Relatório de aula prática - PCR

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Curso: Biomedicina
Disciplina: Biologia Molecular
REAÇÃO DA POLIMERASE EM CADEIA
Goiânia, 2019.
1. Introdução
O DNA é um hélice de dupla fita, composta por nucleotídeos complementares.
Sua replicação é semiconservativa, semidescontínua e segue a direção 5’ – 3’. Ambas as
fitas são lidas, e o objetivo é gerar duas novas moléculas filhas a partir de uma mãe. 
A sigla PCR significa Polymerase Chain Reaction (em tradução: reação em
cadeia da polimerase), cujo princípio é a amplificação de um molde de DNA por meio
de componentes sintéticos do replissomo de um segmento específico de um genoma.
Kary B. Mullis foi o responsável pela criação da técnica PCR, onde por meio de
alterações na temperatura o DNA altera também a sua estrutura e guia a ação dos
componentes da PCR. O método demanda alguns elementos na reação, um deles é o
próprio genoma a ser analisado que servirá de molde para a replicação, além disso serão
usados iniciadores e polimerases específicos e nucleotídeos livres. Esse molde de DNA
pode ser extraído de qualquer célula de um organismo.
Para que ocorra a replicação o ambiente natural em que ela ocorreria é simulado,
ou seja, deve-se ser feito em meio aquoso. Assim, um aumento na temperatura (92ºC)
condiciona desnaturação da molécula, o que é necessário visto que não haverá helicases.
A 60ºC terá uma temperatura ótima para o oligonucleotídeo sintético iniciador se ligar
no local de interesse, delimitando o local a ser replicado, essa etapa consiste no
anelamento do iniciador. Posteriormente, a 72ºC inicia-se a adição das fosfodiésteres
pela DNA polimerase (Taq polimerase), o que consiste na etapa de extensão da fita. 
Assim, descobriu-se que repetindo esse ciclo de alterações na temperatura seria
possível gerar cópias do fragmento alvo em escala exponencial, gerando milhões delas.
Dessa forma, o termociclador realiza essa mudança diversas vezes, entregando como
resultado essas cópias após algum intervalo de tempo e diversos ciclos.
A quantificação do número de fitas obtidas ao final do processo é feita por
eletroforese, cujo princípio é a dosagem final do fluoróforo intercalante, no caso desse
experimento o Gel Red. Ele se liga na fita dupla por ter afinidade com as pontes de
hidrogênio e só passa a refletir luz quando intercalado com sucesso nas novas fitas
produzidas, caso o resultado seja positivo e haja a replicação do fragmento alvo. 
2. Objetivos
Realizar a PCR de uma amostra de DNA relatando e identificando suas etapas, 
elementos, resultados e princípios.
3. Metodologia
3.1. Confecção e montagem no suporte do gel de agarose 0,8%
Foram pesados 0,4 gramas de agarose em um vidro erlenmeyer e em seguida
adicionados 50 ml de tampão contendo Tris, EDTA e ácido bórico (tampão TEB).
Levou-se a solução de agarose e tampão ao micro-ondas por intervalos de 10 em 10
segundos até que todo o precipitado de agarose desaparecesse completamente do frasco.
Resfriou-se a solução até aproximadamente 60ºC, cujo parâmetro era uma
temperatura suportável ao antebraço. Posteriormente, foram pipetados 6 µL de corante
Gel Red em um copo descartável de plástico para que então fosse vertido o conteúdo de
agarose e tampão de uma só vez no copo descartável contendo o corante. 
Homogeneizados os dois componentes, verteu-se também de uma só vez todo o
conteúdo do copo descartável no suporte para gel. Assim, foi fixado um pente na parte
superior do mesmo a fim de gerar as poças que serão preenchidas com a PCR depois de
solidificado o gel.
3.2. Pipetagem da reação de PCR
Com o uso de uma pipeta automática foram pipetados os seguintes reagentes
com as referidas quantidades no teste:
REAGENTE QUANTIDADE
Green Taq 5 µL
Primer sense 10 µMol 1 µL
Primer atsense 10 µMol 1 µL
DNA 1 µL
Água ultrapura 2 µL
Já no controle negativos foram pipetados os seguintes reagentes com suas
respectivas quantidades:
REAGENTE QUANTIDADE
Green Taq 5 µL
Primer sense 10 µMol 1 µL
Primer atsense 10 µMol 1 µL
Água ultrapura 3 µL
Nota-se que no controle negativo não haverá DNA, mas sim 1 µL a mais de água
ultrapura, a fim de completar os 10 µL necessários para padronização da quantidade de
ambas as soluções. Além disso, é importante salientar que a ponteira deve ser trocada a
cada pipetagem. Posteriormente, insere-se a solução em um spin para decantação rápida
das gotículas remanescentes nas laterais do recipiente contendo a PCR.
3.3. Ajuste do termociclador
O ajuste é feito diretamente na
interface do aparelho, onde um dos modelos
de teste foi selecionado e modificado com as
seguintes orientações de temperatura e tempo:
TEMPERATURA TEMPO AÇÃO
94ºC 2 minutos Desnaturação do DNA
94ºC* 20 segundos Desnaturação na ciclagem
60ºC* 20 segundos Anelamento dos primers
72ºC* 1,5 minuto Extensão da cadeia
72ºC 4 minutos Extensão final
4ºC Manter até a hora de aplicação no gel Conservação
O primeiro intervalo de 2 minutos a 94ºC é feito uma única vez, enquanto os
próximos ciclos (*) até o penúltimo de 72ºC por 1,5 devem ser repetidos por 35 vezes
(orientação inserida no aparelho). O intervalo de 4 minutos a 72ºC é feito após as 35
repetições e após esse período o termociclador manterá a solução a 4ºC até que esta seja
retirada dele. O processo duraria aproximadamente 1 hora e 30 minutos, dessa forma,
foram usadas outras amostras já prontas para inserção no gel e visualização em luz UV.
3.4. Aplicação das amostras em gel de agarose
Após cerca de 10 minutos com o gel já solidificado com uma pipeta automática
foram pipetados 2 µL de marcador de peso molecular em um dos poços de gel (gerados
anteriormente pela inserção do pente). Mais 3 µL de diferentes amostras foram inseridos
em cada um dos demais poços de gel.
3.5. Visualização em luz ultravioleta
Posicionada a placa de gel com as soluções nos poços na máquina de
eletroforese com 80 V por alguns minutos foi possível visualizar a amplificação de cada
uma das amostras e do marcador. 
4. Resultados e discussão
Na visualização por eletroforese foi obtido o seguinte resultado:
Figura 1: Visualização por eletroforese do gel de agarose, demonstrando duas amostras positivas, duas
negativas e a presença do marcador molecular.
Entende-se pelas imagens obtidas no aparelho que a marcação molecular foi
eficiente e consegue-se visualizá-la. Além disso, nas colunas 2 e 3 de amostra
evidencia-se presença de maior quantidade de agente intercalante entre as fitas de DNA
(Gel Red), responsável por gerar a fluorescência, uma maior amplificação do DNA
inserido na reação, dessa forma, os primers e DNAs polimerases inseridos na PCR
promoveram a replicação do fragmento alvo presente na amostra de DNA utilizada.
Assim, entende-se que as fitas mais amplificadas possuíam o DNA alvo,
portanto possuem resultado positivo na detecção destes e consequentemente a sua
replicação em milhões de cópias pelo sistema replissomo sintético da PCR. 
Outras duas fitas (1 e 4) não possuíam o fragmento alvo e estes não foram
amplificados, logo, não há fluorescência sobressalente, como pode ser observado nas
fotos acima. 
5. Considerações finais
1 2 3 4
1 2 3 4
Figura 2: Impressão do resultado obtido na 
eletroforese.
Fica evidente que a PCR é uma prática rentável e que entrega resultados
satisfatórios. Os processos simples da técnica desenvolvida por Kary B. Mullis
desempenham uma função importante em diversos ramos da ciência, seja na área
forense ou de diagnóstico laboratorial, por exemplo. 
Assim, tendo em vista o seu grau de especificidade é possível dizer que a PCR é
uma técnica eficiente no que visa e se feita com as devidas cautelas apresentará
resultados conclusivos. 
6. Referências bibliográficas
HENRY A. , Erlich. Basic Methodology.In: HENRY A. , Erlich (ed.). PCR 
Technology: Principles and Applications for DNA Amplification. Londres: Macmillan 
Publishers, 1989. cap. 1, p. 1-5. ISBN Online 978-1-349-20235-5. Site.