: utilização do material pesquisado (urina, sangue, pus, etc). A desvantagem da utilização direta destes materiais dá- se pela dificuldade de controle da quantidade de inócuo e o isolamento da bactéria. Técnica • Com a alça de semeadura, transferir 3 a 4 colônias (teste indireto) com a mesma morfologia e inocular em 2,0 a 3,0 mL de solução fisiológica estéril, caldo MH ou caldo TSB; • Esperar 15 minutos observando a turbidez da solução; • Utilizar como referência de turbidez o tubo 0,5 da escala de McFarland. Escala de McFarland • Padrão de turvação utilizado para determinar a intensidade de multiplicação bacteriana em meios de culturas líquidos; • O grau de turvação indica a [ ] das bactérias; • O método consiste em uma escala de onze tubos 0,5 a 10 com diferentes quantidades de cloreto de bário e ácido sulfúrico para se obter diferentes concentrações de sulfato de bário. Técnica • Com um swab estéril, semear a solução no Agar Mueller-Hinton; • Aguardar 5 minutos à temperatura ambiente para que o inócuo seja completamente absorvido pelo ágar; • Colocar o disco com o auxílio de uma pinça previamente flambada; ✓Os discos devem ter uma distância de 2,5cm. ✓Máximo de 12 discos em placas de 15 cm e 5 discos em placas de 9 cm. Técnica • Após 15 minutos da colocação dos discos, as placas são invertidas e incubadas; • Incubar de 18 a 24 horas à 35 +/- 1º C; • Medir o diâmetro dos halos; • Classificá-los quanto a resistência, sensibilidade intermediária e sensibilidade. Resultado Resultado Controle de Qualidade Interno Controle de Qualidade Interno • O laboratório de microbiologia clínica deve assegurar a qualidade de todos os insumos e equipamentos utilizados no processamento de amostras clínicas, visando a obter o melhor e o mais rápido resultado a ser enviado ao clínico para quetome decisões acertadas sobre o diagnóstico e tratamento de seus pacientes. Procedimento Operacional Padrão (POP) • A base do controle de qualidade é a produção de manuais de procedimentos, como o POP. • Neles são detalhados desde procedimentos de coleta, de transporte de amostras, de critérios de rejeição e dos processos desde a semeadura até o laudo final. • Nos POP, devem ser ainda incluídos o preparo de meios de cultura feitos no laboratório, como manusear kits comerciais e reagentes ou suplementos. • Todas as planilhas de controle de qualidade devem ser preenchidas por todos os funcionários treinados e, a partir dessa etapa, um funcionário designado deve relatar os resultados anormais e as medidas de correção para o supervisor imediato. • Todas essas planilhas devem ser arquivadas por 2 anos. Procedimento Operacional Padrão (POP) • Todos os POP devem ser revisados anualmente, com aprovação de alterações em vários níveis de competência dentro do laboratório e, a seguir, devem se tornar disponíveis nas áreas de trabalho. Procedimento Operacional Padrão (POP) Insumos • O controle de qualidade interno se propõe a avaliar os insumos utilizados no laboratório diariamente, liberando-os para o uso na rotina. Meios de Cultura • O controle de qualidade deve analisar as características dos meios de cultura empregados na rotina. • Se forem fabricados no próprio laboratório, devem ser observados esterilidade, pH e performance, de acordo com cada lote preparado. Deve constar na placa um rótulo contendo nome do meio, lote, dia de fabricação e data de vencimento. Cepas Padrão • Tanto para insumos como para meios de cultura, devem ser utilizadas cepas controle ATCC obtidas de fontes confiáveis e rastreáveis. Exemplos de um mínimode cepas a serem adquiridas pelo laboratório são: • Escherichia coli ATCC 25922; Staphylococcus aureus ATCC 25923; • Staphylococcus epidermidis ATCC 12228; • Streptococcus pyogenes ATCC 19315; • Klebsiella pneumoniae ATCC 13883; • Enterococcus faecalis ATCC 29212 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Cultivo de Cepas Padrão Ensaio de Proficiência O que é??? • O ensaio de proficiência é uma das ferramentas que compõem a garantia da qualidade, ao lado de controle interno, controle de processos e outras medidas de gestão. • Essas ferramentas juntas promovem a monitoração integrada dos processos e um ambiente de melhoria contínua. Rotina Microbiológica • Que também servem para controle de qualidade do antibiograma. Todas as cepas devem ser armazenadas em freezer a -80°C, se possível, e usadas no máximo até a 5ª passagem. Objetivos • O ensaio de proficiência tem como propósito principal identificar desvios sistematizados do processo e desvios que não são percebidos facilmente por outras ferramentas de controle. • • Na prática, age como um controle final que ajuda a monitorar múltiplas etapas do processo, podendo, algumas vezes, identificar necessidades de melhorias nas demais ferramentas de controle e de gestão. Benefícios do Ensaio de Proficiência Cocos Gram positivos de Interesse Médico Anteriormente Staphylococcus Características Microbiológicas ✓Gênero: composto por 37 espécies Resistência a uma ampla gama de condições ambientais: • Crescimento em pH mínimo de 4.2, máximo de 9.3 (ótimo de 7,0-7,5)/ temperatura mínima de 6 e máxima de 48ºC ( ótima de 37ºC). • Toleram ainda altas concentrações de cloreto de sódio até 25% (ótimo de 7-10%) • Anaeróbios facultativos • Não fastidiosos, não móveis e não esporulados • Agrupam- se em cachos (o mero agrupamento das células em cachos não serve como critério de identificação de gênero) Produção • Isolados da família Micrococcaceae também são catalase positivas, mas não são usualmente isolados de amostras humanas. 0,04U Staphylococcus Coagulase + Coagulase - S. aureus S. saprophyticus S. epidermides Cerca de 90% da microbiota normal Patogênica apenas quando a barreira da pele é rompida ou invadida Patogênica, causadora de infecções comunitárias e hospitalares Coagulase Positiva • O Staphylococcus aureus está presente no nariz de cerca de 30% dos adultos saudáveis e na pele de cerca de 20%. Os percentuais são maiores em pessoas que são pacientes ou trabalham em um hospital. • As bactérias podem ser transmitidas de pessoa a pessoa pelo contato direto ou através de objetos contaminados (como equipamentos de ginástica, telefones, maçanetas de porta, controles remotos de televisão ou botões de elevador) ou, pela inalação de gotículas infectadas dispersas por espirro ou tosse. • Sítios de colonização não nasal: faringe, a vagina, axilas e alguns sítios de pele queratinizada, especialmente o períneo e com maior prevalência a mão Transporte Parede resistente a lisozima 1) Escape da fagocitose 2) Aderência às células do hospedeiro 3) Produção de toxinas e enzimas líticas Principal reservatório > Mucosa nasal ~40% da população adulta > assintomática • Animais também podem ser colonizados por S. aureus. • A transmissão de S. aureus entre esses animais e humanos ocorre em ambas as direções. • A dinâmica dessa transmissão ainda não está bem estabelecida. Staphylococcus aureus – fatores de virulência Garantem a estabilização da infecção e a sobrevivência dos Staphylococcus no tecido e a sua disseminação para outros locais no organismo. Patogênese Quando a relação com o hospedeiro não é comensal, S. aureus pode agir como o agente etiológico de diferentes síndromes Infecções superficiais Síndromes toxigênicas Infecções profundas Infecções superficiais • Consiste principalmente em infecções supurativas (que resultam na formação de pus) em tecidos moles superficiais. • Nesse tipo de infecção, o inóculo vem do meio externo e leva ao crescimento bacteriano localizado em sítios como feridas cirúrgicas, lesões decorrentes de queimaduras e outras infecções da derme e tecido subcutâneo. FOLICULITE: infeção dos folículos Hordeólo: folículo dos cílios CARBÚNCULO: tecidos vizinhos invadidos pelo furúnculo FURÚNCULO: infecção mais séria dos foliculos É um tipo de abcesso Impetigo • Principal agente etiológico: Staphylococcus aureus • Infecção Infecções superficiais da derme não necessariamente envolvendo o folículo piloso • Altamente contagiosa, que afeta principalmente crianças. • Sua transmissão e disseminação acontece por contato direto. • Pode ocorrer sobre outras doenças prévias da pele, como a dermatite atópica, que sofrem a contaminação secundária pela bactéria. Impetigo bolhoso e não bolhoso Cepa produtora de toxina esfoliativa Impetigo não bolhoso • Forma clínica mais comum • Normalmente a bactéria invade a pele através de pequenas rupturas ou ferimentos. • As lesões geralmente são indolores, se rompem e formam crostas de coloração clara. • Prurido ocasional e sem repercussão sistémica. • Cura sem sequelas • Cepa infectante não produtora de toxina esfoliativa Impetigo bolhoso • Causado por uma toxina estafilocócica (tipoA) > favorece o aparecimento de vesículas maiores, cheias de líquido. • Representa um problema frequente em berçários e hospitais. Celulite • Condição caracterizada por crescimento bacteriano e inflamação difusa, mas localizados, da derme e tecido subcutâneo sem a formação de pus. Síndromes toxigênicas • Categoria de doenças causadas por S. aureus é composta por síndromes associadas à produção de toxinas, muitas vezes com ação sistêmica ou à distância. • Essas síndromes são desencadeadas pela ação de toxinas que agem como superantígenos. Síndrome da Pele Escaldada • Uma forma particularmente grave de impetigo bolhoso • Envolve a produção de toxina esfoliativa (ET) ou Toxina estafilocócica (tipo B) > ligam à zona granulosa da epiderme, causando uma clivagem superficial intraepidérmica. S. aureus - Síndrome da pele escalda Síndrome do choque tóxico • Ação sistêmica provocadapor linhagens produtoras de toxina (TSS-1: superantígeno – ativa grande população de células T: ↑ liberação de citocinas). • Sintomas: febre alta, eritema difuso com descamação da pele - Destrói células endoteliais - hipotensão e morte por falência múltipla de órgãos (5 % dos casos) Toxinfecção Alimentar • A ingestão de toxinas superantigênicas de S. aureus pré- formadas em alimento em decorrência do crescimento bacteriano no alimento resulta no desencadeamento de uma síndrome chamada toxinfecção alimentar estafilocócica. • Essas toxinas superantigênicas são denominadas de enterotoxinas estafilocócicas (SEs) Modo de Transmissão • A manipulação de alimentos por indivíduos portadores de S. aureus produtor de SEs e o subsequente armazenamento desse alimento em temperatura que não impeça o crescimento de S. aureus por tempo suficiente a ponto de a população bacteriana atingir fase estacionária de crescimento é a principal causa de toxinfecção alimentar estafilocócica Infecções profundas Incluem a disseminação das células bacterianas e a sua instalação em sítios distantes do local de entrada. • Endocardite • Osteomielite • Infecção pulmonar • Complicações: choque séptico, Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA) MRSA • Descritos já na década de 60-70, inicialmente eram associados à Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde (IRAAS). • No final dos anos 90, foram associados a infecções comunitárias. • MRSA é um dos maiores problemas no que concernem infecções nosocomiais devido à sua alta prevalência e limitada opção terapêutica. • Infecções adquiridas na comunidade com MRSA têm um curso clínico mais agressivo e envolvem principalmente a pele e os pulmões. • A maior agressividade destas estirpes é devido à produção de várias toxinas , principalmente a leucocidine de Panton-Valentin. • A meticilina não é mais utilizada na clínica como antibiótico, pois apresenta toxicidade ao hospedeiro. Para a terapia antiestafilocócica são utilizados, em seu lugar, os beta-lactâmicos análogos oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucoxacilina e naficilina. • Todavia, o termo MRSA é utilizado para denominar S. aureus com este tipo de resistência aos beta-lactâmicos. • No laboratório clínico, a detecção de MRSA é feita utilizando-se a oxacilina, e no Brasil, MRSA é ora referido como “S. aureus resistente à oxacilina” (ORSA). • MRSA é o termo internacional utilizado na quase totalidade das publicações científicas. Beta-lactâmicos • Classe de antibióticos que inibem a síntese da parede celular de bactérias através do impedimento de enzimas que catalizam a transpeptidação do peptidoglicano. Proteínas ligadoras de penicilina (PBPs – penicillin binding proteins). • Com a estrutura incompleta do peptidoglicano, a parede celular da bactéria é enfraquecida e a célula morre. Classificação - βlactâmicos • Os antibióticos beta- lactâmicos são classificados pela semelhança estrutural adicionados de radicais que fornecem a estabilidade dessa droga • Os mecanismos de ação e de resistência são comuns a todos! Alteração das PBP • Adquirida por plasmídeo ou mutação (S. aureus) Produção enzimática • Produção de β-lactamases Alteração da Permeabilidade • Diminuição da permeabilidade da membrana externa das bactérias Gram - através de mutações e modificações nas porinas, que são proteínas que permitem a entrada de nutrientes e outros elementos para o interior da célula. Aumento da atividade de Bombas de Efluxo • É um mecanismo originado por mutação genética • não é um mecanismo independente, estando sempre associadas a outros mecanismos de resistência. Staphylococcus epidermidis e Outras Espécies de Staphylococcus Coagulase-negativos São bactérias que constituem a microbiota da pele e de membranas mucosas de humanos e de outras espécies animais. Geralmente estabelecem uma relação simbiótica com seus hospedeiros, mas podem desencadear processos infecciosos ao invadir o tecido colonizado. Staphylococcus epidermidis • Espécie do grupo de SCoN encontrada com maior frequência na microbiota epitelial humana. • Diferente de S. aureus, S. epidermidis não possui, até onde se sabe, uma ampla variedade de toxinas. • Considerada por muito tempo uma espécie comensal é agora vista como um importante patógeno oportunista responsável por infecções nosocomiais associadas a dispositivos médicos de longa permanência. A produção de biofilmes - aglomerados multicelulares aderidos a superfícies - é o processo mais importante associado à virulência de S. epidermidis e, também, o mais estudado Proteínas, exopolissacarídeos e até mesmo os ácidos teicóicos parecem estar envolvidos com a formação da matriz extracelular do biofilme Staphylococcus saprophyticus • Staphylococcus saprophyticus, pode ser encontrada no sistema genital de homens e mulheres; • Essa bactéria possui proteínas em sua superfície que permitem que fique aderida mais facilmente às células do trato urinário; • Causando infecção quando há condições que favorecem a sua proliferação. Habilidades Clínicas Habilidades Clínicas • Os Staphylococcus saprophyticus representam a maioria das amostras (93 por cento ) coagulase negativas e novobiocino-resistentes incidentes no aparelho urinário do homem. • É a espécie Gram-positiva mais frequente nas infecções urinárias de mulheres em fase produtiva (15 a 30 anos) podendo ser causa de infecções urinárias altas, com envolvimento renal. Identificação Laboratorial de Staphylococcus sp. Material biológico Bacterioscopia ➢Coloração de Gram ✓Liberação do laudo preliminar ✓Determinação do meio de cultura para cultivo primário ✓Avaliação da qualidade da amostra clínica ✓Exame microscópico negativo não invalida que possam existir Staphylococcus COCOS GRAM+ ➢Cultura microbiológica: ✓Avalia o crescimento e isolamento. Ágar sangue – Meio não seletivo- Enriquecidos - Isolamento de 24 h - Colônias lisas, - Borda contínua - Coloração branco-porcelana ou cinza esverdeado (B-Hemolítico) ❖S. aureus podem ter pigmento amarelo ou amarelo-alaranjado, podendo apresentar hemólise, aparece mais pronunciada após incubação de 72 h em temperatura ambiente. ➢Prova da Catalase (H2O2 - peróxido de hidrogênio) ➢ Não fazer direto do meio sangue (ferritina) e sim de outro meio nutritivo > falso positivo • Objetivo: Diferenciar Staphylococcus spp. e Streptococcus spp • A enzima catalase converte o peróxido de hidrogénio em água e oxigénio (borbulhar positivo);. Staphylococcus Coagulase + Coagulase - S. aureus S. saprophyticus S. epidermides Cocos G+ produtores de catalase Cocos G+ coagulase negativos Prova da Coagulase em tubo 1. Adicionar a um tubo contendo 0,5 mL de plasma de coelho com EDTA uma porção da colônia-teste. 2. Incubar o tubo por 4h e observar a formação de coágulo. 3. Em caso de resultado negativo, reincubar o tubo por mais 18 h e repetir a leitura. + - Ágar Manitol Salgado - Seletivo (alta concentração de Sal) - Diferencial (indicador de ph) . Incubar a 35ºC por 18 - 24 h. Staphylococcus - teste da coagulase Coagulase + = S. aureus Coagulase - = outros Staphylococcus + - Prova da coagulase: Staphylococcus - teste da DNase DNase + = S. aureus DNase - = outros Staphylococcus + Prova da DNase: Prova da DNAse 1. Semear em ágar DNAse a amostra que se quer testar. 2. Incubar a placa a 35 – 37ºC por 18 – 24 h. 3. Após incubação acrescentar HCl 1N ao meio de cultura 4. Positivo quando ocorre transparentização do Agar em volta das colónias, o DNA não hidrolisado aparece mais opaco; . GRAM: Cocos G+, em forma de cachos CATALASE: positiva COAGULASE: positiva DNAse: positiva MANITOL: cresce e fermenta Staphylococcus aureus Streptococcus • Os gêneros Streptococcus e Enterococcus englobam os cocos Gram-positivos, catalase-negativos, de maior importância em medicinahumana. • Muitos são integrantes da microbiota normal do corpo humano, particularmente vias aéreas superiores e trato intestinal. • A maioria necessita de meios enriquecidos, geralmente pela adição de sangue, para o crescimento (Agar sangue). • Anaeróbios facultativos ➢β-hemolíticos: causam a lise total das hemácias ➢α-hemolíticos: causam a lise parcial das hemácias ➢ γ –hemolíticos: não causam lise das hemácias A identificação dos estreptococos é, entretanto, até hoje, relativamente complexa: observação inicial das propriedades hemolíticas das amostras. Classificação em grupos sorológicos: • Baseada nas características antigênicas de um polissacarídeo, de composição variável, chamado carboidrato C, localizado na parede celular, que pode ser detectado por diferentes técnicas imunológicas, destacando-se, entre elas, a precipitação em tubo capilar e a aglutinação pelo látex. Grupos de Lancefield: (A, B, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, O, P, Q, R, S, T, U e V). Streptococcus pyogenes • A espécie Streptococcus pyogenes é a principal representante dos estreptococos β-hemolíticos, e forma cadeias relativamente longas quando cultivada em meio líquido. • Grupo A de Lancefield • As necessidades nutricionais são complexas, mas, de modo geral, crescem bem em meio de ágar sangue e em meios líquidos contendo glicose. Fatores de virulência • Estreptolisinas: • S: >responsável pelo halo de hemólise em torno das colônias > não imunogênica. • O: > imunogênica >contribui para a virulência de S. pela ação lítica em hemácias, leucócitos e possivelmente outras células. • NADase: entram nas células hospedeiras por poros pré- formados (estreptolisina )e induz apoptose • ScpA e SIC: inibem o sistema complemento. • Estreptoquinase: dissolver coágulos, pela transformação do plasminogênio em plasmina • Desoxirribonuclease: degrada o DNA • Hialuronidase: dissolve a substância fundamental • do tecido conjuntivo, o ácido hialurônico Fatores de Virulência Patogênese • A maioria das infecções causadas por S. pyogenes tem início nas vias aéreas superiores (faringe) ou na pele. • Existem cepas “especialistas” em infecções da faringe e cepas “especialistas” em infecções cutâneas, enquanto outras são considerada “generalistas” e causam ambos os tipos de infecção. • Tal tendência é considerada dependente do tipo M apresentado pela amostra São conhecidos mais de 80 tipos M • Nas infecções da faringe, S. pyogenes é, de modo geral, transmitido por meio de aerossóis/gotículas e a primeira etapa da infecção consiste em sua adesão ao epitélio da mucosa. • As infecções cutâneas são geralmente adquiridas por contato com pacientes portadores de piodermites e se instalam quando a pele apresenta lesões provocadas por traumas, picadas de inseto, cirurgias e por outros meios nem sempre evidentes. Faringites • Virais e bacterianas • Entre as bacterianas, em torno de 90% são causadas por S. pyogenes. • A infecção é transmitida por gotículas infectadas provenientes de pacientes com o mesmo tipo de processo. Piodermites • As piodermites são infecções purulentas da pele causadas, na maioria das vezes, por estreptococos e/ou estafilococos. O impetigo e a erisipela constituem as piodermites estreptocócicas mais comuns. • Os estreptococos do grupo A não conseguem sobreviver bem na pele intacta, sendo necessário um mínimo trauma superficial na camada córnea para que haja penetração e proliferação. Fascite necrosante • É uma infecção profunda do tecido conjuntivo subcutâneo, que se caracteriza por destruição dos tecidos muscular e gorduroso e se dissemina ao longo do plano fascial. • Acredita-se que a protease SpeB seja importante neste processo • A fascite é uma doença grave que evolui rapidamente, com elevados índices de mortalidade. Sequelas pós-estreptocócicas Febre reumática • A doença caracteriza-se por lesões inflamatórias não supurativas, envolvendo o coração, as articulações, os tecido celular subcutâneo e o sistema nervoso central. • Os indivíduos que sofrem um episódio de febre reumática são particularmente predispostos a outros episódios, em consequência de infecções estreptocócicas subsequentes das vias aéreas superiores. Glomerulonefrite • A glomerulonefrite pode aparecer depois da faringite e das piodermites. • Como a febre reumática, trata-se também de uma doença de natureza imunológica. Diagnóstico e Tipagem • Isolamento de S. pyogenes é facilmente obtido em placas contendo meio de ágar sangue, onde a bactéria forma colônias β-hemolíticas • A maneira mais segura e prática para identificar S. pyogenes é verificar se a amostra isolada possui o antígeno do grupo A. • S. pyogenes pode ser presuntivamente identificado por ser sensível à bacitracina e hidrolisar o substrato pirrolidonil-ß-naftilamida (teste do PYR). • O diagnóstico também pode ser feito de forma indireta. Pacientes infectados por S. pyogenes produzem anticorpos contra a estreptolisina O, hialuronidase e desoxirribonuclease. • A pesquisa de anticorpos contra estreptolisina O é positiva em 85% dos pacientes, ao passo que a pesquisa de anticorpos para hialuronidase e desoxirribunoclease é positiva em 95%, e a pesquisa para os três anticorpos é positiva em praticamente todos os pacientes. • Entretanto, em virtude do aparecimento tardio dos anticorpos, o estudo da resposta sorológica está primariamente indicado quando do diagnóstico da febre reumática e glomerulonefrite. Tratamento - β-lactâmicos • Nesta categoria, estão incluídas as penicilinas, as cefalosporinas, os monobactâmicos e as carbapenemas. Todos estes possuem em comum o anel β-lactâmico. • Antibiótico de escolha: Penicilina G Penicilinas naturais: extraídas de culturas do bolor Penicillium Penicilinas semi-sintéticas: parte da penicilina é produzida pelo bolor e parte é adicionada sinteticamente. Streptococcus agalactiae • “estreptococos do grupo B” • Em 1930 foi descrito sua presença em secreções vaginais de pacientes assintomáticas. • Em 1970 foi confirmada sua atuação como patógeno em seres humanos (associação com sepse e pneumonia puerperal e neonatal) • A partir de então, este agente emergiu como causa frequente de bacteremias, pneumonias e meningites em crianças com idade inferior a 3 meses de idade, assim como de infecções em adultos, homens ou mulheres (gestantes ou não). • A gravidade do problema estimulou a implantação de medidas profiláticas, tais como o uso de antibióticos durante o parto. Os recém-nascidos podem ser infectados de três maneiras: • Antes do nascimento, as bactérias da vagina se espalham para o canal do parto dentro do útero e infectam o líquido amniótico que envolve o bebê. O bebê é infectado pela ingestão do fluido infectado. • Durante o parto, pelo contato com as bactérias no canal do parto. • Após o nascimento, através do contato próximo com a mãe. • A ruptura prematura das membranas placentárias também favorece a colonização fetal. No entanto, há evidências de que S. agalactiae pode penetrar na cavidade amniótica através da placenta íntegra e causar infecções fulminantes no feto ainda dentro do útero Fatores de virulência Fatores de virulência • Hemolisina: forma poros nas membranas celulares de diferentes células • FbsA, FbsB e e CspA: permitem a ligação à queratina humana, presente em tecidos epiteliais do pulmão, da pele e da vagina. • GAPDH: ao serem expostas ao meio extracelular passam a auxiliar na adesão do micro-organismo. • A aspiração da secreção vaginal pelo recém--nascido pode levar a bactéria até os alvéolo pulmonares, onde ela proliferará abundantemente se não for eliminada rapidamente pelos macrófagos pulmonares. Manifestações clínicas • Em recém-nascidos dois tipos de síndromes clínicas são descritos em neonatos: a síndrome precoce (7 a 90 dias após o nascimento) que incluem a pneumonia, artrite séptica, sepse emeningite e a síndrome tardia que incluem bacteremia associada à meningite. • Em parturientes, os estreptococos do grupo B estão associados a doenças que variam desde a infecção urinária branda até quadros de sepse grave, tromboflebite séptica, meningite, osteomielite, e endocardite. Em homens e em mulheres não parturientes • O trato gastrointestinal é um reservatório importante para os estreptococos do grupo B em indivíduos adultos, e o trato genital masculino é também considerado como uma importante fonte de pielonefrite e prostatite Diagnóstico • Os espécimes clínicos mais indicados para a pesquisa de portadores são aqueles colhidos da vagina, cérvice uterina e região anorretal. • Em recém-nascidos, o material deve ser coletado logo após o nascimento, a partir do cordão umbilical, canal auditivo externo, garganta e reto. • Nas crianças com sintomatologia, deve ser coletado sangue, liquor e urina. • A identificação presuntiva de S. agalactiae é geralmente feita pelo teste de CAMP • Detecta uma Substância (fator CAMP) produzida por Streptococcus do grupo B, a qual potencializa a ação hemolítica da β-lisina de Staphylococcus aureus, tendo como efeito a formação de uma área de hemólise sinérgica, • Para a identificação definitiva recorre-se à pesquisa do antígeno do grupo B, através de métodos sorológicos ou de genes espécie-específicos por PCR . Tratamento • O antibiótico de escolha continua sendo a penicilina, em doses 10 vezes superiores às usadas, por exemplo, para o tratamento das infecções causadas por S. pyogenes. • Outra alternativa recomendada é a associação de penicilina com aminoglicosídeo Aminoglicosídeos • Antibióticos aminoglicosídicos, como a estreptomicina e a gentamicina, interferem nas etapas iniciais da síntese proteica pela alteração conformacional da porção 30S do ribossomo 70S procariótico Streptococcus pneumoniae • Frequentemente referido como pneumococo • Cadeias curtas • Em ágar sangue, as colônias são alfa-hemolíticas e imprimem cor esverdeada ao meio Embora seja encontrado, com frequência, no trato respiratório superior de indivíduos assintomáticos, S. pneumoniae é um dos principais patógenos humanos, responsável, em particular, por infecções graves em crianças e indivíduos idosos. Fatores de virulência • Autolisina: degradação da parede celular • Pneumolisina: Inflamação • Hialuronidade: cliva o ácido hialurônico, tornando o tecido conjuntivo mais frouxo, o que facilita a invasão bacteriana • Neuraminidase: clivam as moléculas de ácido siálico reduzindo a viscosidade do muco e aumentam a capacidade de aderência, alterando a superfície das células epiteliais do hospedeiro • CbpA e PsaA : considerada uma das principais adesinas de pneumococos. Fatores de virulência Pneumonia • É uma infecção aguda, normalmente precedida por um estado gripal, que afeta os lóbulos inferiores dos pulmões. • Ocorre quando a bactéria sobrevive à fagocitose pelos macrófagos pulmonares e proliferam nos alvéolos, onde sofrem autólise promovendo a liberação de substâncias que provocam inflamação. Meningite • S. pneumoniae é um dos agentes mais comuns de meningite bacteriana, tanto em crianças como em adultos, com predominância em pacientes com idade abaixo dos 5 anos. • Pode resultar de bacteremias primárias, mas muitas vezes se instala em associação a otites, sinusites e pneumonias. Bacteremia • A bacteremia é a apresentação clínica invasiva mais comum da infecção pneumocócica entre crianças de até 2 anos de idade. • Ocorre em aproximadamente 25% dos casos de pneumonia e em cerca de 80% dos casos de meningite pneumocócica. Otite e sinusite • S. pneumoniae é uma das principais causas de otites e sinusites. • Frequentemente, estes processos são complicações de infecções virais do trato respiratório, que provocam obstrução dos seios paranasais e da trompa de Eustáquio. Diagnóstico • A abordagem clássica é a cultura em meios ricos, tais como ágar sangue e ágar chocolate. • No ágar sangue, os pneumococos formam colônias circundadas por halos de α-hemólise, que podem ser facilmente identificadas através de testes simples, tais como o de suscetibilidade à optoquina e o de bile- solubilidade. • Em casos de meningite, a cultura deve ser sempre precedida do exame microscópico de esfregaços corados pelo Gram, pois a presença de diplococos Gram positivos no material é altamente sugestiva de meningite pneumocócica Enterococcus Enterococcus Prof. Me. Lucas Lima • Cocos Gram +: em geral isolados , aos pares ou em cadeias curtas • Anaeróbicos facultativos Negativos no teste da catalase: algumas amostras podem produzir uma pseudocatalase, determinando um teste fracamente positivo. • Crescem bem em meio de ágar sangue, preparado com sangue de carneiro, apresentando colônias alfa ou não hemolíticas. • Características peculiares desses micro-organismos incluem a capacidade de crescer em condições variadas de temperatura (de 10ºC a 45ºC) e de pH (de 4,0 a 9,6), bem como na presença de concentrações elevadas de cloreto de sódio (NaCl a 6,5%) e de sais biliares. • A maioria dos integrantes deste gênero produz as enzimas pirrolidonil arilamidase e leucina aminopeptidase, que hidrolisam os substratos L- pirrolidonil-β-naftilamida (PYR) e L-leucina- β-naftilamida (LAP), respectivamente, constituindo testes-chave na caracterização de Enterococcus • A maioria apresenta o antígeno do grupo D de Lancefield • Amplamente distribuídos na natureza e fazem parte da microbiota residente (intestino) do homem e de animais. • São transmitidos de um paciente a outro através das mãos de profissionais de saúde, alguns dos quais podem albergar enterococos no tratogastrintestinal, mas podem ser transmitidos também por artigos médico-hospitalares. • Nos seres humanos, Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium são as espécies identificadas com maior frequência, tanto colonizando diversos sítios anatômicos, quanto participando em diferentes quadros infecciosos. Fatores de virulência • Expressão de uma variedade de mecanismos de resistência aos antimicrobianos: (determinados por genes localizados no cromossomo), quanto adquiridos (decorrentes de mutações ou genes extra -cromossômicos). • Os principais determinantes de virulência associados à patogênese de E. faecalis, destacam-se como fatores secretados: a citolisina e a gelatinase • Citolisina: Toxina hemolítica • Gelatinase: hidrolisa gelatina, colágeno, elastina, caseína, hemoglobina, glucagon, neurotensinas >>> Participa na degradação dos tecidos do hospedeiro e modulação da resposta imune. Adesinas • Proteína Esp > liga a célula do hospedeiro • Proteínas que ligam colágeno • Um dos fatores mais estudados • Envolvidos na aderência de enterococos às células do hospedeiro. • Expressão é induzida por feromônio. • Encontra-se inserida na parede celular : responsável pelo contato bactéria-bactéria, promovendo a formação de agregados celulares, que precedem a transferência genética de plasmídios em eventos de conjugação. Substância Agregativa Infecções • Infecções do trato urinário, • bacteremias, • endocardites, • infecções intra-abdominais do trato biliar e de feridas, incluindo úlceras de decúbito e úlceras do pé diabético. • A origem das amostras de enterococos que causam infecções do trato urinário é, predominantemente, a microbiota gastrintestinal do próprio paciente Tratamento e controle • Terapia antimicrobiana é difícil. Antimicrobianos de nova geração estão sendo utilizados (linezolida,fluoroquinolona); • Práticas apropriadas de controle de infecções (uso de jaleco e luvas,isolamento de pacientes infectados – quando resistentes aos glicopepetídeos). Diagnóstico Identificação de Cocos Gram Positivos Catalase Negativa Estreptococos α-hemólise β-hemólise γ-hemólise Optoquina R S S. Grupo viridans S. pneumoniae ‘’Camp test’’(-) (+) Outros β hemolíticos S. agalactiae Bile esculina (+) Bile esculina (-) Enterococcus spp Outros estreptococos PYR (+) S. pyogenes