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2ª Edição - 2018 1 | A p o s t i l a P e r i t o C r i m i n a l APRESENTAÇÃO Olá! Meu nome é Leilane, tenho 23 anos e sou formada em Biomedicina pela Universidade Estadual de Maringá. Comecei a estudar para concursos de Perito Criminal em 2015, mas só consegui orientar bem meus estudos e estudar com disciplina a partir de 2016. Desde então, tenho percebido a enorme escassez de conteúdo específico para a minha área nos concursos de Perito Criminal. Há cursos online que abordam as matérias muito superficialmente, e livros de graduação que as abordam de uma forma muito aprofundada. Com o tempo, passei a compor meus próprios cadernos e resumos, tentando achar um “meio termo” que fosse suficiente para os concursos de Perito Criminal. Sempre guiei meus estudos me baseando nas questões de concurso anteriores, o que também era/é um desafio, já que são relativamente poucas questões e são difíceis de encontrar. Além de comprar livros específicos, sempre fiz muita pesquisa na internet, li artigos e vi vídeos para tentar encontrar determinados conteúdos. Com o instagram @concurseira_pc, percebi que muitas pessoas esbarravam nas mesmas dificuldades que eu. Em 2016 prestei meu primeiro concurso para Perito Criminal, que foi o da Polícia Civil do Distrito Federal. Fiquei empatada em 12º lugar com outras pessoas, dentre mais de 1600 candidatos. Com isso, percebi que embora tivesse minhas dificuldades em procurar materiais específicos, talvez estivesse no caminho certo. Comecei então a pensar em uma maneira de ajudar outras pessoas que estudam ou desejam estudar para essa área, e a ideia da apostila surgiu. Mais recentemente, em 2017, prestei o concurso da Polícia Científica do Paraná, e conquistei o 2º lugar, e 1ª lugar no concurso do Instituto Geral de Perícias do Rio Grande do Sul. Minha intenção com essa apostila não é esgotar todos os conteúdos de todos os editais, e sim fazer um “compilado” dos assuntos mais cobrados. Tão pouco almejo ser referência nos assuntos mencionados, já que tão somente trouxe referências de livros já consagrados, que vêm sido cobrados em concursos. Tentei explicar os assuntos objetivamente, mas de uma forma que alguém que nunca tenha estudado essas matérias também possa entender. Além disso, coloquei várias questões de concursos para treino no final de cada capítulo. Na segunda edição, os capítulos de Biologia Molecular, Técnicas em Biologia Molecular e Genética Forense foram expandidos, e os capítulos de Entomologia Forense, Tricologia Forense, e Hematologia Forense adicionados. Basicamente, tudo que eu já estudei eu coloquei aqui. Levando em conta meus resultados em concursos, acredito que essa apostila forneça uma boa base para quem almeja o cargo de Perito Criminal nas áreas de Biomedicina e Biologia. Não deixem de procurar explicações adicionais, vídeos, artigos, caso restem dúvidas sobre os tópicos abordados aqui. Façam e refaçam as questões dessa apostila, pois as bancas tendem a repetir os conteúdos. Recomendo ainda que, caso haja lacunas nos assuntos, sejam procuradas as referências no final de cada capítulo. Sem mais comentários, espero, sinceramente, que essa apostila seja de alguma ajuda na conquista do seu sonho! Bons estudos! Leilane Verga. 2 | A p o s t i l a P e r i t o C r i m i n a l ÍNDICE 1. Biologia celular ......................................................................................................................................13 2. Biologia Molecular ................................................................................................................................46 3. Técnicas em Biologia Molecular ...........................................................................................................83 4. Genética ..............................................................................................................................................123 5. Genética forense .................................................................................................................................155 6. Bioquímica ..........................................................................................................................................183 7. Imunologia ..........................................................................................................................................217 8. Imuno-hematologia ............................................................................................................................233 9. Microscopia .........................................................................................................................................248 10. Luz forense ......................................................................................................................................265 11. Cadeia de custódia ..........................................................................................................................268 12. Entomologia Forense ......................................................................................................................275 13. Tricologia Forense ...........................................................................................................................306 14. Hematologia forense ......................................................................................................................318 3 | A p o s t i l a P e r i t o C r i m i n a l ÍNDICE EXPANDIDO 1. Biologia celular .................................................... 13 Células procariontes ................................................. 13 Células eucariontes .................................................. 13 Células eucariontes vegetais e animais ............... 13 Citoplasma ............................................................... 14 Depósitos citoplasmáticos ................................... 14 Composição iônica ............................................... 14 Membrana celular .................................................... 15 Composição ......................................................... 15 Proteínas da membrana .................................. 15 Mosaico fluido ..................................................... 15 Glicocálice ............................................................ 15 Especializações .................................................... 16 Microvilosidades ............................................. 16 Cílios e flagelos................................................ 16 Junção oclusiva ................................................ 16 Desmossomos .................................................. 16 Junção comunicante ........................................ 16 Interdigitações ................................................. 16 Fluidez da membrana .......................................... 16 Transporte entre membranas.............................. 17 Transporte passivo .......................................... 17 Transporte ativo .............................................. 18 Transporte acoplado ....................................... 18 Endocitose ...................................................... 18 Exocitose ......................................................... 19 Núcleo ...................................................................... 19 Cromatina ............................................................ 19 Cromossomos ...................................................... 19 Nucléolo............................................................... 20 Organelas ................................................................. 20 Mitocôndrias ....................................................... 20 Retículo endoplasmático ..................................... 20 Retículo endoplasmático rugoso ..................... 21 Ribossomos ...............................................21 Retículo endoplasmático liso .......................... 21 Endossomos ......................................................... 22 Complexo de Golgi ............................................... 22 Lisossomos ........................................................... 22 Peroxissomos ....................................................... 23 Multiplicação dos peroxissomos ..................... 23 Glioxissomos ................................................... 23 Plastos .................................................................. 23 Cloroplastos .................................................... 23 Teoria endossimbiótica ................................... 24 Vacúolos............................................................... 24 Citoesqueleto ........................................................... 24 Metabolismo celular ................................................. 25 ATP e energia ....................................................... 25 Fotossíntese ......................................................... 26 Etapas da fotossíntese .................................... 26 Fase clara (fotoquímica) ............................ 26 Fase escura (química) ................................ 27 Fatores que influenciam a fotossíntese .......... 27 Fatores limitantes intrínsecos .................... 27 Fatores limitantes extrínsecos ................... 27 Quimiossíntese .................................................... 28 Fermentação ........................................................ 28 Fermentação alcoólica .................................... 29 Fermentação lática .......................................... 29 Respiração ........................................................... 29 Glicólise ........................................................... 30 Ciclo de Krebs .................................................. 30 Cadeia respiratória .......................................... 30 ATP-sintase mitocondrial ................................ 30 Ciclo celular .............................................................. 31 Intérfase ............................................................... 31 Fase G0 ............................................................ 31 Fase G1 ............................................................ 31 Fase S .............................................................. 32 Fase G2 ............................................................ 32 Mitose .................................................................. 32 Prófase ............................................................ 32 Metáfase ......................................................... 33 Anáfase............................................................ 33 Telófase ........................................................... 33 4 | A p o s t i l a P e r i t o C r i m i n a l Citocinese .................................................. 33 Meiose ................................................................. 34 Meiose I .......................................................... 34 Prófase I ..................................................... 34 Metáfase I .................................................. 34 Anáfase I .................................................... 34 Telófase I ................................................... 35 Meiose II ......................................................... 35 Prófase II .................................................... 35 Metáfase II ................................................. 35 Anáfase II ................................................... 35 Telófase II .................................................. 35 Questões .................................................................. 36 Gabarito ............................................................... 44 Referências ............................................................... 45 2. Biologia Molecular ............................................... 46 Organização do genoma humano ............................ 46 Cromossomos ...................................................... 46 Bandeamento cromossômico ......................... 46 Principais conceitos......................................... 47 Cromátides ...................................................... 47 Centrômero ..................................................... 47 Empacotamento do DNA ................................ 47 Cromatina interfásica .......................................... 49 Eucromatina .................................................... 49 Heterocromatina ............................................. 49 Telômeros ............................................................ 49 Funções dos telômeros: .................................. 50 Bandeamento cromossômico .............................. 50 Regiões de DNA repetitivo ................................... 52 DNA Espaçador .................................................... 53 Anomalias cromossômicas .................................. 53 Anomalias numéricas ...................................... 54 Anomalias estruturais ..................................... 54 Dissomia uniparental ........................................... 54 DNA Mitocondrial ................................................ 54 Principais características ................................. 54 Replicação ................................................................ 56 Primers ............................................................ 56 Fragmentos de Okazaki ................................... 56 Principais enzimas da replicação ......................... 57 Topoisomerases (girases) ................................ 57 Helicases ......................................................... 57 Proteínas de ligação à fita simples .................. 57 Primases .......................................................... 57 DNA polimerases ............................................. 57 DNA polimerases em procariotos .............. 57 DNA ligases ...................................................... 57 Replicação em procariotos e eucariotos ......... 58 Organização gênica................................................... 58 Gene..................................................................... 58 Estrutura do gene ............................................ 58 Pseudogenes ................................................... 59 Genes de RNA não-codificadores .................... 59 Micro-RNA (miRNA) ................................... 59 Expressão gênica ...................................................... 59 Transcrição ........................................................... 59 Promotores ..................................................... 60 Término da transcrição ................................... 60 Processamento do RNA ....................................... 60 Capeamento 5’ ................................................ 60 Poliadenilação 3’ ............................................. 60 Splicing alternativo .......................................... 61 Tradução .............................................................. 62 Ribossomos eucariotos ................................... 62 Códons ............................................................ 62 Anticódons ...................................................... 62 Início da tradução ............................................ 62 Término da tradução ....................................... 63 Processamento pós-traducional ...................... 63 Tradução em procariotos ................................ 63 Regulação da expressão em eucariotos ............... 64 Mutação e reparo do DNA ........................................ 64 Tipos de mutações ............................................... 65 Mutação pontual .............................................65 Etapas de produção da mutação pontual .. 66 Mutações por inserções e mutações deletérias ........................................................................ 67 Agentes mutagênicos ........................................... 67 Mecanismos de Reparo do DNA .......................... 69 Reparo direto por fotorreativação .................. 69 Reparo por excisão .......................................... 69 Reparo por recombinação ............................... 71 Recombinação gênica ............................................... 71 Recombinação homóloga .................................... 71 Recombinação sítio-específica ............................. 71 Hibridização de Ácidos Nucleicos ............................. 72 5 | A p o s t i l a P e r i t o C r i m i n a l Utilizações ........................................................... 72 Princípios ............................................................. 72 Detecção e identificação ..................................... 73 Estabilidade ......................................................... 73 Questões .................................................................. 74 Gabarito ............................................................... 81 Referências ............................................................... 82 3. Técnicas em Biologia Molecular .......................... 83 Extração do DNA ...................................................... 83 Princípios da extração do DNA ............................ 83 Ruptura de células e tecidos ........................... 83 Lise de membranas ......................................... 83 Remoção de proteínas e constituintes citoplasmáticos ............................................... 84 Armazenamento das soluções com DNA ........ 84 Extração orgânica (fenol-clorofórmio) ................. 84 Ebulição e quelação (Chelex) ............................... 85 FTA-paper ............................................................ 85 Extração com sílica .............................................. 86 DNA IQ – Extração com sílica ligada a beads... 86 PrepFilter ........................................................ 87 Extração magnética ............................................. 87 Extração diferencial ............................................. 87 Extração de DNA de pelo e cabelo ....................... 88 Reação em cadeia da polimerase (PCR) ................... 89 Desnaturação e renaturação do DNA .................. 89 Princípios básicos da PCR..................................... 89 Componentes da PCR .......................................... 89 DNA polimerase termoestável ........................ 89 Taq polimerase .......................................... 89 AmpliTaq Gold polimerase ........................ 89 Pfu DNA polimerase .................................. 89 Primers ............................................................ 90 DNA molde ...................................................... 90 Desoxirribonucleotídeos (dNTPs) .................... 90 Cátions ............................................................ 90 Tampão ........................................................... 91 Ciclo da PCR ......................................................... 91 Fatores que afetam a PCR ................................... 91 Qualidade do molde DNA ............................... 91 Inibidores da PCR ............................................ 91 Contaminação ................................................. 91 RT-PCR ................................................................. 91 Nested-PCR .......................................................... 92 Quantificação do DNA .............................................. 92 Absorbância UV ................................................... 93 End-point PCR ...................................................... 93 Real-time PCR (qPCR) ........................................... 93 TaqMan ........................................................... 93 Molecular Beacon ........................................... 94 Análise da qPCR ............................................... 94 Sequenciamento....................................................... 95 Sequenciamento Químico (de Maxam-Gilbert) ... 95 Método de Sanger (terminação de cadeia) ......... 96 Didesoxirribonucleotídeos .............................. 96 Princípios do sequenciamento de Sanger ....... 96 Sequenciamento manual ................................ 96 Sequenciamento automático .......................... 97 Shotgun ................................................................ 97 Primer walking (Chromosome walking) ............... 98 Sequenciamento de nova geração (NGS) ............. 98 PCR de emulsão ............................................... 99 Bridge PCR ....................................................... 99 Pirosequenciamento ....................................... 99 Illumina ......................................................... 100 Ion Torrent .................................................... 100 SOLiD ............................................................. 101 Sequenciamento de terceira geração ................ 101 HeliScope....................................................... 101 SMRT ............................................................. 101 Eletroforese ............................................................ 102 Princípios básicos ............................................... 102 Matrizes de suporte ........................................... 102 Agarose ......................................................... 102 Poliacrilamida ................................................ 103 Eletroforese desnaturante ....................... 103 Eletroforese em gel de agarose ......................... 103 Eletroforese em gel de poliacrilamida ............... 104 SDS-PAGE ...................................................... 105 Eletroforese bidimensional ........................... 105 Eletroforese capilar ............................................ 106 Capilar ........................................................... 106 Injeção das amostras ..................................... 106 Eletrodos e fluxo ........................................... 106 Vantagens da eletroforese capilar ................ 107 Desvantagens da eletroforese capilar ........... 107 Eletroferograma ............................................ 107 6 | A p o s t i l a P e r i t o C r i m i n a l Problemas associados à eletroforese capilar 107 Eletroforese de campo pulsado ......................... 108 Blotting ................................................................... 109 Southern blotting............................................... 109 Northern Blotting .............................................. 109 Western Blotting ............................................... 110 Questões ................................................................ 110 Gabarito ............................................................. 121 Referências ............................................................. 121 4. Genética ............................................................ 123 Conceitos ................................................................ 123 Quadro de Punnett ................................................ 123 Leis de Mendel ....................................................... 124 Primeira Lei de Mendel .......................................... 124 Monoibridismo sem dominância. ...................... 125 Penetrância incompleta ..................................... 125 Pleiotropismo .................................................... 126 Genes letais ....................................................... 126 Gêmeos..............................................................126 Gêmeos monozigóticos ................................. 126 Gêmeos dizigóticos ....................................... 126 Probabilidades e heredograma .............................. 126 Probabilidade .................................................... 126 Eventos mutuamente exclusivos .................. 127 Eventos simultaneamente independentes ... 127 Heredogramas ................................................... 127 Elaboração do heredograma ......................... 128 Análise do heredograma ............................... 128 Padrões de herança ........................................... 129 Herança autossômica dominante ................. 129 Herança autossômica recessiva .................... 129 Herança dominante ligada ao X .................... 129 Herança recessiva ligada ao X ....................... 130 Herança ligada ao Y ....................................... 130 Segunda Lei de Mendel .......................................... 130 Segregação independente de 3 pares de alelos 131 Meiose e a 2ª Lei de Mendel ............................. 132 Linkage ............................................................... 132 Genes ligados..................................................... 133 Taxa de permuta ................................................ 133 Mapa genético ................................................... 134 Casos de herança ................................................... 134 Herança ligada ao Y ........................................... 134 Herança influenciada pelo sexo ......................... 135 Albinismo ........................................................... 135 Hemofilia............................................................ 135 Daltonismo ......................................................... 136 Herança dos grupos sanguíneos ............................. 136 Sistema ABO ...................................................... 136 Sistema MN ........................................................ 136 Sistema Rh ......................................................... 137 Interação gênica ..................................................... 137 Interações epistáticas ........................................ 137 Interações não epistáticas ................................. 137 Herança quantitativa ......................................... 137 Genética populacional ............................................ 137 Heterozigosidade ............................................... 138 Equilíbrio de Hardy-Weinberg ........................... 139 Premissas ...................................................... 139 Resultados esperados ................................... 139 Equação de HW ............................................. 139 Causas de afastamento do HW ..................... 140 Cálculo para saber se uma população está em equilíbrio de HW ........................................... 140 Análise estatística de perfil de DNA........................ 142 Subpopulações ................................................... 143 Taxa de probabilidade ....................................... 143 Índex de Paternidade ............................................. 143 ICP ...................................................................... 144 Probabilidade de paternidade ........................... 144 Questões ................................................................ 145 Gabarito ............................................................. 153 Referências ............................................................. 154 5. Genética forense ................................................ 155 Aplicações da Genética Forense ............................. 155 Genoma Humano ................................................... 155 Sequências não codificantes .............................. 155 Conceitos importantes ....................................... 155 Polimorfismos do DNA ........................................... 156 Nomenclatura dos marcadores.......................... 157 Minissatélites ......................................................... 157 Endonucleases de restrição ............................... 158 Desvantagens do uso de VNTRs ......................... 158 AFLP ................................................................... 158 Microssatélites ....................................................... 158 Vantagens dos STRs ........................................... 158 Escolha dos STRs ................................................ 159 7 | A p o s t i l a P e r i t o C r i m i n a l Análise dos STRs ................................................ 159 Interpretação do perfil genético ........................ 160 Amelogenina ...................................................... 160 Análise de misturas............................................ 161 Mini-STR ............................................................ 161 STR do cromossomo Y ............................................ 161 STR-Y .................................................................. 162 SNP-Y ................................................................. 162 STR do cromossomo X ............................................ 162 Aplicações do X-STR ........................................... 162 Polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) .............. 162 Análise dos SNPs ................................................ 163 SNaPshot ....................................................... 163 Arranjos SNP de alta densidade (Microarrays) ...................................................................... 164 DNA mitocondrial ................................................... 164 Genoma mitocondrial ........................................ 164 Heteroplasmia ................................................... 165 Utilizações do mtDNA ........................................ 165 Análise do DNA mitocondrial ............................. 165 Interpretação do perfil de mtDNA ..................... 165 INDEL ...................................................................... 165 Marcadores de ancestralidade ............................... 166 Bancos de Dados de Perfis Genéticos .................... 167 RESOLUÇÃO Nº 3, DE 26 DE MARÇO DE 2014 ... 167 Lei nº12.654/2012 ............................................. 167 Coleta para auxiliar as investigações) ........... 167 Lei de execução penal ................................... 168 Manual de procedimentos RIBPG ...................... 168 Decreto nº 7.950 ............................................... 169 Questões ................................................................ 169 Gabarito ............................................................. 182 Referências ............................................................. 182 6. Bioquímica ......................................................... 183 Água ....................................................................... 183 Principais funções nos seres vivos ..................... 184 A água como solvente ....................................... 184 Por que a água dissolve sais .......................... 184 Sais Minerais .......................................................... 185 Importância biológica ........................................ 185 Vitaminas ............................................................... 185 Carboidratos ........................................................... 186 Funções.............................................................. 186 Classificação....................................................... 187 Monossacarídeos .......................................... 187 Características dos monossacarídeos ...... 187 Ligação glicosídica .................................... 187 Dissacarídeos................................................. 187 Oligossacarídeos............................................188 Polissacarídeos .............................................. 188 Reserva energética .................................. 188 Polissacarídeos estruturais ...................... 188 Classificação dos polissacarídeos ............. 188 Glicoconjugados ................................................. 188 Lipídios ................................................................... 189 Funções biológicas ............................................. 189 Classificação ....................................................... 189 Glicerídeos .................................................... 189 Ácidos graxos ........................................... 189 Cerídeos ........................................................ 190 Fosfolipídios .................................................. 190 Glicerofosfolipídios .................................. 190 Esfingofosfolipídios .................................. 190 Esteroides ...................................................... 191 Proteínas ................................................................ 191 Aminoácidos ...................................................... 191 Carbono α (alfa) ............................................. 192 Ligação peptídica ............................................... 192 Características da ligação peptídica .............. 192 Estruturas das proteínas .................................... 192 A α-hélice ...................................................... 192 Folha-β .......................................................... 193 Desnaturação ................................................ 193 Classificação quanto à organização estrutural ... 193 Enzimas................................................................... 194 Catálise enzimática ............................................ 194 Modelo chave-fechadura .............................. 195 Modelo ajuste-induzido ................................ 195 Cinética enzimática ............................................ 195 Velocidade máxima ....................................... 195 Equação de Michaelis-Menten ...................... 195 Equação do duplo recíproco.......................... 196 Fatores que afetam a ação enzimática .............. 196 Concentração do substrato ........................... 196 Temperatura ................................................. 196 pH .................................................................. 196 Inibição enzimática ............................................ 197 8 | A p o s t i l a P e r i t o C r i m i n a l Inibição irreversível ....................................... 197 Inibição reversível ......................................... 197 Inibidor competitivo ............................... 197 Inibidor incompetitivo ............................ 197 Inibidor não-competitivo ........................ 198 Inibição mista .......................................... 198 Enzimas vs. Catalisadores químicos ................... 199 Nomenclatura das enzimas .................................... 199 Classe 1 – oxirredutases .................................... 199 Classe 2 – transferases ...................................... 200 Classe 3 – hidrolases .......................................... 200 Classe 4 – liases ................................................. 201 Classe 5 – isomerases ........................................ 201 Classe 6 – ligases ou sintetases.......................... 201 Ácidos Nucleicos..................................................... 201 Estrutura dos ácidos nucleicos .......................... 202 Nucleosídeo .................................................. 202 Nucleotídeo................................................... 202 DNA ................................................................... 203 Estruturas do DNA ........................................ 204 RNA .................................................................... 204 RNA mensageiro ........................................... 204 RNA ribossômico ........................................... 204 RNA transportador ........................................ 205 Aminoacil tRNA sintetases ....................... 205 Questões ................................................................ 206 Gabarito ............................................................. 215 Referências ............................................................. 215 7. Imunologia ......................................................... 217 Sistema Imune ........................................................ 217 Conceitos ........................................................... 217 Funções do sistema imune ................................ 217 Imunidade inata ................................................. 217 Constituintes da imunidade nata .................. 217 Resistência celular ........................................ 217 Receptores de reconhecimento de padrões . 217 Imunidade adquirida ......................................... 218 Memória imunológica ................................... 218 Imunidade humoral ...................................... 218 Imunidade celular ......................................... 219 Natureza clonal da RI adquirida .................... 219 Antígenos ............................................................... 219 Tipos de antígenos ............................................. 219 Quanto à constituição química ..................... 219 Quanto à valência.......................................... 219 Quanto à forma de apresentação ................. 219 Quanto à reatividade imunológica ................ 219 Quanto à necessidade de participação do linfócito T ...................................................... 220 Quanto à reatividade com o anticorpo ......... 220 Anticorpos .............................................................. 220 Funções efetoras dos anticorpos ....................... 220 Estrutura ............................................................ 220 Domínio ......................................................... 220 Região de dobradiça ...................................... 220 Clivagem dos anticorpos ............................... 220 Regiões variáveis ........................................... 221 Regiões constantes........................................ 221 Cadeia de junção ........................................... 222 Classificações ..................................................... 222 Classes de anticorpos ............................................. 222 IgG ...................................................................... 222 IgM ..................................................................... 223 IgA ...................................................................... 223 IgD ...................................................................... 223 IgE ...................................................................... 223 Ligação antígeno-anticorpo .................................... 223 Base estrutural ................................................... 223 Características relacionadas ao reconhecimento do antígeno ............................................................. 223 Características relacionadas às funções efetoras ........................................................................... 224 Órgãos linfoides ...................................................... 224 Medula óssea ..................................................... 224 Timo ................................................................... 224 Linfonodos ......................................................... 224 Baço ................................................................... 224 Células do SI ........................................................... 224 Células apresentadoras de antígenos (APCs) ..... 224 Eosinófilo........................................................... 224 Neutrófilo........................................................... 224 Basófilo .............................................................. 224 Linfócito ............................................................. 225 Monócito ........................................................... 225 Imunoensaios ......................................................... 225 ELISA .................................................................. 225 Elisa de captura IgM (MAC-ELISA) ................. 225 9 | A p o s t i l a P e r i t o C r i m i n a l ELFA ................................................................... 225 Imunocromatografia .......................................... 226 Imunofluorescência ........................................... 226 Direta ............................................................ 226 Indireta.......................................................... 226 Questões ................................................................ 227 Gabarito ............................................................. 232 Referências ............................................................. 232 8. Imuno-hematologia ........................................... 233 Sistema ABO ........................................................... 233 Biossíntese dos antígenos ABO .......................... 233 Bases moleculares do sistema ABO ................... 234 Herança dos antígenos A e B ............................. 234 Prova de Coombs ................................................... 234 Coombs direto ................................................... 234 Coombs indireto ................................................ 235 Antissoros do sistema ABO .................................... 235 Prova direta ....................................................... 235 Prova reversa (prova de Simonin) ..................... 235 Transfusões sanguíneas ......................................... 235 Antígenos ABH das secreções ................................ 236 Não-secretores .................................................. 236 Bombaim (Oh) / “Falso O” .................................. 236 Verificação do caráter secretor ......................... 237 Sistema de Lewis .................................................... 238 Sistema Rh .............................................................. 238 Antígeno RhD ..................................................... 238 Antígenos D fraco .......................................... 239 Antígenos D parciais...................................... 239 Anticorpos do sistema Rh .................................. 239 Tipagem RhD ..................................................... 239 Eritroblastose fetal ............................................ 239 Sistema MN ............................................................ 239 Aplicações forenses da tipagem sanguínea ............ 240 Tipagem em manchas de sangue....................... 240 Tipagem em secreções ...................................... 240 Questões ................................................................ 241 Gabarito ............................................................. 247 Referências ............................................................. 247 9. Microscopia ....................................................... 248 Microscopia Óptica ................................................ 248 Estrutura de um microscópio óptico ................. 248 Parte mecânica ............................................. 248 Parte óptica ................................................... 248 Conceitos ........................................................... 249 Poder de resolução ....................................... 249 Ampliação...................................................... 249 Limite de resolução ....................................... 249 Microscopia de campo claro .............................. 249 Microscopia de campo escuro ........................... 249 Funcionamento ............................................. 250 Aplicações ..................................................... 250 Limitações ..................................................... 250 Microscopia de fluorescência ............................ 250 Aplicações .......................................................... 251 Microscopia de contraste de fase ...................... 251 Funcionamento ............................................. 251 Contraste de fase positivo ....................... 252 Contraste de fase negativo ...................... 252 Microscópio de contraste de interferência diferencial (DIC) ................................................. 252 Microscopia de polarização ............................... 252 Microscopia confocal ......................................... 253 Aberrações ......................................................... 253 Esféricas ........................................................ 253 Cromáticas .................................................... 254 Microscopia eletrônica ........................................... 254 Componentes do microscópio eletrônico .......... 254 Propriedades ondulatórias dos elétrons ....... 254 Canhão eletrônico ......................................... 254 Lentes eletrônicas ......................................... 254 Microscópio eletrônico de transmissão (MET) .. 254 Composição ................................................... 254 Microscópio eletrônico de varredura (MEV)...... 255 MET x MEV ......................................................... 256 Questões ................................................................ 257 Gabarito ............................................................. 263 Referências ............................................................. 264 10. Luz forense .................................................... 265 Luz e matéria .......................................................... 265 Interações da luz com a matéria ............................ 265 Luminescência ........................................................ 265 Métodos de absorção ............................................. 266 Manchas de sangue ................................................ 266 Fluidos corporais .................................................... 266 Fibras ...................................................................... 267 Pegadas .................................................................. 267 10 | A p o s t i l a P e r i t o C r i m i n a l Referências ............................................................. 267 11. Cadeia de custódia ........................................ 268 Conceitos ................................................................ 268 Finalidade .......................................................... 268 Vestígios, indícios e evidências .......................... 268 Elementos .............................................................. 269 Registro documental ......................................... 269 Rastreabilidade .................................................. 269 Integridade da prova ......................................... 269 Início e fim .............................................................. 269 Centro de custódia ............................................ 270 Etapas da cadeia de custódia ............................. 270 Fase externa .................................................. 270 Fase interna .................................................. 270 Procedimentos ....................................................... 270 Questões ................................................................ 271 Gabarito ............................................................. 273 Referências .............................................................274 12. Entomologia Forense .................................... 275 Introdução .............................................................. 275 Histórico ................................................................. 275 Classificações ......................................................... 275 Entomologia forense urbana ............................. 275 Entomologia forense de produtos estocados ou armazenados ..................................................... 276 Entomologia forense médico-legal .................... 276 Entomologia forense ambiental ........................ 276 Aplicações .............................................................. 276 Possibilitar a identificação do morto ................. 276 Local da morte e transporte do corpo ............... 276 Entorpecentes ................................................... 277 Maus tratos ....................................................... 277 Crimes sexuais seguidos de morte..................... 277 Quem cometeu o crime ..................................... 278 Aplicações nos casos de morte violenta ............ 278 A investigação ............................................... 278 Principais objetivos da Entomologia Forense no contexto da perícia ....................................... 278 Orientação da causa da morte ...................... 278 Fauna cadavérica .................................................... 278 Classificação....................................................... 278 Principais ordens de interesse forense .............. 278 Noções de cronotagnose médico-legal .................. 279 Determinação do IPM ............................................ 281 Características dos insetos úteis na estimativa de tempo de morte ................................................. 281 Estimativa mediante o padrão sucessório ......... 281 Padrão de sucessão (França).............................. 282 Tempo de desenvolvimento dos imaturos ........ 283 GDA .................................................................... 284 Cálculo do GDA .................................................. 284 Exemplo de cálculo do GDA ............................... 284 Exemplo de cálculo do IPM ................................ 285 Limitações no uso de insetos na cronologia da morte ................................................................. 286 Tratamento de material entomológico .................. 286 Coleta ................................................................. 286 Procedimentos para a coleta de vestígios entomológicos: .............................................. 287 Transporte ......................................................... 288 Procedimento em laboratório ........................... 288 Criação ............................................................... 289 Observações e manutenção da criação ......... 289 Procedimentos pós-emergência ................... 289 Identificação ...................................................... 290 Outras modalidades ............................................... 290 Entomotoxicologia ............................................. 290 Entomologia forense molecular ......................... 290 Entomologia forense ambiental......................... 291 Ciclo de vida dos insetos......................................... 291 Noções de morfologia e biologia ............................ 291 Cabeça ............................................................... 292 Antenas .............................................................. 292 Aparelho bucal ................................................... 293 Tórax .................................................................. 293 Apêndices torácicos ...................................... 293 Asas .................................................................... 294 Abdome ............................................................. 294 Reprodução e fases do desenvolvimento .......... 295 Muda ou ecdise.................................................. 295 Tipos de larvas ................................................... 296 Ordem Diptera ................................................... 296 Família Calliphoridae ..................................... 296 Família Sarcophagidae .................................. 297 Família Muscidae........................................... 297 Família Fannidae ........................................... 297 Família Phoridae ............................................ 297 Família Stratiomyidae.................................... 297 11 | A p o s t i l a P e r i t o C r i m i n a l Família Pzychodidae ...................................... 297 Família Culicidae ........................................... 297 Ordem Coleptera ............................................... 298 Família Dermestidae ..................................... 298 Família Cleridae ............................................. 298 Família Scarabaeidae .................................... 298 Família Silphidae ........................................... 298 Família Staphylinidae .................................... 298 Família Tenebrionidae .................................. 298 Família Cerambycidae ................................... 298 Ordem Hymenoptera......................................... 299 Família Apidae............................................... 299 Família Formicidae ........................................ 299 Família Vespidae ........................................... 299 Questões ................................................................ 299 Gabarito ............................................................. 305 Referências ............................................................. 305 13. Tricologia Forense ......................................... 306 Introdução .............................................................. 306 Aplicações da Tricologia Forense ....................... 306 Morfologia .............................................................. 306 Composição ............................................................ 306 Morfologia da haste .......................................... 307 Cutícula ......................................................... 307 Córtex............................................................ 307 Medula .......................................................... 308 Histogênese ............................................................ 308 Ciclo de vida dos pelos ........................................... 309 Fase anágena ..................................................... 309 Fase catágena .................................................... 309 Fase telógena ..................................................... 310 Fibras ...................................................................... 310 Fibras naturais ................................................... 311 Animais ......................................................... 311 Vegetais ........................................................ 311 Minerais ........................................................ 311 Fibras sintéticas ................................................. 311 Inorgânicas .................................................... 311 Orgânicas ...................................................... 311 Coleta de fibras e pelos .......................................... 311 Coleta de pessoa viva ........................................ 312 Análise dos pelos .................................................... 312 Pesquisa Toxicológica em amostras de cabelo .. 312 Tratamento químico .......................................... 313 Teste de infiltração com azul de metileno .... 313 Limpeza, clareamento e montagem .................. 313 Tipagem de DNA ................................................ 313 Alteraçõesbiológicas e ambientais .................... 314 Questões ................................................................ 314 Gabarito ............................................................. 316 Referências ............................................................. 317 14. Hematologia forense ..................................... 318 Introdução .............................................................. 318 Composição do sangue ...................................... 318 Testes de orientação .............................................. 318 Testes colorimétricos ......................................... 318 Benzidina (Adler-Ascarelli) ............................ 318 Fenolftaleína (Kastle-Meyer) ......................... 318 Verde malaquita ............................................ 319 Reação de Van-Deen ..................................... 319 Testes de luminescência .................................... 319 Luminol.......................................................... 319 Bluestar ......................................................... 319 Fluoresceína. ................................................. 319 Fatores que afetam os testes de orientação...... 320 Oxidantes ...................................................... 320 Peroxidase de plantas ................................... 320 Agentes redutores ......................................... 320 Testes de certeza .................................................... 320 Microcristais ...................................................... 320 Métodos espectrofotométricos ......................... 321 RT-PCR ............................................................... 321 Métodos cromatográficos .................................. 321 Testes de determinação de origem humana .......... 321 Teste de Vacher-Sutton (Inibição da antiglobulina humana) ............................................................. 321 Imunocromatografia .......................................... 321 Imunocromatografia para glicoforina A ........ 322 Testes de imunoprecipitação ............................. 322 Hematologia Forense Reconstrutora...................... 322 Altura de queda em gotejamento estático (isolado) ........................................................................... 322 Direcionalidade e área da convergência ............ 323 Área de convergência em duas dimensões ........ 323 Ângulo de impacto e ponto de origem tridimensional .................................................... 324 Terminologia de manchas de sangue................. 325 12 | A p o s t i l a P e r i t o C r i m i n a l Manchas de formação passiva ...................... 325 Gotejamento isolado ............................... 325 Gotejamento sucessivo estático .............. 325 Escorrimento ........................................... 325 Empoçamento ......................................... 325 Manchas de formação ativa .......................... 325 Manchas de contato ................................ 326 Manchas de arrastamento ....................... 326 Manchas de projeção .............................. 326 Manchas alteradas ................................... 327 Outras considerações ........................................ 327 Questões ................................................................ 328 Gabarito ............................................................. 330 Referências ............................................................. 331 13 | A p o s t i l a P e r i t o C r i m i n a l 1. BIOLOGIA CELULAR A célula é a unidade que constitui os seres vivos, podendo existir isoladamente, nos seres unicelulares, ou formar arranjos ordenados em seres pluricelulares. Todas as células possuem certos componentes básicos, são eles: Membrana plasmática Citosol Cromossomos Ribossomos Há dois tipos básicos de células: procariontes e eucariontes, que se diferenciam basicamente pela localização do material genético nelas. Nos eucariontes, o DNA é delimitado pelo núcleo, enquanto nos procariontes, o DNA está concentrado no nucleoide, que não é uma região cercada por membranas. Células procariontes Nas células procariontes, a única membrana existente é a membrana plasmática. Elas não possuem membranas que separam os cromossomos do citoplasma – o material genético está disperso em uma região não delimitada, o nucleoide. Os seres com células procariontes são chamados de procariotas – as bactérias (as cianofíceas, ou algas azuis, também são bactérias). No citoplasma das bactérias há os polirribossomos, que são ribossomos ligados a moléculas de RNA mensageiro. As células procariontes não se dividem por mitose, e seus filamentos de DNA não sofrem o processo de condensação que leva à formação de cromossomos visíveis durante a divisão celular. As células procariontes não possuem organelas, ou seja, não apresentam nenhuma outra membrana no citoplasma além da que separa a célula do meio externo (membrana plasmática). Em algumas células pode haver invaginações da membrana plasmática, que se enrolam no citoplasma e dão origem aos mesossomos. Os procariotos não possuem citoesqueleto. Sua forma é mantida pela parede extracelular, que é sintetizada no citoplasma e agregada à superfície externa da membrana plasmática. Células eucariontes As células eucariontes apresentam duas partes morfologicamente bem distintas: o citoplasma e o núcleo, que são separados pelo envoltório nuclear. O citoplasma das células eucariontes se apresenta subdividido em compartimentos, nos quais um extenso sistema de membranas cria microrregiões no citoplasma, que contêm moléculas diferentes que executam funções especializadas. Além disso, há grande diferenças enzimáticas entre os diversos compartimentos. Essa separação das atividades das células eucariotas permite que elas atinjam maior tamanho, sem prejuízo das suas funções. Células eucariontes vegetais e animais Existem algumas características que distinguem as células eucariontes vegetais das animais, que estão sintetizadas a seguir: Figura 1. Células eucariotas e procariotas. Fonte: Passei na Fuvest. 46 | A p o s t i l a P e r i t o C r i m i n a l 2. BIOLOGIA MOLECULAR Organização do genoma humano O código genético dos seres vivos toma a mesma forma em seres primitivos como amebas, ou no homem. São moléculas de ácido desoxirribonucleico, ou DNA, compostas fundamentalmente por longas sequências de quatro bases nitrogenadas, as "letras" químicas A (adenina), T (timina), C (citosina) e G (guanina). A presença do DNA na célula é chamada de genoma. Embora o genoma procariótico seja frequentemente uma longa molécula de DNA, genomas eucarióticos normalmente consistem em algumas moléculas de DNA. A molécula de DNA tem diversas centenas a milhares de genes, dependendo da espécie, que são as unidades de informação que especificam as características herdáveis de um organismo. Porém, nem todo DNA se traduz em genes: no ser humano, estima-se que menos de 10% do DNA do genoma especifica genes. A parte restante é chamada de DNA lixo, sequências que se acumularam por milhões de anos sem utilidade aparente. Enquanto os genomas de organismos unicelulares são bastante compactos, os tamanhos dos genomas tendem a um aumento nas linhagens que levam aos metazoários. Além disso, genomas de vertebrados toleram muitos íntrons (sequências não codificantes) grandes e também uma grande quantidade de DNA altamente repetitivo. A quantidade de DNA no genoma é conhecida como valor C (de Constante ou Característico). Este valor pode ser expresso em picogramas, que contém aproximadamente um bilhão de pares de bases de DNA. Todavia, existe uma relação inconstante entre a complexidade do organismo e a quantidade de DNA em suas células – o que foi chamado de paradoxo do valorC. Foi relatado que algumas plantas possuem consideravelmente mais DNA por célula do que os humanos; ou seja, o valor C não exprime uma relação direta com o grau de complexidade do organismo. Cromossomos O DNA encontra-se empacotado em estruturas denominados cromossomos – assim chamados porque absorvem determinados corantes (chroma – cor, soma – corpo). Os cromossomos estão lcoalizados no núcleo da célula. O cromossomo é formado por pedaços de cromatina (molécula de DNA linear) que se dobram diversas vezes sobre si e possuem um formato de bastonete. Antes que ocorra a divisão, o cromossomo se duplica e são formadas as cromátides (a cromátide é cada um dos filamentos de DNA que são formados na duplicação do cromossomo). A estrutura cromossômica geralmente ilustrada em livros didáticos representa apenas o estado no qual os cromossomos se encontram durante a metáfase – as cromátides aparecem conectadas umas às outras na região do centrômero e estão tão condensadas que podem ser visualizadas por microscopia de luz. Esses cromossomos são tão hermeticamente compactados que seus genes não podem ser expressos. Os cromossomos possuem uma estrutura bastante diferente durante a maior parte do ciclo celular – durante a intérfase, a maioria das regiões cromossômicas está altamente estendida, permitindo que seus genes sejam expressos. Bandeamento cromossômico Na década de 1970 descobriu-se que certos tratamentos faziam surgir bandas (faixas transversais) nos cromossomos, as quais permitiam identificar com precisão cada um dos 23 pares cromossômicos do cariótipo humano. Em pesquisas recentes, cientistas descobriram que 80% do “DNA lixo” desempenha pelo menos uma função biológica. 83 | A p o s t i l a P e r i t o C r i m i n a l 3. TÉCNICAS EM BIOLOGIA MOLECULAR Extração do DNA Uma amostra coletada de uma cena de crime contém numerosas substâncias além do DNA. As moléculas de DNA precisam ser separadas desse outro material antes de serem analisadas. Praticamente qualquer material biológico é uma fonte potencial para obtenção de DNA para análise; no entanto, o sucesso da tipagem de DNA frequentemente depende da qualidade e da natureza da amostra. Amostras de cena de crime geralmente têm uma quantidade limitada de material biológica, ou ainda geram grande quantidade de DNA, mas altamente degradado. Essas amostras são expostas ao ambiente por variados períodos de tempo, além de serem substratos ideais para o crescimento de bactérias e outros micro-organismos, processos que podem degradar o DNA. A habilidade de extrair o DNA e purifica-lo, livrando-o de potenciais inibidores na amostra são críticos para o sucesso da análise de DNA no contexto forense. Assim, a extração do DNA tem dois objetivos principais: a) Ser altamente eficiente, extraindo DNA o suficiente para que a análise de perfil de DNA possa ser feita; esse ponto é especialmente importante nos casos em que as amostras biológicas estão em pequena quantidade. b) Extrair DNA que seja puro o suficiente para a análise – o nível de dificuldade para que esse critério seja alcançado depende muito do tipo de amostra usada. Após a extração do DNA, a quantificação precisa do material genético disponível é muito importante para as análises posteriores. Várias técnicas de extração de DNA já foram desenvolvidas, mas elas seguem alguns passos básicos que estarão descritos a seguir. A escolha de qual método será usada depende de vários fatores, como o tipo e quantidade de amostra, a rapidez necessária, a possibilidade de automação, disponibilidade de reagentes necessários e o custo do procedimento. Além disso, deve-se levar em conta a experiência do pessoal do laboratório. Princípios da extração do DNA Ruptura de células e tecidos Para se ter acesso ao conteúdo celular, é preciso romper células e tecidos. Para isso são usados: Proteinase K – enzima que rompe ligações peptídicas, que trabalha muito melhor na presença de um detergente em temperaturas elevadas (essas condições fazem com que as proteínas sejam desnaturadas e consequentemente fiquem mais expostas à ação da proteinase K). Ela é relativamente resistente à desnaturação. A proteinase K hidrolisa RNAses, DNAses e contaminantes, colaborando na ruptura das células. Outros métodos usados para romper células são: tratamento alcalino, aquecimento, métodos mecânicos. Quando a amostra consiste de ossos e dentes, é necessário remover primeiro a matriz calcificada que protege as células. Esse procedimento é feito após limpeza, corte e pulverização do osso. Em seguida, adiciona-se algum agente quelante (como o EDTA), que irá sequestrar os íons de cálcio e realizar a desmineralização da matriz. Lise de membranas Detergentes – são anfipáticos, portanto, interagem com a membrana lipídica e suas proteínas, causando desestabilização e por fim rompimento (penetram na bicamada). Alguns dos detergentes mais usados nas técnicas envolvendo DNA são: SDS, Triton, Tween 20. 95 | A p o s t i l a P e r i t o C r i m i n a l Figura 105. Concentração de DNA versus cycle threshold. Fonte: Fundamentals of Forensic DNA Typing (Butler). Quanto menor for o Ct obtido, maior era a quantidade de DNA inicial (menos ciclos foram necessários para se alcançar o limiar). A clivagem da sonda TaqMan ou a hibridização do molecular beacon resulta em um aumento do sinal fluorescente a cada ciclo. Esse sinal pode ser correlacionado à quantidade inicial de DNA, comparando-se com gráficos de amostras com concentrações de DNA conhecidas (curva padrão). Sequenciamento O sequenciamento é a técnica utilizada para determinar em que ordem as bases (letras) contidas no DNA, se encontram. Quando se diz que um genoma foi sequenciado queremos dizer que foi determinada a ordem em que as informações (genes) estão colocadas no genoma. Até recentemente, o sequenciamento moderno de DNA era baseado em um método de sequenciamento enzimático (de Sanger) e em que, além de lento e demorado, os dados de saída eram limitados. A partir de 2005, o cenário começou a mudar, surgiram as primeiras tecnologias de sequenciamento de DNA conhecidas como NGS (Next Generation Sequencing), permitindo uma nova abordagem de sequenciamento em larga escala (HGS – High throughput sequencing). As metodologias NGS possuem o grande diferencial de proporcionarem o sequenciamento direto e paralelo de milhões e bilhões de moléculas de DNA, aumentando consideravelmente a escala e a resolução das análises. Sequenciamento Químico (de Maxam-Gilbert) Método desenvolvido por Allan Maxam e Walter Gilbert em 176-1977. Esse método é baseado é modificações químicas específicas no DNA e subsequente clivagem do esqueleto de DNA em sítios adjacentes aos nucleotídeos que foram modificados. Foi o primeiro método amplamente adotado para sequenciamento de DNA, e juntamente com o Método de Sanger, representa a primeira geração de métodos de sequenciamento. Figura 106. Sequeciamento de Maxam-Gilbert (Método Químico). Fonte: Wikipedia. O primeiro passo consiste em marcar radioativamente o DNA alvo, ou seja, a molécula a sequenciar. Para tal, são usados isótopos radioativos, tais como 32P e 35S. Em seguida, separam-se as duas cadeias de DNA. Distribui-se por 4 tubos, sendo que em cada tubo irão ocorrer alterações químicas específicas para uma base (A, C, G ou T). As moléculas são clivadas. Por exemplo, no tubo em que o tratamento foi direcionado para a adenina, após a clivagem, a extremidade do fragmento de DNA marcada com o radioisótopo, apresentará uma base que corresponde à que precede a adenina. O passo seguinte é idêntico ao método de Sanger. Cada família é separada em gel de eletroforese e a sequência é lida a partir do próprio gel. Os fragmentos menores são clivados mais próximo da 123 | A p o s t i l a P e r i t o C r i m i n a l 4.GENÉTICA Conceitos A Genética é a parte da Biologia que estuda a hereditariedade, ou seja, a forma como as características são repassadas de geração para geração. Considera-se que essa ciência se iniciou com os experimentos e leis propostas por um monge chamado Gregor Mendel. Gene é a unidade fundamental da hereditariedade. Cada gene é formado por uma sequência específica de ácidos nucléicos. Os genes controlam não só a estrutura e as funções metabólicas das células, mas também todo o organismo. Quando localizados em células reprodutivas, eles passam sua informação para a próxima geração. Como recebemos um conjunto de cromossomos um do pai e outro da mãe, temos duas versões de cada um dos genes no nosso genoma. Cada uma dessas versões de um gene é chamada de alelo. Alelos são versões alternativas de um gene. Por exemplo, A, B e O são alelos alternativos no locus ABO. Para interpretação de genealogias, alelos são geralmente identificados simplesmente pelas versões maiúsculas e minúsculas da mesma letra, de modo que o genótipo em um lócus seria escrito AA, Aa ou aa. A letra maiúscula é convencionalmente usada para o alelo que determina a característica dominante. O conjunto de alelos para vários marcadores do genoma é chamado de genótipo. Um locus (plural loci) é uma localização cromossômica única que define a posição de um gene específico ou de uma sequência de DNA. Figura 139. Alelos e lócus de um gene nos cromossomos homólogos (cada um proveniente de um parental). Fonte: CreationWiki. O genótipo é uma lista dos alelos presente em um ou um número de loci. Fenótipos, características ou traços são as propriedades observáveis e um organismo. Figura 140. Diferença entre genótipo e fenótipo. Um indivíduo é homozigoto em um locus se ambos os alelos naquele locus são iguais, e é heterozigoto se eles são diferentes. Um indivíduo é hemizigoto se tem apenas um único alelo em um locus. Isso pode ocorrer devido à posição do locus no cromossomo X ou Y em um homem ou devido à deleção de uma cópia de um locus autossômico. Uma característica é dominante se ela é manifestada em um indivíduo heterozigoto, e recessiva se não é manifestada. Quadro de Punnett O quadro de Punnett foi criado por um geneticista inglês chamado Reginald Punnett. O objetivo do pesquisador com a criação desse quadro era demonstrar a variedade de combinações genéticas possíveis em um determinado cruzamento. 155 | A p o s t i l a P e r i t o C r i m i n a l 5. GENÉTICA FORENSE A Genética Forense é a área específica das ciências forenses que emprega os conhecimentos relacionados à genética, bem como técnicas de biologia molecular, aliados ao rigor da estatística e genética de populações, na elucidação de crimes, principalmente na determinação de sua autoria e materialidade. Aplicações da Genética Forense Dentre inúmeras aplicações, é possível destacar: Determinação da paternidade; Elucidação de diversos tipos de crimes, como homicídios, crimes sexuais, crimes contra o patrimônio e tráfico de drogas, entre outros; Demonstrar a inocência de suspeitos e pessoas condenadas equivocadamente; Identificação de ossadas e restos mortais; Identificação de espécies animais; Identificação de espécies vegetais. Genoma Humano Toda a informação genética está codificada no DNA e o seu conjunto é conhecido como genoma. São 22 pares de cromossomos autossômicos e 1 par de cromossomos sexuais, totalizando 46 cromossomos em cada célula diploide. Quando ocorre a fertilização de um óvulo por um espermatozoide e a consequente formação do zigoto, o novo ser gerado é uma combinação de metade do DNA herdado da mãe através do óvulo e a outra metade do pai, através do esperamtozoide. Todas as células de um indivíduo possuem a mesma informação genética, ou seja, o mesmo genoma. Observação: para maior compreensão desse capítulo, recomendado estudar o capítulo de Genética. Sequências não codificantes Somente cerca de 1% do genoma humano contém genes que codificam proteínas. Mais de 90% do genoma humano consiste de sequências não codificantes entre os genes. Essas regiões contêm grande quantidade de DNA repetitivo. A importância da análise destas sequências de DNA não codificante, em perícias de Genética Forense, prende-se com o fato de não estarem relacionadas com a síntese de proteínas e, por isso, não haver qualquer correlação que permita deduzir a predisposição do doador da amostra biológica para manifestar uma determinada patologia. As sequências de DNA codificante, que possuem informação genética para a produção de proteínas são praticamente idênticas para todos os indivíduos, razão pela qual essas regiões do genoma não são as indicadas para distinguir indivíduos de uma população, não sendo, por isso, as eleitas em genética forense. Conceitos importantes Repetições em tandem são unidades de repetição dispostas em sequência nas regiões não codificantes do DNA. DNA satélite é um tipo de sequência em tandem, e é assim chamado por causa da observação de bandas satélites no DNA após centrifugação de gradiente de densidade. O DNA satélite pode ser encontrado nos centrômeros e telômeros, e é composto de longas sequências de repetições. Os minissatélites e microssatélites são dois outros tipos de repetições em tandem, só que menores que o DNA satélite. Os minissatélites, também conhecidos como VNTR (variable number tandem repeats) são maiores, compostos de unidades de repetição de 10-100 nucleotídeos de extensão. Os microssatélites, também conhecidos como STR (short tandem repeat) ou SSR (simple sequence repeat) possuem unidades de repetição de 2-6 nucleotídeos. 159 | A p o s t i l a P e r i t o C r i m i n a l Maior resolução da separação eletroforética dos fragmentos STR Podem ser usados para amplificação multiplex – análise vários marcadores ao mesmo tempo. Estreita faixa de tamanho de alelos que permite o desenvolvimento de PCR multiplex. Uma faixa de tamanho dos alelos que reduz as chances de amplificação diferencial dos alelos menores; Estes marcadores apresentam, comparativamente, os maiores valores de Conteúdo Polimórfico Informativo, Poder de Discriminação, Poder de Exclusão, Heterosigozidade e Índice de Paternidade Típico. Escolha dos STRs Os STRs mais usados são tetranucleotídeos. Unidades de repetição diméricas ou triméricas são muito abundantes, mas apresentam uma alta frequência de picos stutter que interferem com a interpretação do genótipo. As unidades hexaméricas ou pentaméricas são pouco abundantes no genoma. Um lócus STR deve ser altamente variável entre indivíduos. Se mais de um lóci for utilizado, eles não podem ser herdados ligados. Geralmente, estão localizados em cromossomos diferentes, mas desde que estejam distantes o suficiente em um mesmo cromossomo, podem ser utilizados. Para análises forenses, é preciso analisar no mínimo 7 lócus, sendo que o padrão são 13 lócus. Loci STR devem possuir alto poder de discriminação, usualmente superiores a 0,9 com heterozigosidade observada de 0,7 Devem estar localizados em cromossomos diferentes dos outros STRs usados na análise, a fim de garantir que loci ligados não sejam escolhidos Baixa taxa de stutter Baixa taxa de mutação Tamanho dos alelos deve abranger 90- 500pb Alto poder de exclusão – indica qual o percentual de exclusão alcançado por cada loco. Análise dos STRs Os STRs são analisados por meio da amplificação por PCR. São usados primers complementares às regiões que flanqueiam as repetições STRs. Figura 171. Lócus STR, mostrando as regiões flanqueadoras. Fonte: Forensic Biology. Figura 172. Efeito de uma mutação no sítio de anelamento do primer de STR. Fonte: Strategies for Concordance Testing O PCR multiplex pode ser usado, com primers marcados com diferentes cores fluorescentes.
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