biologia molecular

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CLONAGEM DO DNA:
NOÇÕES BÁSICAS
Adrielly Rodrigues 
CLONAGEM MOLECULAR1.
Processo de construção de moléculas de DNA recombinante e
da sua propagação em hospedeiros apropriados que
possibilitam a seleção do DNA recombinante.
O U T R O S N O M E S :
DNA recombinante, clonagem gênica ou manipulação gênica
D N A R E C O M B I N A N T E
Inserto + Vetor de clonagem
C É L U L A H O S P E D E I R A
Introdução por transformação
CLONAGEM MOLECULAR1.
E N Z I M A S D E R E S T R I Ç Ã O
Endonucleases de restrição-
Reconhecem uma sequência de bases
específica na hélice dupla do DNA e
cortam ambas as fitas da hélice, em
lugares determinados
D N A - L I G A S E
Catalisa a formação de uma ligação
fosfodiéster entre as duas moléculas.
CLONAGEM MOLECULAR1.
Isolar o gene de interesse
CLONAGEM MOLECULAR1.
UNIR O GENE AO VETOR: DNA RECOMBINANTE
CLONAGEM MOLECULAR1.
TRANSFORMAÇÃO
CLONAGEM MOLECULAR1.
SELEÇÃO DOS CLONES RECOMBINANTES
CLONAGEM MOLECULAR1.
2. VETORES
Caracteristicas do vetor na clonagem gênica
Capacidade de replicar dentro da célula hospedeira, de maneira
que numerosas cópias da molécula de DNA recombinante
possam ser produzidas e transmitidas para as células-filhas
Sequências permitindo a sua replicação autônoma dentro da
célula hospedeira.
Um sítio único de clonagem
Sítio múltiplo de clonagem
Forma ideal com menos que 10 kb de tamanho
P L A S M Í D I O S
Plasmídeos são moléculas de DNA circular, de fita dupla,
extracromossômicas e que possuem capacidade de
replicação autônoma.
QUEM SÃO?
P L A S M Í D I O S
Os primeiros vetores desenvolvidos
Derivados de plasmídeos de bactérias e leveduras
Aumentam o seu número para centenas de cópias 
Transportam genes que são marcadores genéticos
auxotrófico, utilizados como forma de distinguir as células
hospedeiras que receberam o vetor daquelas que não
receberam.
Características
Mapas dos plasmídeos pUC18/19
O gene que codifica 
A origem de replicação 
Gene lacZ'
2.643 pb
resistência à ampicilina
do DNA plasmidial 
O B A C T E R I Ó F A G O Λ
QUEM SÃO?
 
São vírus de bactérias capazes de
replicação autônoma.
C A P S Í D E O + C A U D A + D N A
FAGO INFECTIVO
As proteínas do fago são
produzidas separadamente, a
partir do DNA viral que está
replicando.
Concatâmeros, que são formadas por uma série de genomas virais.
Sítios ou sequências cos (12 pb, devem ser repetidas a cada 35 a 50 kb)
Stuffer (do inglês to stuff rechear)
DNA exógenos
 
EMPACOTAMENTO DO DNA DO FAGO
 λEMBL4 
 Representação esquemática do vetor λEMBL4
O fragmento central (stuffer), de
14 kb, pode ser substituído por 
fragmentos de DNA de 9 a 24 kb.
C O S M Í D E O S
São plasmídeos bacterianos que possuem: uma origem de
replicação, uma marca de resistência a antibiótico, um ou
mais sítios de clonagem e as sequências cos do bacteriófago
lâmbida.
QUEM SÃO?
C O S M Í D E O S
 Usados preferencialmente em clonagem de fragmentos
maiores.
O reconhecimento de sítios cos requer segmentos de DNA,
de pelo menos 35 a 50 kb entre dois sítios cos adjacente.
Produz recombinantes, que podem ser empacotados nos
capsídeos do bacteriófago lâmbida e são utilizados para
infectar células de E. coli.
 VETOR
C R O M O S S O M O S A R T I F I C I A I S B A C T E R I A N O S
Permitem a clonagem de fragmentos longos (maiores
que 300 kb).
Origem de replicação de baixissima cópia (1)
Plasmídeo F. (genes par)
Fragmentos de DNA maiores que 300 kb podem ser
clonados no vetor e mantidos estavelmente na bactéria
hospedeira.
QUEM SÃO?
C R O M O S S O M O S A R T I F I C I A I S D E L E V E D U R A
Permitem a clonagem de fragmentos muito longos (100
kb a 1000 kb).
Plasmídeos (pYACs) que contêm marcadores genéticos
para seleção (TRP1 e NEO) e componentes funcionais de
um cromossomo eucariótico.
Elementos para a replicação autônoma (ARS)
Um centrômero (CEN).
Telômeros (TEL)
QUEM SÃO?
3. INTRODUÇÃO DO DNA RECOMBINANTE
EM BACTERIAS
Análise de características.
Transformação: absorção de fragmentos de DNA presentes
no meio.
Introdução da molécula de DNA recombinante em uma
célula que será replicada, produzindo muitas cópias da
molécula.
Existem inúmeros métodos para a introdução de DNA em
células hospedeiras 
TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA
Mandel e Higa, em 1970.
cloreto de cálcio
Bactérias
DNA
cloreto de cálcio
Bactérias
DNA
Transfectadas 
com DNA do 
bacteriófago 
Tratamento induz a um estado de “competência”.
105 -106 colônias transformadas por micrograma de DNA plasmidial.
Em E. coli com mais técnicas é aumentada de 100 a 1.000 vezes.
Glicerol 10%
Bactérias
DNA
TRANSFORMAÇÃO POR ELETROPORAÇÃO
Campo elétrico faz abrir pequenos poros na membrana celular e propicia a
entrada do DNA na célula.
Mais eficiente, pode chegar a 109 -1010 transformantes por micrograma de
DNA
Células tratadas em 
baixa concentração
 salina
TRANSFECÇÃO COM DNA DE FAGO
Gene bacteriano lamB (receptores)
Adsorção tanto em temperatura
ambiente como a 37ºC. 
Penetração e o cliclo lítico não
ocorre de forma eficiente em
temperatura ambiente.
Placas de lise
Maltose
SELEÇÃO DE TRANSFORMANTES
Marca de seleção no plasmídeo
Nova característica para a célula
DNA recombinantes (vetor com inserto) 
IDENTIFICAÇÃO DE RECOMBINANTES 
Moléculas de vetor que se religaram (vetor vazio),
Não foram clivadas (vetor selvagem)
PCR 
Reação em cadeia da polimerase
Doenças infecciosas
Doenças genéticas
BIBLIOTECA DE DNA
Bibliotecas genômicas
Bibliotecas de cDNA 
BIBLIOTECA DE DNA
BIBLIOTECA DE DNA
Seleção de clones em bibliotecas
Seleção imunológica 
Seleção Artificial- Netflix
DICA DE SÉRIE
Créditos e imagens
Apresentadado por Adrielly Rodrigues, Rômulo
Rouseel e Samuel Santos, discentes do IFCE Paracuru.
ZAHA, A. (org) Biologia Molecular Básica. Artmed.
407p, 2014.