Relatório Prática 1 - Bioquímica II

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Relatório de Prática 1 
Fermentação 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Aluna: Drielle Rocha Leite 
Polo: Nova Friburgo 
Curso: Ciências Biológicas 
Matrícula: 17212020026 Data: 22/03/2020 
 
 
 
INTRODUÇÃO 
 
Não há como falar em qualquer tipo de fermentação sem antes falar no processo 
que o precede, que é o da glicólise. A glicólise ocorre no citoplasma celular e é 
a principal via metabólica da degradação da glicose, e no processo de glicólise 
que ocorre uma série de reações muito importantes para que haja a degradação 
da glicose a 2 moléculas de piruvato e resultando em 2 ATPs e 2 NADH++ H. 
Tais reações são divididas em 10 etapas, onde diz-se que as 5 primeiras etapas 
consistem na etapa de investimento e as 5 últimas consistem na etapa de 
pagamento. 
 
A primeira etapa de investimento consiste na fase de fosforilação da glicose, esta 
primeira fase e de suma importância para o funcionamento desta via metabólica 
pois e nesta etapa que ao ser detectada a presença de glicose na célula ela e 
imediatamente fosforilada no carbono 6 sendo uma reação irreversível, tal 
reação e catalisada pela enzima exoquinase e ela funciona como ponto de 
regulação da via pois ao fosforilar a molécula de glicose impede que ela retorne 
pois a proteína carreadora GLUT 4 não consegue transportar a molécula 
fosforilada, há gasto de ATP. 
 
A segunda etapa da via e a de isomerização da glicose, ou seja, onde a molécula 
sofre um rearranjo em sua conformação, que transforma a glicose 6 fosfato em 
frutose 6 fosfato, a proteína que catalisa essa reação é a fosfoglicose-isomerase. 
 
A terceira reação da via é a mais importante, pois é o principal ponto de regulação 
da via, é onde ocorre a fosforilação da frutose 6 fosfato recebendo mais 1 
carbono, onde dará origem a frutose1,6-bifosfato, esta reação e catalisada pela 
enzima fosfofrutoquinase, é a segunda reação irreversível da via glicolítica, há 
gasto de energia. 
 
A quarta reação da via e a onde ocorre a quebra da frutose1,6biP (6C) em duas 
moléculas de gliceraldeído-3-fosfato é a dihidroxicetona-P e gliceraldeído 
3fosfato esta reação e catalisada por uma aldose. 
 
A quinta reação ocorre a conversão de Dihidroxicetona-P em gliceraldeído 3 
fosfato, através da ação da enzima triose-fosfato isomerase, assim sendo é 
formado uma molécula de gliceraldeído 3 fosfato na reação 4 e outra molécula 
de gliceraldeído 3 fosfato na reação 5 assim ao final desta reação teremos 2 
moléculas de gliceraldeído 3 fosfato, esta é também a última etapa da primeira 
fase de investimento. 
 
Na sexta reação começa a etapa de pagamento onde o gliceraldeído 3 fosfato é 
convertido em 1,3 bifosfoglicerato, através da adição de um fosfato inorgânico Pi 
ao substrato, não a gasto de energia a enzima que catalisa esta reação e a 
gliceraldeído 3 fosfato desidrogenase, nesta reação ocorre também a redução 
da molécula de NAD+ que passa a NADH+ H+, esta é uma molécula de alta 
energia, o que possibilita na reação seguinte a formação de uma molécula de 
ATP. 
 
Na sétima 2 ATPs são sintetizados, ou seja, a energia que foi conservado na 
molécula de 1,3-bifosfoglicerato será utilizada para a formação de ATP, o 
gliceraldeído 3 fosfato é convertido a 3-fosfoglicerato, tal reação e catalisada pela 
enzima fosfoglicerato quinase. 
 
Na oitava reação o 3-fosfoglicerato e convertido em 2-fosfoglicerato, onde após 
a ação da enzima fosfoglicerato mutase ocorre a modificação da posição do 
fosfato na molécula mudando do C 3 para o C 2. 
 
Na nona reação ocorre a formação do segundo composto de alta energia, o 
fosfoenolpiruvato a partir da molécula de 2-fosfoglicerato, tal reação e catalisada 
pela enzima enolase. 
 
Na décima reação ocorre a formação de 2 moléculas de piruvato e duas 
moléculas de NADH. H + e 2 de ATP que é o produto final da glicólise, nesta 
reação a energia da hidrólise do fosfoenolpiruvato conduz a síntese de uma 
molécula de ATP, tal reação e catalisada pela enzima piruvato quinase, está é 
também um ponto de regulação da via glicolítica. 
 
Um dos prováveis destinos dos produtos da glicólise quando em ausência de O2 
e a fermentação que pode ocorrer de duas formas a fermentação láctica onde 
uma reação que converte o piruvato em lactato a enzima que catalisa essa 
reação e a lactato desidrogenase, onde o NADH que foi reduzido pela enzima 
gliceraldeído-3P desidrogenase volta a ser oxidado pela enzima lactato 
desidrogenase, isto permite a continuidade da via, pois disponibiliza NAD+ e 
impede que a via paralise. E o outro caminho e a fermentação alcoólica, ocorre 
mais dois processos que é a conversão de piruvato em acetaldeído com 
produção de CO2 seguido da conversão de acetaldeído em etanol com a 
reoxidação do NADH reduzido na glicólise onde a TPP (tiamina pirofosfato e 
magnésio) são cofatores da piruvato descarboxilase. 
 
Na atividade prática, observou-se o processo de fermentação alcoólica, 
utilizando leveduras S. cervisae, através do monitoramento da liberação de CO2 
e do consumo de sacarose. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
OBJETIVO 
 
O objetivo desta prática foi de monitorar a fermentação alcoólica, através do 
aparecimento de seus produtos (CO2), e do consumo do substrato (sacarose), 
utilizando as leveduras como organismos fermentadores. 
 
 
 
MATERIAIS 
 
• Levedura (fermento biológico seco instantâneo) 
• Sacarose (açúcar) 
• Água mineral 
• Solução de Seliwanoff (reagente) 
• 2 tubos falcon graduados (1 com tampa furada e outro com a tampa sem 
furo) 
• Pipetas de 1, 2 e 5 mL com pêra 
• Becker (250 e 400 mL) 
• Tubos de ensaio 
• Estante para tubos de ensaio 
• Pregador 
• Funil 
• Banho-maria (mantido a 40°C) 
• Placa de aquecimento (mantém a água a 100°C) 
• Espectrofotômetro 
 
 
 
PROCEDIMENTOS 
 
Primeira etapa: Foi pesado 10 g de sacarose na balança de precisão com o 
becker de 250 ml, foi adicionado 40 ml de agua destilada e homogeneizou-se, 
foi transferido para outro Becker de 250 ml e avolumou a 100 ml com agua 
destilada e assim foi preparado a solução de 10%, devidamente etiquetada. 
 
 
Segunda etapa: Foi colocado 20mL da solução de sacarose 10% para um becker 
de 250ml contendo 50mL de água destilada, e avolumou-se o becker em 200mL, 
formando-se uma solução de sacarose 1%, que foi devidamente etiquetado. 
Em seguida, foi colocado 80mL da solução de sacarose 1% em um Becker de 
250mL. e colocado em banho maria a 40ºC. 
Foi retirado 10mL da solução de sacarose 1%, e colocado em um Becker de 
250mL e avolumou-se em 100mL com água destilada. Assim foi formado a 
solução de sacarose 0,1%. Que foi devidamente etiquetado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Terceira etapa: Preparou-se a solução de levedura, onde pesou-se 3g de 
levedura na balança de precisão, utilizando o Becker de 250mL, em seguida foi 
adicionado 50 ml de água destilada, e agitou-se até que ficasse homogêneo e 
em seguida avolumou-se a 100 ml. 
 
 
 
 
 
Quarta etapa: Foram enumerados 11 tubos de ensaio de 5mL de 0 a 10 com 
caneta de tinta permanente. Os tubos foram colocados em uma estante. Retirou-
se 50mL de solução de sacarose 01% do Becker de 100mL, com o auxílio de 2 
pipetas graduadas de 1mL e duas peras de sucção. 
No tubo 0 pipetou-se 1mL de água destilada. 
no tubo 1, pipetou-se 0,9mL de água destilada e avolumou-se com 0,1ml da 
solução de sacarose 0,1%. 
No tubo 2 pipetou-se 0,8mL de água destilada e avolumou-se com 0,2ml da 
solução de sacarose 0,1%. 
No tubo 3 pipetou-se 0,7mL de água destilada e avolumou-se com 0,3ml da 
solução de sacarose 0,1%. 
No tubo 4 pipetou-se 0,6mL de água destilada e avolumou-se com 0,4ml da 
solução de sacarose 0,1%. 
No tubo 5 pipetou-se 0,5mL de água destilada e avolumou-se com 0,5ml da 
solução de sacarose 0,1%. 
No tubo 6 pipetou-se 0,4mL de água destilada e avolumou-se com 0,6ml da 
solução de sacarose 0,1%. 
No tubo 7 pipetou-se 0,3mL de água destilada e avolumou-se com0,7ml da 
solução de sacarose 0,1%. 
No tubo 8 pipetou-se 0,2mL de água destilada e avolumou-se com 0,8ml da 
solução de sacarose 0,1%. 
No tubo 9 pipetou-se 0,1mL de água destilada e avolumou-se com 0,9ml da 
solução de sacarose 0,1%. 
No tubo 10 pipetou-se 1 mL de solução de sacarose 0,1%. 
E assim foi preparado a tabela abaixo; 
 
 
Tubo 
Solução de 
sacarose 
0,1% (mL) 
Água 
(mL) 
0 0 1 
1 0,1 0,9 
2 0,2 0,8 
3 0,3 0,7 
4 0,4 0,6 
5 0,5 0,5 
6 0,6 0,4 
7 0,7 0,3 
8 0,8 0,2 
9 0,9 0,1 
10 1 0 
 
 
 
Quinta etapa: Fermentação, foi utilizado dois tubos falcon de 50 ml, um de tampa 
verde (tampa íntegra) e o outro de tampa azul (tampa furada). Para o preparo 
dos tubos foi pipetado 5 ml da solução de sacarose a 10%, e foi pipetado 10ml 
da solução de levedura, foi completado ao máximo próximo a tampa com água 
mineral, no tubo verde foi retirando uma alíquota de 2ml e levada a placa de 
aquecimento por 10 minutos a 100°C para que fosse este representasse o tempo 
0, e de 30 em 30 minutos foi retirado uma alíquota de 2ml do sobrenadante e foi 
aquecendo-se na placa de aquecimento as amostras por 10 minutos a 100°C, e 
no tubo azul foi feito um traço com caneta retroprojetor para ter controle da 
quantidade de CO2 que ao decorrer de 10 em 10 minutos foi feito esta mesma 
marcação. Colocou-se os dois tubos em banho maria o de tampa verde voltado 
para baixo e do de tampa azul voltada para cima. 
 
 
 
Ao decorrer de 120 minutos deste processo, foi retirada uma alíquota de 0,5ml 
do sobrenadante de cada tubo e adicionado água destilada até 4,5ml e agitou-
se bem. Após foi retirada uma nova alíquota de cada tubo de 0,5 ml e foi 
adicionado 2ml do reagente solução de levedura, e foi colocado em banho maria 
a 100 °C por 20 minutos (1 linha), esta solução foi apresentou uma coloração 
acastanhada ao fim do processo, onde após foi medido no espectofotômetro, e 
em relação ao tubo amarelo foi feito a medição da emissão de CO2 . 
Em seguida separou-se uma nova estante com mais 10 tubos numerados de 0’ 
a 10’ e foi adicionado 0,5ml da solução que foi adicionado 2ml do reativo solução 
de Seliwanoff, que foi fervido por 20 minutos a 100°C e lido no espectofotômetro. 
 
 
 
 
RESULTADOS 
 
Tabela 1: Tabela da curva de calibração 
 
Número do tubo Abs Concentração 
1 0,0 0,0 
2 0,212 0,01 
3 0,296 0,02 
4 0,435 0,03 
5 0,515 0,04 
6 0,608 0,05 
8 0,640 0,07 
9 0,685 0,08 
10 0,713 0,09 
11 0,784 0,10 
 
*O tubo 7 foi descartado pelo professor por diferir de forma discrepante dos 
outros valores da tabela. 
 
 
 
Tabela 2: Tabela com valores de volume de CO2, ABS e concentração de 
sacarose: 
 
Amostras Tempo(min) Abs Concentração 
(%) 
Volume de 
CO2 (ml) 
1 0 0,844 0,100 0,0 
2 30’ 0,830 0,098 1,3 
3 60’ 0,812 0,096 2,5 
4 90’ 0,652 0,072 3,5 
5 120’ 0,397 0,035 4,7 
6 150’ 0,286 0,019 6,3 
 
 
Amostra 2 
y = 6,8639x + 0,1525 → 0,830 = 6,8639x + 0,1525 → 6,8639x = 0,830 – 0,1525 
→ 6,8639x = 0,6775 → 𝑥 = 
0,6775
6,8639
 → x = 0,098 
 
 
Amostra 3 
y = 6,8639x + 0,1525 → 0,812 = 6,8639x + 0,1525 → 6,8639x = 0,812 – 0,1525 
→ 6,8639x = 0,6595 → 𝑥 = 
0,6595
6,8639
 → x = 0,096 
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0,000 0,020 0,040 0,060 0,080 0,100 0,120
Te
m
p
o
 (
m
in
)
[Sacarose]
Teor de sacarose
 
Amostra 4 
y = 6,8639x + 0,1525 → 0,652 = 6,8639x + 0,1525 → 6,8639x = 0,652 – 0,1525 
→ 6,8639x = 0,4995 → 𝑥 = 
0,4995
6,8639
 → x = 0,072 
 
 
Amostra 5 
y = 6,8639x + 0,1525 → 0397, = 6,8639x + 0,1525 → 6,8639x = 0,397 – 0,1525 
→ 6,8639x = 0,2445 → 𝑥 = 
0,2445
6,8639
 → x = 0,035 
 
 
Amostra 6 
y = 6,8639x + 0,1525 → 0,286 = 6,8639x + 0,1525 → 6,8639x = 0,286 – 0,1525 
→ 6,8639x = 0,1335 → 𝑥 = 
0,1335
6,8639
 → x = 0,019 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
y = 6,8639x + 0,1525
R² = 0,9013
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12
C
o
n
ce
n
tr
aç
ão
Absorbância
Curva Padrão
 
 
 
 
 
Com os resultados apresentados nos gráficos foi possível ver que houve 
liberação de CO2 durante o processo da fermentação alcoólica a qual foi tema 
de nossa prática, foi possível também quantificar o consumo de sacarose ao 
longo do processo de fermentação, ao passo que ao ser fervido a solução que 
teve como propósito de inativar o processo de fermentação para que com ajuda 
do reagente solução de Seliwanoff, que e composto de 50% de Hcl (ácido 
clorídrico), ou seja, um ácido forte, onde o mesmo possui função da quebra de 
sacarose, assim como as leveduras; e o resorcinol liga-se na frutose para 
quantificar para que poder quantificar o valor que foi consumido, onde como o 
esperava-se no tempo 0 a concentração de sacarose foi maior que no tempo 
150’. Neste experimento foi utilizado como fonte de energia a glicose a sacarose 
que é um polímero de sacarídeo que ao ser quebrado forma glicose + frutose. 
 
 
 
CONCLUSÃO 
 
Através da realização desta prática foi possível acompanhar o processo de 
fermentação alcoólica, observando os seus produtos (CO2), onde foi feita a 
quantificação e observou-se o consumo do substrato, onde fez-se o 
acompanhamento e medição do consumo tendo como fonte as leveduras como 
organismos fermentadores. 
 
 
 
REFERÊNCIAS 
 
1. DA POIAN, Andrea; FOGUEL, Debora; PETRETSKI, Marílvia Dansa; 
MACHADO, Olga Lima Tavares. Bioquímica II. V1 / Rio de Janeiro: Fundação 
CECIERJ,2012 
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0
Te
m
p
o
 (
m
in
)
Volume CO² (mL)
Liberação de CO²