Tarefa 4 Microbiologia Clínica

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Disciplina: Microbiologia Clínica
Identificação da tarefa: Tarefa 4 - Envio de arquivo.
Pontuação: 15 pontos 
TAREFA 4
Olá!
Leia com atenção as propostas de atividade listadas a seguir e responda-as de forma detalhada. Cada um dos cinco estudos (1A, 1B, 2A, 2B e 3A) vale 3 pontos.
1. Estudos sobre Staphylococcus.		
Estudo 1A. Um adolescente com gripe confirmada foi hospitalizado ao apresentar estresse respiratório. Ele apresentou ainda febre, erupção cutânea e pressão arterial baixa. Staphylococcus aureus foi isolado de suas secreções respiratórias. 
a) Qual a melhor forma de coletar o material para análise neste caso?
R: aspirado transtraqueal, lavado brônquico podem fornecer resultados mais confiáveis, ou escarro.
b) Qual o procedimento comumente adotado para análise de amostras do trato respiratório quando há suspeita de infecção por Staphylococcus?
R: Realizar uma cultura a partir da amostra coletada, realizar teste da catalase, além de ser coagulase positivo, ainda produz as enzimas DNase (que degrada o DNA das células hospedeiras) e a endonuclease termoestável, que também são usadas na identificação bioquímica da espécie.
c) Discuta a relação entre os sintomas apresentados pelo paciente e o agente etiológico. 
R: Trata-se de um quadro de síndrome do choque tóxico, onde os sintomas apresentados são causados pelas toxinas estafilocócicas
Estudo 1B. Pacientes que sofreram queimaduras moderadas ou graves devem ser internados para receber tratamento imediato, pois há sério risco de complicações, uma vez que ocorre a quebra da barreira natural de proteção do corpo contra microrganismos do ambiente, favorecendo a infecção das feridas e, em casos mais graves, podendo acarretar bacteremia. Nos Centros de Tratamento de Queimados, a infecção é responsável por 75 a 80% dos óbitos. Nesse contexto, uma amostra foi coletada de um paciente queimado e inoculada em Ágar Sal-Manitol (Imagens 1 e 2). Após período de incubação, detectou-se a presença de Staphylococcus aureus. 
a) Qual imagem representa o meio com provável crescimento dessa espécie? 
R: Imagem 2
b) Quais as diferenças entre o microrganismo que cresceu na Imagem 1 daquele crescido na Imagem 2? 
R: O Ágar Sal-Manitol possui alta concentração de cloreto de sódio, que inibe o crescimento da maioria das bactérias. É um meio seletivo comumente utilizado para o isolamento de Staphylococcus aureus de amostras biológicas como urina, secreções, feridas e exudatos. Bactérias que crescem em alta concentração de sal e fermentam o manitol produzem produtos ácidos, modificando o indicador de pH vermelho de fenol de vermelho para amarelo. Staphylococcus patogênicos típicos fermentam manitol e formam colônias amarelas com halos amarelos. Staphylococcus não patogênicos típicos não fermentam manitol e formam colônias vermelhas, ou seja, microrganismos patógenos na imagem 2 e não patógenos na imagem 1.
c) Que perigos S. aureus oferece ao paciente queimado? 
R: Risco de infecções subcutâneas, que podem resultar em bacteremia. Além de complicações como distúrbios respiratórios, cardíacos, sanguíneos, renais ou gastrointestinais, transtornos emocionais, sepse.
d) Cite outro microrganismo comumente associado à infecção de pacientes queimados e quais os métodos diagnósticos utilizados em laboratório de análise para sua confirmação.
R: Dentre os microrganismos existentes, os que colonizam com maior frequência as queimaduras são: S. aureus, Staphylococcus coagulase negativo, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella sp, Enterobacter sp, Acinetobacter sp, Escherichia coli e Enterococcus faecalis. Entre os fungos, destacam-se Candida albicans e Aspergillus sp.
Pseudomonas aeruginosa: por meio de cultura por swab e biópsia do local. O fragmento é colocado em tubo estéril com solução salina e encaminhado para exame microbiológico. O material deve ser cultivado dentro de uma hora ou, então, deve permanecer imerso em Tioglicolato. Inicialmente é pesado, triturado para liberar os microrganismos, homogeneizado e semeado em meios de cultura adequados, como placa de ágar-sangue, de ágar-McConkey, de ágar-sal e de manitol hipertônico. Deve ser incubado a 37ºC por 24 horas. Após, é obtida a cultura qualitativa e quantitativa, ou seja, identificado o microrganismo e fornecido o número de microrganismo por grama de tecido e com a determinação da sensibilidade através do antibiograma. O resultado quanto ao tipo de microrganismo e o número de UFC por grama de tecido já pode ser obtido após 48 horas. A colonização é considerada quando a contagem for menor que 100.000 UFC por grama de tecido, e a infecção, quando a contagem for maior que 100.000 UFC por grama de tecido.
Gram-negativa, Oxidase (+), ß-hemólise em agar sangue, odor e cor característicos, motilidade (+), crescimento a 42º C, redução de nitrato a nitrito (+), lisina descarboxilase (-), acetamida (+), malonato (+), citrato (+), indol (-), formação de ácido oxidativamente a partir da glicose e do manitol, incapacidade de oxidar maltose e lactose, DNAse (-), sensibilidade à polimixina ß.
	Imagem 1.
	Imagem 2.
	
	
2. Estudos sobre infecções fúngicas.
Estudo 2A. Antibioticoterapia é um fator predisponente para a aquisição de candidíase. Você saberia responder por que o uso de antibióticos de amplo espectro pode favorecer essa infecção fúngica oportunista?
R: O crescimento desse fenômeno se deve ao uso mais amplo desses agentes, pois o tratamento com antibióticos diminui a quantidade de bactérias comensais, que normalmente ajudam a conter o organismo
Estudo 2B. O exame direto para diagnóstico de infecções causadas por fungos consiste em avaliar a amostra clínica microscopicamente, entre a lâmina e a lamínula, utilizando reagentes e/ou corantes para a visualização das estruturas fúngicas. Embora o exame direto seja conclusivo para o diagnóstico de algumas micoses, na maioria das vezes, esse exame não é suficiente para a identificação do agente etiológico. Observe as Imagens 3 e 4 a seguir e, depois, resposta às questões propostas: 
	Imagem 3.
	Imagem 4.
	
	
	Fonte: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1806-37132009000900013
a) Quais os tipos de micose que os microrganismos identificados na análise microscópica apresentada na Imagem 3 podem causar? 
R: a paracoccidioidomicose (Figura 1a), a criptococose (Figura 1b) e a bola fúngica aspergilar (Figura 1c).
b) Quais as principais características desses fungos e das doenças que causam? 
R: Paracoccidioidomicose é uma micose progressiva de pele, mucosas, linfonodos e órgãos internos causada por Paracoccidioides brasiliensis. Os sintomas são úlceras de pele, adenite e dor no órgão abdominal envolvido. A maioria das pessoas que inalam conídios de P. brasiliensis desenvolve infecção pulmonar assintomática; a enfermidade, se ocorrer, normalmente se manifesta como pneumonia aguda, que pode desaparecer espontaneamente. Do ponto de vista clínico, as infecções aparentes são, em geral, crônicas e progressivas, mas comumente não são fatais
A Criptococose, popularmente conhecida como doença do pombo, é uma doença infecciosa causada pelo fungo Cryptococcus neoformans, que pode ser encontrada principalmente nas fezes dos pombos, mas também em frutas, solos, cereais e árvores, por exemplo.
Aspergilose pulmonar trata-se de uma doença que tem como principal agente o fungo Aspergillus fumigatus, que se instala no pulmão humano.
c) A micose representada na Imagem 4 pode ser causada por algum microrganismo identificado na Imagem 3? Discuta. 
R: Não. A imagem 4 apresenta uma micose cutânea e todos os fungos que se apresentam na imagem 3, causam outras doenças.
d) Que tipo de amostra pode ser usado para a realização de exame microscópico? 
R: Raspado
e) Como coletar amostras para exame diagnóstico no caso da Imagem 4?
R: Unha, raspar a placa esbranquiçada aderida a superfície da unha e colher o material em placa de Petri;
3. Estudo sobre detecção de resistência bacteriana aos antibióticos.
Estudo 3A. O antibiograma ou teste para detecção de resistência deve ser realizadoa partir de bactérias isoladas de amostras clínicas representativas de um processo infeccioso, no qual a sensibilidade aos antimicrobianos não é previsível. O método de disco-difusão em ágar (Imagem 5) é o mais simples, barato, e ainda assim confiável e, por isso, o mais utilizado em laboratórios de Microbiologia Clínica.
	Imagem 5.
	
a) Como é realizado o teste de disco-difusão? Descreva as etapas de preparo do inóculo, inoculação das placas, aplicação dos discos, incubação e leitura.
PROCEDIMENTO
Etapa 1: Preparação dos Substratos
Os discos a serem utilizados devem ter passado por controle de qualidade prévio quanto a sua eficácia para evitar quaisquer desvios na leitura e consequente erro ao reportar o status de sensibilidade de um microrganismo. Quanto ao meio de cultura, observar seu estado aparente (descolamento da placa, espessura = 4mm, possíveis contaminações etc.) caso esteja pré-pronto. Ao se optar pela fabricação do meio de cultivo in house, deve-se determinar qual o meio mais adequado para o crescimento do microrganismo a ser avaliado. Para testes com microrganismos de crescimento rápido (p. ex. E. coli e Staphylococcus) usar meio de Mueller Hinton não suplementado. Para testes com microrganismos nutricionalmente exigentes (Haemophilus sp., Neisseria sp., pneumococos), usar meio de Mueller Hinton suplementado com sangue e/ou nutrientes específicos para o desenvolvimento do microrganismo. Em todos os casos atentar para a validade dos produtos utilizados.
Etapa 2: Preparação do Inóculo
O inóculo deverá ser preparado a partir de colônias isoladas e representativas do microrganismo, presentes em placa de isolamento primário. Para tanto, suspender em salina estéril ou caldo de cultivo a colônia a ser testada de forma a obter uma suspensão com turvação equivalente a 0,5 da escala de McFarlland (1,5 x 108 UFC/ml). Essa turvação pode ser obtida por: pré-incubação do inóculo (método do crescimento), onde a colônia isolada é suspendida em meio de cultura e seu crescimento é monitorado até que atinja a concentração desejada, ou por inoculação direta (método da suspensão direta), onde se suspende um número suficiente de colônias para se atingir a concentração desejada. A confirmação da concentração do inóculo pode ser feita através do método de comparação visual com padrão de turvação correspondente a 0,5 da escala de McFarlland ou pelo método turbidimétrico, com leitura do inóculo a 625nm. A D.O. (Densidade óptica - Espectrofotômetro) desejada é de 0,08 à 0,10.
Etapa 3: Inoculação na Placa
Imergir um swab estéril na suspensão bacteriana e, retirando o excesso de inóculo através da compressão do swab nas paredes do tubo, semear a placa uniformemente em estrias. A placa é uniformemente semeada por rotações a cada 60 graus.
Etapa 4: Aplicação dos discos de sensibilidade
Os antibióticos a serem utilizados no teste de sensibilidade são definidos um laboratório de referência (p. ex. Clinical and Laboratory Standards Institute - CLSI) através de documentos periodicamente atualizados (p.ex. M100-S16/2006 - CLSI). No Brasil o padrão utilizado é o estabelecido pelo CLSI ou pelo FDA (Food and Drug Administration). Os discos poderão ser utilizados de forma individual (Sensifar série básica e complementar, Sensifar-vet) ou em sistema multidisco (Multifar-15 e Multifar-24). Distribuir com o auxílio de uma pinça estéril os discos na superfície do ágar guardando distância aproximada de 24mm de centro a centro. Não remover ou reposicionar os discos após fixação no ágar. Posicionar no máximo 12 discos (placas de 150mm) ou 5 discos (placas de 100mm) por placa de teste.
Etapa 5: Incubação das Placas
Após 15 minutos à temperatura ambiente, incubar as placas, invertidas, a 35ºC por 16-18 h. Condições diferenciadas de incubação: Staphylococcus aureus: 24 h (Vancomicina e Oxacilina ) Haemophilus sp: 20-24 h a 5% CO2 Streptococcus pneumoniae: 18-24 h a 5% CO2
Etapa 6: Leitura da Zona de Inibição
Após o período de incubação, checar a característica do crescimento e o padrão das zonas de inibição ao redor dos discos. Usando um paquímetro, ou halômetro Cefar, medir as zonas de inibição, em milímetros, incluindo o diâmetro do disco. Observações: Discos com crescimento adjacente às bordas devem ser medidos a partir do crescimento externo. Qualquer crescimento dentro dos halos de inibição deve ser subcultivado, reidentificado e retestado. No caso de bactérias hemolíticas, fazer a leitura da zona de crescimento e não da zona de hemólise. No caso de antibiograma para Proteus sp., ignorar o véu formado na zona de inibição e ler normalmente seu diâmetro.
Etapa 7: Interpretação dos Resultados
Para limites dos halos de inibição consultar Tabela CLSI M2-A9 ou Tabela de Interpretação do Antibiograma - Cefar. As definições das classificações são:
SENSÍVEL: A classificação significa que uma dada infecção causada por tal microrganismo pode ser tratada eficientemente com a dose recomendada do agente antimicrobiano.
INTERMEDIÁRIA: Esta classificação inclui organismos com valores de CIM (Concentração Inibitória Mínima) semelhantes àqueles atingidos por antibacterianos no sangue e tecidos e cuja avaliação da resposta venha a ser inferior a isolados "sensíveis". A classificação "intermediária" encontra aplicação clínica em sítios corpóreos onde as drogas são fisiologicamente concentradas (ex: quinolonas e beta-lactâmicos na urina) ou quando uma alta dose de droga pode ser usada (ex: beta-lactâmicos). A classificação "intermediária" também inclui uma zona tampão que preveniria pequenos fatores técnicos que possam causar diferenças na interpretação, especialmente no caso de drogas com limites estreitos de farmacotoxicidade.
RESISTENTE: Tal microrganismo não é inibido pelas concentrações usuais do antibiótico testado. Principais Fatores de Erro na Técnica: Erro na transcrição de dados - Erro na leitura dos halos de inibição - Erro na padronização do inóculo - Contaminação ou alteração na cepa-controle (ensaio qualitativo de controle de qualidade) - Padrão velho da escala de McFarlland (suspensão de sulfato de bário) - Espectrofotômetro não calibrado - Temperatura ou atmosfera impróprias para incubação - Semeadura não homogênea no ágar - Variações no desempenho do meio de cultivo - Perda de potência do disco durante o armazenamento (excesso de umidade, temperatura inadequada, expiração do prazo de validade).
b) Como ocorre a seleção dos antimicrobianos a serem testados?
R: A partir do resultado da cultura, onde se tem conhecimento do microrganismo que dever ser testado.
c) Quais as limitações da técnica e que fatores podem afetar o resultado do antibiograma?
R: Não é aplicável a microrganismos de crescimento lento. Se for necessária uma incubação prolongada para alcançar o crescimento suficiente e obter uma zona de inibição detectável, o antibiótico pode deteriorar a ponto de fornecer leituras imprecisas. Também é inadequado em antibióticos que se difundem lentamente em ágar, tais como a polimixina B.
d) Por que se diz que esse método é qualitativo?
R: Este método apenas diz se são ou não sensíveis/resistentes ao medicamento, ele não quantifica nada.
e) Que outro teste pode ser realizado para conhecer a resposta de um determinado microrganismo aos antimicrobianos?
R: E-Test, Sistema Vitek (Bio-Meriuex), Diluição seriada (MIC - Minimal Inhibitory Concentration e MBC – Minimal Bactericidal Concentration).