Enzimas de restrição DNA recombinante

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Enzimas de restrição (endonucleases 
de restrição)
Cortam a molécula de DNA em pontos específicos.
Geram fragmentos de tamanhos definidos.
Atuam como “tesouras moleculares”, reconhecendo sequências de pares de bases específicas em moléculas de DNA e cortando-as nesses pontos. 
3 Engenharia genética
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Enzimas de restrição (endonucleases 
de restrição)
Modo de ação da endonuclease de restrição Eco RI
3 Engenharia genética
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Enzimas de restrição (endonucleases 
de restrição)
Sequências de corte reconhecidas por algumas endonucleases de restrição
3 Engenharia genética
Sítios de corte da enzima
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Professor: a tabela mostra as sequências de corte reconhecidas por algumas endonucleases de restrição. O nome das enzimas compõe-se das iniciais do nome da espécie e, às vezes, da sigla da linhagem da bactéria que a produz.
Separação eletroforética de fragmentos de DNA
Esquema da técnica de eletroforese
3 Engenharia genética
Placa de gel no interior
da qual se realiza a
“corrida” entre fragmentos
de DNA de cada amostra.
Fenda no gel que contém
a mistura de fragmentos
de DNA de uma amostra.
Fragmentos de DNA cortados em diferentes
tamanhos pela enzima de restrição.
Os fragmentos menores de cada amostra chegam
na frente na corrida eletroforética. Quanto mais
próxima do polo positivo está a faixa, menores os
fragmentos de DNA que ela contém.
Quanto mais espessa a faixa, maior número de
fragmentos de determinado tamanho ela contém.
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Professor: a técnica de eletroforese permite separar pedaços de DNA cortados por uma enzima de restrição. Cada tipo de DNA analisado produz um padrão de faixas característico.
Identificação de 
pessoas pelo DNA
Esquema da detecção de VNTRs
3 Engenharia genética
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Professor: uma dessas técnicas baseia-se na detecção de trechos altamente variáveis do DNA humano. Essas regiões, conhecidas pela sigla VNTR, iniciais da expressão inglesa variable number of tandem repeats (número variável de repetições em sequência), são constituídas por trechos curtos, de até algumas dezenas de pares de nucleotídios, que se repetem ao longo de trechos da molécula de DNA. É o número dessas repetições que varia entre as pessoas, daí esses trechos serem chamados de VNTRs.
3 Engenharia genética
Genética na atualidade: 
Identificação de pessoas pelo DNA
 
Clique na imagem abaixo para ver a animação.
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Professor: utilize a animação para demonstrar aos alunos como identificar pessoas pelo DNA. 
Identificação de pessoas pelo DNA
Foto dos padrões de VNTRs de quatro pessoas envolvidas em um teste de paternidade: (C) criança; (M) mãe da criança; (P1 e P2) suspeitos de serem o pai.
3 Engenharia genética
REPRODUÇÃO
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Professor: com base na estimativa da frequência de cada tipo de VNTR na população e do número utilizado em diagnóstico (três, em nosso exemplo), pode-se estimar o grau de confiabilidade do teste − em geral bastante alto, ultrapassando os 99,9%.
Esquema da técnica de clonagem molecular
Clonagem molecular 
do DNA
3 Engenharia genética
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Professor: a bactéria hospedeira com o DNA recombinante nela introduzido multiplica-se, originando um clone com cópias idênticas desse DNA.
Expressão de genes em bactérias
Esquema da clonagem do gene da insulina
3 Engenharia genética
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Professor: na imagem, segmentos de DNA com código da insulina humana são ligados a DNA de plasmídios em bactérias, fazendo-as produzir o hormônio humano. 
Organismos que recebem e incorporam genes de outra espécie.
A técnica da transgenia: 
injeção de DNA de uma espécie em ovos de outra.
Organismos transgênicos
Esquema das etapas de produção de um rato transgênico
3 Engenharia genética
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Professor: com o desenvolvimento das técnicas de manipulação do DNA, há a perspectiva de que certas doenças hereditárias humanas possam, futuramente, ser curadas pela substituição dos genes defeituosos das células, procedimento conhecido como geneterapia.
Transgênicos entre animais e plantas
Esquema da produção de uma planta transgênica bioluminescente de tabaco
3 Engenharia genética
CORTESIA DO PROF. DONALD R. HELINSK/
UNIVERSIDADE DA CALIFÓRNIA
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Professor: nos últimos anos, os transgênicos de plantas tornaram-se amplamente conhecidos da população, principalmente em razão das polêmicas sobre o plantio de uma variedade transgênica de soja. Essas plantas receberam um gene que confere resistência a determinados herbicidas, substâncias utilizadas para matar as ervas daninhas que crescem nos campos cultivados. Com isso, os agricultores podem utilizar herbicidas para matar todas as outras plantas, menos a soja transgênica; com a eliminação das plantas competidoras, aumenta a produtividade da lavoura de soja.
O milho bt tem incorporado em seu genoma um gene da bactéria Bacillus thuringensis, que produz uma substância tóxica aos insetos, mas inofensiva aos mamíferos. Essa linhagem de milho é resistente ao ataque de insetos. Embora liberada para a alimentação do gado, não é utilizada para consumo humano.
O Projeto Genoma Humano
Objetivo:
Determinar a sequência de todos os nucleotídios do 
DNA humano.
Identificar todos os genes de nossa espécie.
O genoma humano é constituído por:
Cerca de 3 bilhões de pares de nucleotídios, distribuídos nos 24 cromossomos (22 autossomos e os sexuais X e Y).
Apenas 3% dos 3 bilhões de pares de bases do genoma humano correspondem a genes.
97% são sequências não codificantes. 
O número total de genes humanos é cerca de 25 mil.
3 Engenharia genética
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Professor: não é a quantidade de genes que faz a diferença e sim como eles funcionam integradamente, entre si e com o ambiente. O sequenciamento do DNA humano revelou que muitos de nossos genes são semelhantes aos de bactérias e de vírus.
No Brasil, o primeiro genoma a ser totalmente sequenciado foi o da bactéria Xillela fastidiosa, causadora de uma doença dos laranjais, conhecida como amarelinho. Outros projetos semelhantes têm sido desenvolvidos em diversos estados brasileiros, com auxílio de agências federais e estaduais de financiamento de pesquisas. 
Aconselhamento genético
Orientação sobre os 
riscos de casais virem a 
ter filhos com alguma 
doença hereditária, pelo 
estudo dos heredogramas.
Relação entre a idade materna e a geração de crianças com síndrome de Down
4 Aplicações do conhecimento genético
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Identificação de portadores de alelos deletérios
Alelos deletérios: causam doenças ou diminuem 
a taxa de sobrevivência ou de reprodução de um organismo.
Muitos alelos deletérios surgem por mutações de 
alelos normais e comportam-se como recessivos.
Atualmente já é possível, em relação a algumas doenças genéticas, descobrir se uma pessoa é portadora ou 
não de um alelo deletério recessivo em condição heterozigótica.
4 Aplicações do conhecimento genético
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Consanguinidade
Casamentos consanguíneos aumentam a probabilidade de 
alelos deletérios recessivos encontrarem-se e originarem 
uma pessoa homozigótica doente. 
4 Aplicações do conhecimento genético
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Professor: diversas culturas têm leis que proíbem ou desaconselham o casamento entre parentes próximos. Essas leis surgiram, provavelmente, da observação empírica de que defeitos presentes ao nascer são mais comuns nos casamentos entre parentes. Problemas causados por casamentos consanguíneos também podem ser observados nos animais domésticos e de zoológico, cuja pequena quantidade leva parentes próximos a serem cruzados entre si.
Diagnóstico pré-natal
Amniocentese 
 Técnica rápida, precisa e de pouco risco para mãe e filho
 Análise de fetos entre a 15a e a 18a semana de gravidez
4 Aplicações do conhecimento genético
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Diagnóstico pré-natal
Amostragem vilo-coriônica 
Permite diagnosticar doenças hereditárias entre a 8a e a 11a semana de gravidez. 
4 Aplicações do conhecimento genético
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Professor: a operação de retirada de amostras de vilosidades coriônicas causa aborto do embrião em cerca de 1% dos casos. Por isso, esse tipo de diagnóstico é empregado apenas quando há alto risco de doença genética, o que podejustificar sua identificação precoce para um eventual aborto terapêutico. 
Melhoramento genético
Seleção e aprimoramento das qualidades das espécies
tendo em vista sua utilização pelos seres humanos.
Inicialmente era feita de forma intuitiva (se agricultor desejava obter espigas de milho com maior número de grãos, plantava apenas sementes de espigas com grande número de grãos).
As raças Briard (à direita) e Grande Azul de Gasconha (acima) foram obtidas por meio de seleção realizada pelos criadores.
Couve, couve-de-bruxelas, brócolis, couve-flor e repolho são variedades da espécie Brassica oleracea obtidas por seleção artificial.
4 Aplicações do conhecimento genético
FABIO COLOMBINI
CID
CID
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Heterose ou vigor híbrido
Em 1909, o geneticista norte-americano George H. Shull (1874-1954) descobriu que o cruzamento de duas determinadas variedades de milho produzia plantas mais vigorosas, resistentes a doenças e com espigas maiores e mais uniformes que as das variedades parentais. 
Esquema dos cruzamentos utilizados na obtenção do milho híbrido
4 Aplicações do conhecimento genético
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Professor: híbrido é um termo utilizado também para designar o produto do cruzamento entre linhagens diferentes de uma mesma espécie. 
Problemas decorrentes do melhoramento
Obtenção de linhagens com pouca variabilidade genética
Irlanda, meados do século XIX: uma doença causada por fungos dizimou praticamente todas as plantações de batata e, como resultado, a morte de milhões de pessoas em decorrência da fome.
Plantação de milho
Plantação de soja
4 Aplicações do conhecimento genético
MAURÍCIO SIMONETTI/PULSAR IMAGENS
CARLOS CRIADO/SHUTTERSTOCK
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Professor: as culturas de milho foram recuperadas com a introdução de um alelo para resistência ao fungo, obtido em uma variedade de milho nativa da Colômbia.