Aula 4 BA - Fundamentos de Espectrofotometria 2018 2

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14/08/2018
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CENTRO UNIVERSITÁRIO CESMAC
CAMPUS II 
CURSO MEDICINA VETERINÁRIA
Professor: Dr. Genildo Cavalcante Ferreira Júnior
Maceio – AL
Agosto 2018
Fundamentos de 
Espectrofotometria
Fundamentos da Espectrofotometria
“Uma maneira boa de cutucar moléculas, é 
com radiação eletromagnética (luz)”
A espectrofotometria faz parte da classe dos métodos 
analíticos que baseiam-se na interação da matéria com a 
energia radiante
Luz 
incidente
Luz 
emergente
Luz absorvida
Perdas:
- reflexões
- dispersão
-absorção
•Boa sensibilidade
•Baixo custo de 
análise
•Fácil operação
•Equipamentos 
robustos
A espectrofotometria é o método de análises
óptico mais usado nas investigações biológicas e
físico-químicas.
O espectrofotômetro é um instrumento que
permite comparar a radiação absorvida ou
transmitida por uma solução.
Espectrofotometria
Fundamentos da Espectrofotometria
Espectrofotometria – medida da luz que é 
absorvida ou emitida por uma espécie química.
Aplicações
ANALITOS ORGÂNICOS: 
• Compostos nitrogenados;
• Fármacos (ácido acetil salicílico); 
• Fenóis;
• Gorduras (colesterol).
ANALITOS INORGÂNICOS 
• Íon cloreto amônia, fosfato, nitrato e amônia;
• Elementos metálicos em geral.
O Espectrofotômetro é um instrumento de análise, amplamente utilizado
em laboratórios de pesquisa, capaz de medir e comparar a quantidade de
luz (radiação eletromagnética) absorvida, transmitida ou refletida por
uma determinada amostra, seja ela solução, sólido transparente ou
sólido opaco.
Espectrofotômetro
O resultado da 
espectrofotometria é dado 
por um gráfico que é 
conhecido como espectro e 
fornece informações de 
intensidade por 
comprimento de onda da 
fonte de luz.
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Conceitos
1. Luz - o espectro eletromagnético 
RADIAÇÃO ELETROMAGNÉTICA
Radiação Ultravioleta: é a radiação de frequência mais alta do que a da luz violeta. Seu
comprimento de onda é inferior a 400 nm.
Radiação Infravermelha: é a radiação que conhecemos como calor, tem uma
frequência mais baixa e um comprimento de onda maior do que a luz vermelha. Seu
comprimento de onda é maior do que 800 nm.
Radiação Visível: é aquela que os nossos olhos enxergam, ou seja, corresponde a
radiação eletromagnética com comprimentos de onda no intervalo de 400 à 800 nm.
Conceitos
2. Ondas eletromagnéticas
a) Freqüência (v): 
corresponde ao número de 
ciclos de onda (cristas ou 
vales sucessivos) que 
passam em um dado ponto 
por unidade de tempo. 
Unidade: hertz, s-1 (1 Hz = 
1 ciclo por segundo). 
b) Comprimento de onda (ʎ ): 
é a distância entre cristas 
sucessivas (ou vales 
sucessivos). Pode ser dado 
em metros (m), em 
nanômetros (nm) ou em 
qualquer unidade de 
comprimento que seja 
conveniente. 
c) Amplitude (A): 
corresponde a altura de 
uma crista (ou a 
profundidade de um vale).
Absorção da Radiação
Vários fenômenos podem ocorrer com a radiação luminosa, 
como : reflexão, refração, espalhamento ou ser absorvida pelo 
material.
Fonte de Luz: é composta por uma lâmpada de deutério e uma lâmpada de
tungstênio (semelhante à lâmpada de carro). A lâmpada de deutério emite
radiação UV e a de tungstênio emite luz visível.
Monocromador: alguns espectrofotômetros ainda possuem um prisma como
monocromador, porém os mais modernos possuem dispositivos eletrônicos
que transformam a luz incidida em vários comprimentos de onda, em um só
comprimento, ou seja, a luz monocromática.
Os componentes principais de um 
espectrofotômetro são apresentados e 
suas respectivas funções
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Cubeta: é o recipiente propício para conter a amostra que será utilizada na
análise, as cubetas podem ser de quartzo, vidro e acrílico, porém recomenda-se
que seja usada uma cubeta de quartzo por que o vidro e o plástico absorvem UV
e causa a reflexão da luz visível.
Detector: o detector é um dispositivo que detecta a fração de luz que passou
pela amostra e transfere para o visor e para o computador acoplado ao aparelho
Os componentes principais de um 
espectrofotômetro são apresentados e 
suas respectivas funções
• O manuseio das cubetas deve ser feito com um tecido, para 
impedir que as pontas dos dedos entrem em contato com as 
faces;
• Mantenha os dedos longe das faces limpas da cubeta, pois 
as impressões digitais dispersam e absorvem a luz;
• Para leituras precisas, é importante posicionar a cubeta no 
espectrofotômetro da maneira mais reprodutível possível. 
Justificativa: uma variação aleatória na absorvância surge de 
pequenas diferenças da posição da cubeta no seu suporte.
Precauções com a cubeta:
* A porção de luz que passa da solução é a transmitância percentual 
%T.
* A luz que não passa é absorvida pela solução e é medida como 
unidade de absorbância A.
1. Soluções concentradas deixam passar menos luz que soluções diluídas.
2. Quanto mais concentrada a solução, maior é a sua absorbância e menor será a 
transmitância
Absorção da Radiação
Transmitância – é a fração da luz incidente em um
comprimento de onde específico, que passa por uma
amostra de matéria;
Absorbância – é a capacidade do material em absorver
radiações em frequência específica;
A concentração de uma substância é diretamente proporcional à
sua concentração (relação linear), ou seja, a concentração de
uma substância é diretamente proporcional à quantidade de luz
absorvida e inversamente proporcional ao logaritmo da luz
transmitida.
Conceito da lei de Beer
Determinando a concentração de uma substância desconhecida
C2 = A2 x C1 
A1
C2– Concentração da substância desconhecida
A2– Absorbância da substância desconhecida
C1– Concentração do padrão
A1 – Absorbância do padrão
Conceito da lei de Lambert-Beer
Lambert (1870) observou a relação entre a transmissão de luz e a espessura
da camada do meio absorvente. Quando um feixe de luz monocromática,
atravessava um meio transparente homogêneo, cada camada deste meio
absorvia igual a fração de luz que atravessava, independentemente da
intensidade da luz que incidia. A partir desta conclusão foi enunciada a
seguinte lei:
A intensidade da luz emitida decresce exponencialmente à 
medida que a espessura do meio absorvente aumenta 
aritmeticamente
I = Io . 10
-x1Onde: I = Intensidade da luz transmitida
Io = Intensidade da luz incidente
x = constante denominada coeficiente de absorção e que depende do meio 
absorvente empregado
1 = Espessura do meio absorvent
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Espectro de absorção do permanganato de potássio
A amostra (1) tem 66mg/L de concentração. As demais (2),(3),(4) e (5) foram diluídas
para (0.8), (0.6), (0.4) e (0.2) da concentração da primeira amostra, respectivamente.
Durante um exame de glicose de um soro canino foram encontrados os 
valores de absorbância abaixo. 
Valor de referência para cães – 70 a 110 mg/dL
Concentração da solução padrão – 100 mg/dL
Com base nas informações fornecidas, calcule a concentração de glicose no 
soro do animal.
Tubo Reagente de cor Padrão Soro 
(amostra)
Absorbância
Branco 2,0 mL - - 0 
Padrão 2,0 mL 20µL - 0,250
Amostra 2,0 mL - 20µL 0,500
Aplicação
C2 = A2 x C1 
A1
C2– Concentração da substância desconhecida
A2– Absorbância da substância desconhecida
C1– Concentração do padrão
A1 – Absorbância do padrão
Em bioquímica: é usado para determinar reações catalisadas por
enzimas.
Em aplicações clínicas: é utilizado para examinar o sangue ou
tecidos para diagnóstico clínico.
Em biologia: em biologia molecular é utilizado para quantificar
o DNA e determinar sua pureza depois de extraído.
Em medicina: é utilizado na análise cinética de diferentes
enzimas sanguíneas.
Aplicações em saúde
Genildo Jr
genildojr@yahoo.com.br