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Exercícios sobre cinética enzimática: 1. A enzima urease aumenta a velocidade da hidrólise da uréia em pH 8,0 e 20º C por um fator de 1014. Se uma dada quantidade de urease pode hidrolisar completamente uma certa quantidade de uréia em 5 minutos a 20º C e pH 8,0, quanto tempo (em anos) levaria para que essa mesma quantidade de uréia fosse hidrolisada sob as mesmas condições na ausência da urease? Se a enzima aumenta a velocidade da reação de hidrólise da uréia em um fator de 1014, o tempo para que a reação se complete também é acelerado nesta mesma ordem de grandeza. Se a reação não for catalisada pela enzima (ausência da enzima), o tempo necessário para a reação se completar será 1014 vezes maior. Portanto, na ausência da enzima o tempo para a reação se completar será igual à: t = 5 min x 1014 Transformando isto em horas: t = 5 x 1014 min / 60 = 0,083 x 1014 horas Transformando em dias: t = 0,083 x 1014 horas / 24 = 0,00347 x 1014 dias Transformando em anos: t= 0,00347 x 1014 dias/365 = 9,5 x 108 anos. 2. Utilize a equação de Michaelis-Menten para responder as questões abaixo: a) Qual a concentração de substrato para que uma enzima com kcat de 30,0 s-1 e Km de 0,005 M opere com um quarto da velocidade máxima? É só utilizar a equação de Michaelis-Menten e substituir, o valor de Vo por Vmáx/4: 𝑉𝑜 = 𝑉𝑚á𝑥. [𝑆] 𝐾𝑚 + [𝑆] Substituindo: 𝑉𝑚á𝑥 4 = 𝑉𝑚á𝑥. [𝑆] 𝐾𝑚 + [𝑆] Resolvendo a equação: [S] = 0,00166 M ou 1,7 mM b) Determine a fração de Vmáx que seria obtida nas seguintes concentrações de substrato: 1/2Km; 2Km e 10Km. i) [S] = ½ Km ou 0,5Km – é só substituir este valor na equação : 𝑉𝑜 = 𝑉𝑚á𝑥.[𝑆] 𝐾𝑚+[𝑆] → 𝑉𝑜 = 𝑉𝑚á𝑥.0,5𝐾𝑚 𝐾𝑚+0,5𝐾𝑚 → 𝑉𝑜 = 0,5 𝑉𝑚á𝑥.𝐾𝑚 1,5 𝐾𝑚 Resposta: 𝑉𝑜 = 0,33. 𝑉𝑚á𝑥 ii) [S] = 2 Km Seguir o mesmo raciocínio acima Resposta: 𝑉𝑜 = 0,66. 𝑉𝑚á𝑥 iii) [S] = 10 Km Resposta: 𝑉𝑜 = 0,9. 𝑉𝑚á𝑥 c) Enzimas que catalisam a reação X↔Y são isoladas de 2 espécies de bactérias. As enzimas possuem a mesma Vmáx, mas diferentes valores de Km. A enzima A tem Km=2 µM e a enzima B tem Km=0,5 µM. Qual destas enzimas possui maior afinidade pelo substrato? A enzima B, devido ao seu menor valor de Km. 3. Um grupo de pesquisadores descobriu uma nova enzima, que catalisa a reação abaixo, e que eles nomearam de felicidase: FELICIDADE ↔ TRISTEZA Os pesquisadores iniciaram a caracterização da enzima. (a) No primeiro experimento, com [Et] de 4 nM, eles observaram que a Vmáx é 1,6 µM.s-1 Com base nesse experimento, qual é o kcat da felicidase? (coloque as unidades apropriadas) Para isto, precisamos utilizar a equação da Kcat: 𝐾𝑐𝑎𝑡 = 𝑉𝑚á𝑥 [𝐸𝑡] → 𝐾𝑐𝑎𝑡 = 1,6.10−6 𝑀.𝑠−1 4.10−9𝑀 Portanto: 𝐾𝑐𝑎𝑡 = 400 𝑠−1 (b) Em outro experimento, com [Et] de 1 nM e concentração do substrato FELICIDADE de 30µM, os pesquisadores observaram que Vo= 300 nM.s-1. Qual é o valor de Km medido para a felicidase para o substrato FELICIDADE? Para este exercício, precisamos utilizar o valor de Kcat obtido no exercício anterior (b). Com este valor, e utilizando a fórmula da Kcat, podemos calcular o novo valor de Vmáx, com [Et] = 1 nM: 𝐾𝑐𝑎𝑡 = 𝑉𝑚á𝑥 [𝐸𝑡] → 400 𝑠−1 = 𝑉𝑚á𝑥 10−9 𝑀 → Vmáx = 0,4 . 10-6 M.s-1ou 0,4 µM.s-1 Agora é só utilizar a equação de Michaelis-Menten e calcular Km (cuidado com as unidades, para resolver este exercício, vou deixar tudo em µmol ou µM): 𝑉𝑜 = 𝑉𝑚á𝑥. [𝑆] 𝐾𝑚 + [𝑆] 0,3 µ𝑀. 𝑠−1 = 0,4 µ𝑀. 𝑠−1 . 30 µ𝑀 𝐾𝑚 + 30 µ𝑀 Km = 10 µM (c) Pesquisas posteriores indicaram que a felicidase isolada no primeiro experimento estava contaminada com um inibidor reversível, denominado RAIVA. Quando RAIVA foi totalmente removida da preparação de felicidase e os dois experimentos foram repetidos, observou-se que a Vmáx não foi alterada, mas o valor de Km passou a 20 µM. Com base nestas informações, qual o tipo de inibição realizada por RAIVA? Inibidor reversível, do tipo competitivo. 4. Embora haja disponibilidade de métodos gráficos precisos para determinação de Vmáx e Km de uma reação catalisada por enzimas, algumas vezes estes parâmetros podem ser rapidamente estimados pelo exame dos valores de Vo aumentando a [S]. Estime os valores de Vmáx e Km da reação catalisada por uma enzima na qual foram obtidos os seguintes dados: [S] (M) Vo (µM/min) 2,5 x 10-6 28 4 x 10-6 40 1 X 10-5 70 2 x 10-5 95 4 x 10-5 112 1 x 10-4 128 2 x 10-3 139 1 x 10-2 140 2 x 10 -1 140 Vmáx = 140 µM.min-1 Km = 1x10-5 M 5. A anidrase carbônica de eritrócitos (PM: 30.000 g/mol) tem um dos números de renovação mais altos conhecidos. Ela catalisa a hidratação reversível do CO2. H2O + CO2 ↔ H2CO3 Se 10 µg de anidrase carbônica pura catalisam a hidratação de 0,3 g de CO2 em 1 min em Vmáx, qual é o número de renovação (Kcat) da anidrase carbônica (em unidades de min-1)? - Primeiro, calcular o número de mols de CO2 e da enzima (anidrase carbônica) presente nas massas dadas no enunciado. 0,3 g de CO2: Massa molar CO2: 46g/mol 46g – 1 mol 0,3g – x x= 0,00652 mols de CO2 10 µg de anidrase carbônica: Massa molar da enzima: 30.000 g/mol 30.000 g – 1 mol 10.10-6 g – x x= 3,33 .10-10 de anidrase carbônica - A velocidade máxima atingida pela enzima é igual a 0,00652 mols/min, já que, segundo o enunciado, é esta a quantidade de moléculas de CO2 transformadas pela enzima por minuto, quando ela atinge a velocidade máxima. - Agora, é só substituir os valores de Vmáx e concentração total da enzima (em mols, [Et]) na equação da Kcat: 𝐾𝑐𝑎𝑡 = 𝑉𝑚á𝑥 [𝐸𝑡] 𝐾𝑐𝑎𝑡 = 0,00652 𝑚𝑜𝑙/𝑚𝑖𝑛 3,3. 10−10𝑚𝑜𝑙 Kcat ≈ 2x107 min-1