PRODUÇÃO DE ENZIMAS E OUTROS METABÓLITOS

Prévia do material em texto

PRODUÇÃO DE ENZIMAS E OUTROS METABÓLITOS 
Fontes de Enzimas Comerciais: vegetais, animais ou microrganismos; 
→ Extração de Ptns e Enzimas de Vegetais e Animais: as amostras podem ser suspensas em tampão ou 
congeladas em nitrogênio líquido. 
 
→ Papaína (Enzima vegetal do látex do mamão): 
incisões no mamão verde e coleta do látex → secagem do látex → papaína bruta → purificação → papaína 
 
→ Bromelina (Enzima vegetal do caule do abacaxi): 
prensagem do caule da planta → extrato bruto + 2 volumes de etanol resfriado (-10°C) → centrifugação + 
secagem → bromelina 
 
→ Quimosina (Enzima animal do 4º estômago de bezerros, ovelhas, cabras e camelos): 
trituração do abomaso de bezerro → extração com NaCl 5-10% → concentração através de ultrafiltração ou 
osmose reversa → quimosina 
 
→ Produção de enzimas microbianas: fontes de MO’s → amostras de solo, resíduos de alimentos, caldo de 
cana, água de rios, mares, fontes termais. 
→ Isolamento de MO’s amilolíticos: ágar nutriente + amilopectina + solução de iodo-KI 
→ Isolamento de MO’s produtores de proteases: meio contendo caseína + sais 
→ Isolamento de MOs produtores de gomas (polissacarídeos): meio contendo sacarose 
 
Biossíntese de Ptns ou Enzimas 
Genes Constitutivos → Enzimas constitutivas são produzidas o tempo todo → 
enzimas das vias metabólicas centrais são expressas em teor +/- constante pelas 
células de uma espécie ou organismo. 
 
→ Sítios de ligação para ptns que ativam ou 
reprimem a transcrição a partir de um promotor: 
 
 
 
 
 
 
Regulação de Expressão de Genes: 
→ Repressão de Genes: produtos ou metabólitos diminuem a concentração em respostas a um sinal molecular 
Ex.: meio de cultura com alta concentração de triptofano → bactéria não sintetiza o aminoácidos triptofano 
Excesso de metabólito: ocorre repressão dos genes que codificam enzimas que catalisam a biossíntese de 
triptofano. 
→ Indução de Genes: enzimas induzíveis são aquelas que aumentam a concentração em resposta a presença 
de indutor 
Ex.: meio de cultura contendo indutor lactose → E. coli produz β-galactosidase 
meio de cultura sem lactose → E. coli não produz β-galactosidase 
 
Padrões Comuns de Regulação da Iniciação da Transcrição do DNA: 
a) Regulação negativa: repressor ligado inibe a transcrição 
b) Regulação positiva: ativador ligado facilita a transcrição 
 
 
→ Requerimento de nutrientes para o crescimento de MO’s: fontes de nitrogênio, íons inorgânicos, fatores de 
crescimento, água, agentes redutores e fontes de carbono e energia. 
→ Algumas bactérias e fungos requerem um ou mais nutrientes específicos para crescimento; 
→ Componentes de meios de culturas ricos em nutrientes: extrato de leveduras, de carne, de malte ou 
infusão de cérebro e coração. 
 
Produção de Enzimas por Fermentação Submersa: dependendo da estratégia de adição de substrato, a 
fermentação submersa (FS) pode ser dividida em: 
 
1) Fermentação em Batelada: todos os componentes do meio são adicionados na suba do fermentador e 
esterelizados. 
→ A fermentação em batelada pode não ser ideal para a produção da enzima ou de um metabólito 
quando ocorre a repressão catabólica devido a presença de glicose. 
 
2) Batelada Alimentada: alguns compostos são adicionados em pequenas quantidades em diferentes intervalos 
de tempo durante a fermentação para atingir as necessidades metabólicas de crescimento da cultura → o 
substrato é mantido em concentração mínima por adição intermitente para evitar a repressão da síntese ou 
inibição. 
→ Rendimento dos metabólitos (enzima, aminoácidos, ácidos orgânicos, antibióticos) na fermentação 
em batelada alimentada é superior ao método de batelada. 
 
3) Fermentação Contínua: o meio nutriente líquido esterilizado é adicionado continuamente enquanto um 
volume equivalente é retirado. 
→ Fatores que devem ser monitorados: agitação, oxigênio dissolvido, pH, temperatura. 
 
Classificação das Enzimas Microbianas quanto a Localização ou Excreção: 
extracelulares (são sintetizadas e excretadas), intracelulares (citosol) e ligadas à 
célula (espaço periplásmico). 
 
→ Produção de Enzimas Extracelulares por Fermentação de fungos: 
farelo de trigo:água [proporção 1:1 (p:v)] + Fungo → incubação por 72 h a 30°C → 
extração com 100mL de água destilada → filtrado = extrato enzimático bruto 
→ Fermentação em estado sólido: o rendimento da enzima é maior do que na 
fermentação submersa. 
 
→ Extração de Enzimas Microbianas ligadas à célula e intracelulares: 
bactérias, fungos e leveduras apresentam parede celular com diferente estrutura e 
composição. A tabela ao lado apresenta os principais constituintes da parede celular de 
MO’s. 
 
 
 
 
 
→ Lise Enzimática de Bactérias: lisozima → hidrolisa as ligações β-1,4 glicosídicas do mucopeptídeo da 
parede celular de bactéria (fonte: clara de ovos). 
→ Bact. Gram+ são mais susceptíveis à lisozima do que Bact. Gram-. 
→ Aplicação de Lisozima em Lacticínios: Clostridium tyrobutyricum é formador de esporos e pode não 
ser totalmente eliminado com a pasteurização → a lisozima destrói as células vegetativas e também inibe o 
crescimento de esporos no queijo. 
→ Outras aplicações de lisozima: controlar defeitos na textura (formação de rachaduras e buracos 
irregulares) em queijos, devido a fermentação butírica (Clostridium tyroibutyricum). 
 
→ Aplicações de enzimas líticas de bactérias que lisam leveduras: 
→ preparação de protoplastos, fusão de células e transformação de leveduras; 
→ obtenção de enzimas intracelulares, lipídeos e polissacarídeos; 
→ Produção de extrato de levedura; 
→ Extração de pigmentos de leveduras vermelhas; 
→ pré-tratamento para rompimento mecânico de leveduras com Dyno Mill - Moinho de Bolas: câmara 
horizontal preenchida de pérolas de vidro e um eixo com discos que auxilia na rotação dessas pérolas. As 
pérolas de vidro rompem as células por uma combinação de grande atrito e impacto com as células → útil 
para rompimento de fungos e MO’s filamentosos (menos susceptíveis a entupimento). 
→ Homogeneizador de Alta pressão → responsável pela lise a células pela prensagem da suspensão celular 
e liberação repentina da pressão. 
 
Aplicação de enzimas na indústria de alimentos: 
1) Panificação: melhoramento de farinha, estabilidade da massa melhoramento da textura, volume e cor, 
prolongamento da maciez da crosta e prolongamento do frescor dos pães. 
→ Enzimas: ɑ-amilase fúngica, ɑ-amilase maltogênica, xilanase, glicoamilase, glicose oxidase, lipase, 
lipoxigenase e transglutaminase. 
2) Laticínios: coagulação do leite, redução da alergenicidade do leite (proteases), melhoramento do flavor, 
aceleração da maturação de queijos (lipases), melhoramento das propriedades funcionais dos produtos lácteos 
(transglutaminase), hidrólise da lactose. 
→ Enzimas: proteases (quimosina, pepsina, renina fúngica), lipases, esterases, lactase ou β-galactosidase, 
transglutaminase, aminopeptidase, lisozima e lactoperoxidase. 
 
3) Bebidas não alcoólicas (sucos de frutas, refrigerantes e xaropes, café, chá): clarificação, liquefação 
maceração, aumento do rendimento, extração de compostos de aroma, remoção de compostos amargos. 
→ Enzimas: pectinases, amilases, celulases, naringinase e limonoato desidrogenase. 
 
4) Bebidas alcoólicas (cerveja, vinho, bebidas destiladas): hidrólise do amido de cevada não germinada e 
outros cereais e clarificação, digestão da parede celular de cereais e outras partes de plantas durante extração 
de compostos de cor, aroma e gosto e aumento do rendimento. 
→ Enzimas: ɑ-amilases, β-amilases, pululanases, proteases, xilanases e pentosanases.