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Tecnologia 
do DNA recombinante
BIOLOGIA MOLECULAR
1. DNA recombinante
2. Enzimas de restrição
3. Vetores de clonagem
- Plasmídios
- Bacteriófagos
- Cosmídeos
4. Etapas de clonagem molecular
5. Aplicações
Conteúdo
HISTÓRICO
Watson & Crick
Estrutura do 
química do DNA 
(1953)
Nature, 25 - Abr - 1953
Tecnologia DNA 
recombinante
Insulina recombinante
(1978)
Ian Wilmut
clonagem de mamífero
(1997)
HISTÓRICO
Prática clínica
Testes genéticos
(1995...)
PGH
Conhecer genoma H. sapiens 
(1995-2003)
Transgenia
(1995...)
O que é um DNA recombinante?
- É uma molécula de DNA formada pela
ligação de duas moléculas de origens
diferentes (Ex. DNA de planta ligado a
um plasmídio)
“A engenharia genética atua no nível
molecular, onde as diferenças entre
espécies desaparecem”
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
W. Alber H. Smith D. Nathans
• Uma enzima de restrição ou endonuclease de restrição é
um tipo de nuclease que cliva fita dupla de DNA sempre
que identificar uma seqüência particular de nucleotídios
que seja o sítio de restrição da enzima;
Descritas em 1970,
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Função Natural: proteger o DNA 
bacteriano do DNA exógeno 
A enzima BamHI reconhece a seqüência dupla fita:
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
- reconhecem seqüências específicas de nucleotídeos no DNA, 
atuando como verdadeiras tesouras moleculares
BamHI
• BamHI - Bacillus amyloliquefaciens H
5’ G/GATCC 3’
• EcoRI - Escherichia coli R
5’ G/AATTC 3’
• HaeIII - Haemophilus aegyptius
5’ GG/CC 3’
• PstI - Providencia stuartii
5’ CTGCA/G 3’
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Nomenclatura
370 C, 1 hora, 
com tampão 
adequado
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
EcoRI
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Tipos de cortes: 
- Produção de terminais coesivos (adesivos, protuberantes) 
- Produção de terminais abruptos (ou cegos)
NarI 
~~~~~~ 
181 ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCC 
TGGTATACGC CACACTTTAT GGCGTGTCTA CGCATTCCTC TTTTATGGCG TAGTCCGCGG 
241 ATTCGCCATT CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC TCTTCGCTAT 
TAAGCGGTAA GTCCGACGCG TTGACAACCC TTCCCGCTAG CCACGCCCGG AGAAGCGATA 
301 TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA ACGCCAGGGT 
ATGCGGTCGA CCGCTTTCCC CCTACACGAC GTTCCGCTAA TTCAACCCAT TGCGGTCCCA 
HindIII PstI 
~~~~~~~ ~~~~~~ 
361 TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGCCAA GCTTGCATGC CTGCAGGTCG 
AAAGGGTCAG TGCTGCAACA TTTTGCTGCC GGTCACGGTT CGAACGTACG GACGTCCAGC 
XbaI BamHI KpnI EcoRI 
~~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~ ~~~~~~~ 
421 ACTCTAGAGG ATCCCCGGGT ACCGAGCTCG AATTCGTAAT CATGGTCATA GCTGTTTCCT 
TGAGATCTCC TAGGGGCCCA TGGCTCGAGC TTAAGCATTA GTACCAGTAT CGACAAAGGA
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
TIPOS DE VETORES
TIPOS DE VETORES
Vetores Hospedeiros
Plasmídeos
Cosmídeos
Bactérias / leveduras
clonagem
Bacteriófagos
Utilização
• Plasmídios são moléculas de DNA circular, fita
dupla, extracromossomais, que ocorrem
naturalmente em bactérias e algumas leveduras
– pUC18
– pBR322
– pUP310
Ob.: Utilizados para clonar fragmentos de até 9 kb
VETORES PLASMIDIAIS
VETORES PLASMIDIAIS
pUS974
4039 pb
rCanamicina
MT19
oriM
hsp60
RBS
oriE
HindIII
XbaI
Vetor de Expressão em 
Procarioto
pTarget
5670 bp
rNeomicina
rAmpicilina
Intron
Poly A
Promotor CMV
BamHI (1257)
EcoRI (1251)
EcoRI (1319)
HindIII (1326)
VETORES PLASMIDIAIS
Vetor de Expressão em 
Eucariotos
pUS973
3984 bp
rCanamicina
oriM Promotor hsp60
RBS
oriE HindIII
XbaI
Vacina Vetorizada (rBCG)
pUS974
4039 pb
rCanamicina
MT19
oriM
hsp60
RBS
oriE
HindIII
XbaI
pUS977
3984 bp
rCanamicina
oriM Promotor pAN
RBS
oriE HindIII
XbaI pUS20003759pb
Kan(R)
OriM
p18kDa
oriC
XbaI
HindIII
Vetor de Expressão em 
Eucariotos
VETORES PLASMIDIAIS
- Vírus que infectam bactérias;
- Utilizados para clonar fragmentos de 9kb a
25 kb
BACTERIÓFAGO
BACTERIÓFAGO
Ciclo Lítico
Ciclo 
Lisogênico
- São híbridos entre plasmídios e
bacteriófagos;
- Utilizados para clonar fragmentos de 25 a 35
kb;
COSMÍDEOS
Características essenciais
• Replicação autônoma
• Marcador de seleção (antibiótico)
• Sítio único de clonagem
VETORES DE CLONAGEM
• Necessitam de um promotor forte, de 
um RBS e de ATG
• Promotores induzíveis
• Sinais de secreção
• Fusão com proteínas carreadoras
VETORES DE EXPRESSÃO
CLONAGEM MOLECULAR
• É o isolamento e a
propagação em um
organismo de moléculas
idênticas de DNA
CLONAGEM MOLECULAR
CONSTRUÇÃO DE UM MICRORGANISMO 
RECOMBINANTE
1. Obtenção do DNA a ser clonado
2. Preparação do vetor
3. Ligação do vetor com o “inserto”
4. Transformação da bactéria
5. Seleção dos clones recombinantes
- Extração de DNA;
- PCR
- Digestão 
- Purificação
1.Obtenção do DNA a ser clonado
1.Obtenção do DNA a ser clonado
94 0C por 5 min
94 0C por 1 min
55 0C por 1 min
72 0C por 1 min
72 0C por 5 min
4 0C
35 ciclos
PCR
Eletroforese em gel de agarose
Visualização do DNA em luz 
ultravioleta
• Digestão 
• Purificação
3.Preparação do vetor
Plasmídeo Circular
Plasmídeo linear
Digestão com 
Enzimas de 
restrição
Extremidades coesivas
Fragmento 
de DNA -
inserto 
DNA 
plasmidial -
vetor
LIGASE
4. Ligação
5.Transformação da bactéria
5.Transformação da bactéria
5.Transformação da bactéria
EL
ET
R
O
P
O
R
A
Ç
Ã
O
6.Seleção dos clones recombinantes
Construção do DNA Recombinante
Molécula de DNA de 
um plasmídeo circular
Clivagem com 
enzima de 
restrição
Molécula de DNA de um plasmídeo 
linear com extremidades coesivas
anelamento
Ligação covalente 
pela DNA ligase
Molécula de DNA 
plasmidial contendo 
o inserto 
Inserção em 
uma célula 
hospedeira
Extração de DNA de L. interrogans
Leptospira interrogans meio EMJH Extração de DNA
PCR
94ºC – 5 min
94ºC – 1 min
50ºC – 1 min
72ºC – 1 min
72ºC – 7 min
30 ciclos
lipL32
768 pb
Primer RPrimer F
PCR Clonagem em Vetores 
de expressão
Transformação E. coli
Seleção dos Clones 
recombinantes
768 pb
Triagem
Digestão
Construção dos Vetores
lipL32 
768 pb
Extração
Expressão de Proteínas Recombinantes
Purificação da 
Proteína
Cultura de 
Células
Transformação da E. 
coli
pAE
2831 bp
rAmpicilina
6X His
f1 ori
oriE
Promotor T7
BamHI (137)
HindIII (178)
XbaI (59)
Purificação de proteínas recombinantes
Ligação
Transformação por 
Eletroporação
E. Coli DH5
Extração de DNA 
plasmidial
pLysS
codon pluss
SI
DE3
Transformação por Choque 
Térmico
Cepas de E. coli para 
expressão de proteínas
pAE/LipL32
3547 bp
AmpR
LipL32
6x His
f1 ori
pUC ori
pT7
Bam H I (468)
Eco R I (887)
Hin d III (894)
Xba I (59)
Xho I (131)
E. coli (BL21)
SDS-PAGE
SDS-PAGE (Eletroforese de proteínas)
Expressão em diferentes cepas de E.coli
Expressão de Proteínas Recombinantes
1 2 3 4
30kDa
1. BENCHMARKTM Protein Ladder em
kDa
2, 3 e 4. LipL32 purificada (eluições).
Gel de poliacrilamida 15%.
Purificação de Proteínas Recombinantes
Akta Prime
APLICAÇÕES
VACINAS RECOMBINANTES
1. PCR
2. Clonagens
3. Multiplicação
Proteína Recombinante
4. Vacinação
lipL32
7 68 bp
LipL32 0906
Primer RPRIMER F
Bam HI (342) Hin dIII (7 61 )Xba I (4)
Vetor 
Plasmidial
Vetor 
Plasmidial
Vetor 
Plasmidial
Vetor 
Plasmidial
Vetor 
Plasmidial
L. interrogans
pAE
Vetor 
Plasmidial
Vetor 
Plasmidial
Vetor 
Plasmidial
Vetor 
Plasmidial
Vetor 
Plasmidial
Vetor 
Plasmidial
Vetor 
Plasmidial
Vetor 
Plasmidial
Vetor 
Plasmidial
Vetor 
Plasmidial
Vetor 
Plasmidi
al
Vetor 
Plasmidi
al
Vetor 
Plasmidi
al
Vetor 
Plasmidi
al
Vetor 
Plasmidi
al
Vetor 
Plasmidi
al
Vetor 
Plasmidi
al
Vetor 
Plasmidi
al
Vetor 
Plasmidi
al
Vetor 
Plasmidi
al
Vetor 
Plasmidi
al
Vetor 
Plasmidi
al
pTARGET
pUS973
pUS974
pUS977
E.coli (BL21) E.coli TOP10 E.coli TOP10
Vacina de DNA BCGr
lipL32
ANIMAIS TRANSGÊNICOS
PLANTAS TRANSGÊNICAS