(1) EXERCÍCIO MICROBIOLOGIA CLÍNICA FARMÁCIA NOITE FAR3CN-GJB 2021-1

Prévia do material em texto

EXERCÍCIO 1 
1. Em um esfregaço de secreção de pele foi realizada a coloração pelo método de GRAM e foram visualizados bastonetes Gram-positivos. Considerando a reação tintorial dessa bactéria, descreva a estrutura da sua parede e os princípios desta coloração.
A técnica de Gram, também conhecida como coloração de Gram, é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853-1938), em 1884, o qual permite diferenciar bactérias com diferentes estruturas de parede celular a partir das colorações que estas adquirem após tratamento com agentes químicos específicos. O método consiste em tratar sucessivamente um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina básica. As bactéricas que adquirem a coloração azul violeta são chamadas de Gram-positivas e aquelas que adquirem a coloração vermelho são chamadas de Gram-negativas.
2. Considerando a coloração de Gram é correto afirmar, EXCETO:
Questão A
a) permite o resultado presuntivo do agente infeccioso
b) o fundamento da reação é baseado nos componentes de parede celular
c) apenas bactérias são visualizadas na coloração 
d) a quantidade de micro-organismos na amostra biológica interfere no resultado
e) para otimização da metodologia é imprescindível um esfregaço homogêneo
Questão B
a) tem valor preditivo positivo
b) direciona o tratamento empírico em algumas situações, tais como líquor
c) grandes volumes devem ser centrifugados e usado o sedimento para o esfregaço
d) o controle de qualidade dos corantes é indispensável
e) classifica as bactérias em Gram positiva e Gram negativa segundo a afinidade a 
fucsina
3. Em relação aos meios de cultura relacionados abaixo, fale sobre a classificação, para que se destina este meio e suas características, e um breve relato sobre o funcionamento deste meio:
a) Meio de Stuart: O meio Stuart estéril é utilizado para transportar vários materiais biológicos como secreções, raspados e biópsias. Além do transporte, o Stuart realiza a conservação de microrganismos patogênicos do gênero Neisseria, Haemophilus, Streptococcus, entre outros, e também fungos e protozoários.
b) Ágar MacConkey:  Ágar MacConkey é considerado um dos primeiros meios de cultivo para bactérias gram negativas indicando a fermentação por lactose. Recomenda-se a utilização do Ágar MacConkey em amostras clínicas que contenham microbiota mista, como urina, fezes, feridas e secreções
c) Meio de Tioglicolato de sódio: O Meio Tioglicolato é usado para testes de esterilização de biológicos e para o cultivo de organismos aeróbicos, anaeróbicos e microaerófilos. pH Final (a 25ºC): 7,1 ± 0,2. comumente usado para analisar a esterilidade do sangue armazenado em bancos de sangue
d) Ágar Chocolate: O Agar Chocolate é indicado para cultivo de microrganismos fastidiosos. Sua base é rica em nutrientes, suplementado com hemácias de carneiro lisada e vitaminas do complexo B. Que proporcionam o crescimento de uma ampla variedade de microrganismos de interesse clínico.
e) Ágar CLED ou Brolacin: O BD CLED Agar (Agar de cistina lactose deficiente em electrólitos) é um meio de cultura para diferenciação para utilizar no isolamento e enumeração de bactérias da urina.
4. Marque F (Falso) ou V (Verdadeiro):
(V) O calor úmido é largamente utilizado como método de esterilização no laboratório de Microbiologia.
(V) O setor de Microbiologia se enquadra no nível de segurança 2 , excluindo a manipulação de Mycobacterium (nível 3). 
(V) A coleta de amostras biológicas é uma etapa crítica e deve ser realizada por profissionais capacitados.
(F) O transporte de amostras biológicas não impacta na viabilidade dos micro-organismos.
(F) Apenas com Ágar Sangue e Ágar MacConckey conseguimos isolar todos os principais agentes infecciosos na rotina de Microbiologia Clínica.
(V) Placas e tubos com meio de cultura onde foram plantados os materiais clínicos, em incubação em temperatura e atmosfera adequadas, devem ser examinadas após 18 a 24 horas.
5. Sobre os meios de cultura utilizados na rotina dos laboratórios de microbiologia clínica, é CORRETO afirmar:
a) Ágar sangue azida ou Ágar Columbia, utilizado no isolamento de Sthaphylococcus e Streptococcus, é um meio seletivo para bactérias Gram positivas.
b) Ágar S.S. é um meio diferencial e seletivo para Sthaphylococcus e Streptococcus.
c) Ágar sangue é considerado um meio complexo e seletivo utilizado na identificação de espécies do gênero Streptococcus.
d) Ágar MacConkey é um meio seletivo e diferencial utilizado para identificar bactérias Gram positivas fermentadoras ou não de lactose.
e) Ágar Sabouraud é utilizado para isolamento de bactérias e fungos.
6. Faça a associação correta entre os meios de cultura e suas características:
A) Meio de Stuart 2
B) Ágar MacConkey 1
C) Meio de Tioglicolato de sódio 3
1. O cristal violeta inibe o crescimento de micro-organismos Gram positivos, especialmente enterococos e estafilococos.
2. É um meio de cultura utilizado para transporte de materiais. Ele conserva micro-organismos como Pneumococos, Salmonella spp, Shigella sppe outros.
3.  É um meio altamente nutritivo e versátil, de enriquecimento, utilizado para a cultura de micro-organismos anaeróbios, microaerófilos e aeróbicos em vários espécimes clínicos.
a) A1, B2, C3
b) A3, B1, C2
c) A2, B3, C1
d) A3, B2, C1
e) A2, B1, C3 
7.Meio de cultura sólido, muito utilizado em Microbiologia Clínica, considerado um meio seletivo e diferencial, devido permitir o crescimento apenas de bacilos Gram-negativos, inibindo totalmente o crescimento de bactérias Gram-positivas. Isso se refere ao:
a ) Ágar Cled;
b) Ágar Mac Conkey; 
c) Ágar Mueller Hinton; 
d) Ágar Sangue; 
e) Meio de Rugai.
8. As bactérias Gram negativas são divididas em 2 grandes grupos. Vocês irão estudar estes dois grupos. 
a) Quais são estes grupos?
 Bactérias que fermentam glicose e as bactérias que não fermentam. 
b) Qual a prova bioquímica é utilizada para classificação dos grupos? 
Ausência de produção de ácido em meios que contém açúcares. Reação citocromo oxidase positiva, quando oxidase é positiva deve-se suspeitar de não fermentador, excluir as enterobactérias (exceto a Plesiomonas shigelloides) e não esquecer que alguns não fermentadores são oxidase negativa. Ausência de crescimento em meio Ágar MacConkey (alguns gêneros), mas que crescem em Ágar Sangue.
c) Como é feita a prova e sua leitura? 
Avaliação do crescimento nos meios de plantio primário, Coloração de Gram, Teste da citocromo oxidase, Prova da Enzima Citocromo – Oxidase,
9. Após assistir o filme Epidemias/bactéria fatal (link acima e enviado por e-mail) resolva as questões: 
a) Faça uma breve introdução sobre as cepas de Escherichia coli enteropagênicas.
A Escherichia coli é uma bactéria pertencente à família Enterobacteriaceae, sendo amplamente distribuída na natureza, tendo como principal habitat o trato intestinal humano e animal. A Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) foi a primeira categoria de E. coli reconhecida como diarreiogênica e ainda hoje está associada a casos esporádicos e surtos de diarreia infantil. a EPEC foi classificada em duas subcategorias: EPEC típica (EPEC-t) e atípica (EPEC-a). As EPEC-t são identificadas pela presença do gene eae (EPEC attaching and effacing) e plasmídio EAF (EPEC adherence factor). As EPEC-a apresentam o gene eae, porém são desprovidas do plasmídio EAF. Tanto EPEC-t como EPEC-a devem ser desprovidas do gene stx (Shiga toxina) que caracteriza a STEC/EHEC.
b) Descreva objetivamente sobre a E. coli do filme EHEC (enterohemorrágica), características microbiológicas, fatores de virulência e patogenicidade, sintomas clínicos, epidemiologia, surtos já descritos no mundo. Diagnóstico laboratorial: isolamento, identificação, testes sorológicos. 
 A Escherichia coli, é uma bactéria gram-negativa, anaeróbica facultativa, pertencente à família Enterobacteriaceae. E. coli pode ser agrupada em categorias distintas, levando em consideração o conjunto de genesque caracterizam sua patogenicidade.
 A principal via de infecção dos humanos é pelo consumo de alimentos e água contaminados, porém também pode haver infecção direta entre pessoas pela via fecal-oral, o que ocorre com menor frequência. Essa última via tem maior relevância entre familiares infectados, manipuladores de alimentos, unidades prestadoras de serviços e à população e indivíduos com hábitos inadequados de higiene (JAY, 2005). Resíduos de humanos ou animais também são potenciais fonte de infecção (CDC, 2014). Vários alimentos podem veicular EHEC, sendo a carne e o leite os mais envolvidos. E. coli O157:H7 é a variante da bactéria que mais ocasiona colite hemorrágica, cujo principal reservatório natural é o trato gastrointestinal da espécie bovina. Assim, durante o abate, o extravasamento intestinal e o contato das vísceras com a carne ou com a superfície de equipamentos podem resultar em contaminação cruzada.
 A infecção por EHEC tipicamente começa de forma aguda com cólicas abdominais intensas e diarreia aquosa que podem se tornar muito sanguinolentas em 24 h. Alguns pacientes informam diarreia “inteiramente de sangue e sem fezes”, o que deu origem ao termo colite hemorrágica. Febre, geralmente ausente ou baixa, pode alcançar 39° C, ocasionalmente. A diarreia pode durar de 1 a 8 dias em infecções não complicadas.
 As EHEC têm como fator principal de virulência a toxina Shiga (Stx) ou toxina “Shigalike” (SLT), denominada dessa forma devido à similaridade com a toxina da Shigella dysenteriae. Outro fator de virulência importante para a caracterização de EHEC é a presença da ilha de patogenicidade LEE (locus of enterocyte effacement), com genes responsáveis pela formação de A/E, como em EPEC. EHEC possui a mesma LEE de EPEC, porém o mecanismo de formação da estrutura semelhante ao pedestal é ligeiramente distinto das EPEC: não ocorre fosforilação de Tir pela célula hospedeira, a formação de pedestal é independente de Nck, o rearranjo de actina é mediado por TccP (Tir cytoskeleton-coupling protein), que se liga ao Tir por meio de proteínas da célula alvo IRTKS (insulin receptor tyrosine kinase substrate), que interage com N-WASP para ativar o complexo.
 Em 2011, houve uma grande epidemia causada por um sorotipo raro de E. coli patotipo STEC e sorotipo O104:H4, envolvendo mais de 4.000 pessoas em 16 países europeus, a infecção foi transmitida por brotos de feijão crus contaminados.
 O diagnóstico é baseado no cultivo e identificação da bactéria por métodos moleculares, fenotípicos e sorológicos, a partir de amostras de fezes e de alimentos dos pacientes infectados. Quando se utiliza o método tradicional de cultivo, as amostras de fezes devem ser inoculadas em ágar-McConkey com a inclusão do carboidrato D-sorbitol, que tem fermentação lenta ou praticamente nula pela bactéria. Outra forma de confirmar a ação citotóxica da EHEC, é pela demonstração da ação da toxina em culturas de tecidos (células VERO), porém é um método trabalhoso para se executar.
  O sorotipo de EHEC mais conhecido e de maior importância para seres humanos é o O157:H7, responsável por surtos de diarreia sanguinolenta, colite hemorrágica e síndrome hemolítico urêmica. E. coli O157:H7 é a principal causa de colite hemorrágica e síndrome hemolítico urêmica nos Estados Unidos, Canadá, Grã-Bretanha e Europa
c) Discuta o papel da biologia molecular nestes diagnósticos.
Testes com o DNA prova se as estirpes são as mesmas.
Depois da extração do DNA, as amostras seriam submetidas à reação de PCR utilizando iniciadores específicos para os genes stx1, stx2, eltI e eae que codificam para Toxina Shiga ou shiga-like, toxina LT e intimina, respectivamente. As reações de PCR seriam realizadas utilizando o DNA das linhagens de referência EPEC ATCC 0127ª, EHEC ATCC 933, ETEC UNICAMP como controles positivos e E. coli ATCC 25723 como controle negativo.
d) Discutir o tratamento do paciente nestes casos do filme: uso de antibiótico?? 
A base do tratamento para ECEH é de suporte. Embora E. coli seja geralmente sensível à maioria dos antimicrobianos usados, antibióticos não mostram alívio dos sintomas, redução dos portadores do microrganismo, ou prevenção da síndrome hemolítico-urêmica. Suspeita-se que fluoroquinolonas aumentem a liberação de enterotoxina e o risco de síndrome hemolítico-urêmica.
A ingestão de antibióticos não é eficiente, pois mata a bactéria mas a faz expelir toxinas que estando viva não liberaria e são essas toxinas que podem causar sérios danos aos rins e ao cérebro.
Na semana após a infecção, pacientes em alto risco de desenvolver síndrome hemolítico-urêmica (p. ex., crianças < 5 anos de idade, idosos) devem ser observados com relação a sinais precoces de proteinúria, hematúria, cilindros hemáticos e aumento de creatinina no soro. Edema e hipertensão desenvolvem-se mais tarde. Pacientes que desenvolvem complicações provavelmente necessitam de cuidados intensivos, inclusive diálise e outras terapias específicas, em um centro médico terciário.
e) Discuta brevemente sobre coprocultura – exame microbiológico indicado para diagnóstico de infecções intestinais, que vcs estudarão em uma próxima aula.
A cultura de fezes identifica micro-organismos enteropatogênicos em casos de diarréia 
aguda ou crônica. São consideradas indicações de coprocultura: diarréia sanguinolenta, 
febre, tenesmo, sintomas severos e persistentes, presença de leucócitos fecais e história 
de exposição a agentes bacterianos. Em nosso meio, as culturas são direcionadas para 
pesquisa de Salmonella spp, Shigella spp, alguns sorotipos de Escherichia coli e 
Campylobacter.
Outros agentes podem também ser pesquisados, mas é importante que sejam 
mencionados na solicitação médica