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UNIVERSIDADE DO OESTE DE SANTA CATARINA – UNOESC ÁREA DAS CIÊNCIAS AGRÁRIAS CAMPUS APROXIMADO DE CAMPOS NOVOS CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA LIANA THAYSE RIBEIRO MAYÉLLI PALOMA PEREIRA BERTUSSO REVISÃO DE LITERATURA: CARACTERÍSTICAS ESPERMÁTICAS DE SUÍNOS Campos Novos – SC 2021 LIANA THAYSE RIBEIRO MAYÉLLI PALOMA PEREIRA BERTUSSO REVISÃO DE LITERATURA: CARACTERÍSTICAS ESPERMÁTICAS DE SUÍNOS Projeto de Pesquisa apresentado ao Curso de Medicina Veterinária, Área das Ciências Agrárias, da Universidade do Oeste de Santa Catarina – UNOESC, como requisito parcial para aprovação na componente curricular Fisiopatologia da Reprodução II Docente: Fábio José Gomes Campos Novos – SC 2021 SUMÁRIO INTRODUÇÃO 4 CARACTERÍSTICAS ESPERMÁTICAS DOS SUÍNOS 5 ANÁLISES MACROSCÓPICAS 10 ANÁLISES MICROSCÓPICAS 11 ARMAZENAMENTO 14 CONCLUSÃO 15 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 16 4 1. INTRODUÇÃO A suinocultura possui grande impacto na economia brasileira, sendo considerada uma prática de cunho social, cultural e fonte de renda para produtores rurais (OLIVEIRA et al., 1993). A contribuição desta atividade para o PIB agropecuário nacional no ano de 2019 foi de quase 27%, correspondendo a mais de 62,5 bilhões de reais. Além disso, a produção de suínos gera no país em torno de 126 mil empregos diretos e mais de 900 mil indiretos (SEBRAE, 2016; ABPA, 2020). Dentro da suinocultura, um dos pilares considerados primordiais para a continuidade da atividade é a reprodução, uma vez que a partir dela são gerados os produtos que serão comercializados ao fim do ciclo. Da mesma maneira, sabe-se que a reprodução controla (entre outras características) a qualidade do perfil sanitário dos rebanhos, já que grande parte das doenças são disseminadas por meio da introdução de reprodutores contaminados no plantel ou mesmo pelo repasse da matéria prima contaminada, o sêmen. No ponto de vista fisiológico, a qualidade do resultado reprodutivo está associada a diversos fatores, estando vinculada tanto à fêmea, quanto ao macho, no entanto a fertilidade do macho pode impactar em escala muito maior em comparação à fêmea. De forma geral, uma matriz suína produz em média 30 leitões ao ano, enquanto o macho pode gerar entre 6 a 7 mil descendentes no mesmo período quando utilizado em regime de coleta de sêmen. Dada a importância do macho na reprodução, com intuito de predizer como será seu desempenho reprodutivo, algumas características sexuais devem ser observadas antes de introduzirmos animais ou seu material genético no rebanho. Entre elas podemos citar: libido, número e qualidade das células espermáticas produzidas por unidade de tempo, bem como a capacidade fecundante destas células. Estudar as características, valores de referência e peculiaridades relacionadas à qualidade do sêmen do suídeo, bem como métodos de análise justificam-se importantes tarefas tendo em vista que estas análises trazem confiabilidade ao evento reprodutivo. 5 2. CARACTERÍSTICAS ESPERMÁTICAS DOS SUÍNOS A fim de compreender melhor as características reprodutivas do macho suídeo, é importante relembrar o processo de espermatogênese, uma vez que o espermatozóide é a unidade funcional básica dentro deste processo. A espermatogênese consiste no desenvolvimento de uma célula indiferenciada, denominada de espermatogônia tipo A, até o estágio final de espermatozóide. O período de transformação entre uma célula indiferenciada e o espermatozóide maduro pode levar até 60 dias. Nos mamíferos, este evento acontece de forma cíclica no epitélio seminífero, onde em um intervalo de 4 a 7 dias, espermatogônias tipo A iniciam uma nova onda de produção de espermatozóides (FLOWERS, W. l, 1996). No processo de diferenciação celular, após sucessivas divisões mitóticas, geram-se espermatócitos primários. Estes, após duas divisões meióticas, se tornarão espermátides haplóides que progredirão até o epidídimo onde sofrerão maturações fisiológicas funcionais até o estágio final (BORTOLOZZO, F. P. e WENTZ, 2005). Na espermatogênese, diversos aparatos fisiológicos são necessários, estando envolvidos basicamente dois tipos de células: as células de Sertoli, conhecidas como células de suporte nutricional ao espermatozóide, e as células de Leydig, produtoras de andrógenos, como a testosterona. A testosterona por sua vez é um andrógeno responsável pelo surgimento das características reprodutivas como a libido, ação de glândulas anexas, características de fenótipo masculino e também pela influência na qualidade da ejaculação. Esta cascata de eventos é, primordialmente, desencadeada pelos hormônios hipofisários LH (luteinizante) e FSH (folículo estimulante). Além dos órgãos primários, existem ainda glândulas anexas ao trato reprodutivo como a vesícula seminal que produz 90% do volume do ejaculado, a próstata, que alcaliniza o conteúdo seminal, e as bulbouretrais, responsáveis por construir o caráter gelatinoso ao sêmen (Bennemann, 2014). Em critérios práticos, a avaliação individualizada é uma das formas mais comuns de definir quando o macho suíno está apto à reprodução. Para isto, desenvolveu-se uma série de padrões seminais que podem estar correlacionados com a fertilidade ou infertilidade dos animais. Nesta análise são considerados diversos aspectos, entre eles podemos citar os macroscópicos, como: cor, odor, volume e aspecto; microscópicos, como: concentração espermática, motilidade, 6 morfologia, vigor e aglutinação espermática. Além destes, exames complementares podem ser realizados, como coloração supravital, teste de resistência osmótica, bacteriológico, acompanhamento morfológico após acondicionamento. Provas bioquímicas especiais como testes de acrosina, cromatina e fosfolipídios, bem como análise de íons e até mesmo fecundação in vitro, sendo estas realizadas com menor frequência, uma vez que sua viabilidade econômica é baixa (ABCS, 2014). 2.1 ESPERMATOZÓIDES E PLASMA SEMINAL De acordo com D. L (2004), o sêmen se refere a porção celular líquida contendo espermatozóides e as secreções dos órgãos acessórios do trato genital masculino. O plasma seminal compreende a porção fluida, sendo formada na ejaculação. As características seminais do macho suíno estão listadas na tabela 1. O ejaculado suíno possui três frações: pré-espermática, espermática e pós-espermática. A porção pré-espermática é composta pela secreção uretral de glândulas bulbouretrais, já a porção espermática, também chamada de rica, contém uma maior quantidade de espermatozóides, diferentemente da pós-espermática, que contém uma porção menor de espermatozóides (CORRÊA, 2001). 2.2 AVALIAÇÕES ESPERMÁTICAS A avaliação dos espermatozóides deve ser realizada para obtenção de animais que apresentem melhor fertilidade, resultando em excelentes índices reprodutivos. A análise de motilidade e morfologia dos espermatozóides são consideradas importantes para a seleção de um ejaculado. As características e componentes químicos do sêmen suíno estão listados na tabela 1. Um dos testes utilizados para avaliar a qualidade do sêmen em centrais de inseminação artificial é a determinação da porcentagem de espermatozóides móveis (VERSTEGEN, 2002), porém, muito se discute sobre motilidade e capacidade desses espermatozóides em fertilizar o óvulo. A quantidade e qualidade espermática tem sido baseada em avaliações subjetivas. O sistema de análise computadorizada (Computer Assisted Semen Analysis - CASA) permite uma análise de forma rápida e objetiva de diversas 7 características espermáticas. Essa avaliação é feita através de imagens e contagem de espermatozoides contidas nas mesmas. O sistema CASA reconhece o espermatozóide a partir da área de sua cabeça, de acordo com a espécie a ser avaliada (20 - 120μm2 - suíno). Entretanto, esse sistema pode sofrer influência de diversos fatores que podem alterar o resultado da avaliação, dependendo do uso de técnicas corretas para avaliação. Tabela 1. Características e componentes químicos do sêmende cachaços. Característica do componente Cachaço Volume do ejaculado (ml) 150 -500 Concentração espermática (milhões/ml) 200 - 300 Espermatozóides/ejaculado (bilhões) 30 - 60 Espermatozóides móveis (%) 50 - 80 Espermatozoides morfologicamente normais (%) 70 - 90 Proteínas (g/100ml) 3,7 pH 7,3 - 7,8 Frutose 9 Sorbitol 6 - 18 Ácido cítrico 173 Inositol 380 - 630 Glicerilfosforilcolina (GPC) 110 - 240 Ergotioneína 17 Sódio 587 Potássio 197 8 Cálcio 6 Magnésio 5 - 14 Cloreto 260 - 430 Adaptado de Lake. In: Bell, Freeman, eds. Physiology and Biochemistry of the Domestic Fowl. New York: Academic Press, 1971; e de Foote, Gilbert, White. In: Hafez, E. S. E., ed. Reproduction in Farm Animals. 4 ed. Philadelphia: Lea & Febiger, 1980. 2.3 COLETA DO SÊMEN Alguns aspectos envolvendo a coleta, análise, preparação, armazenamento e transporte da dose inseminante podem comprometer a viabilidade e eficiência da técnica. De acordo com Bortolozzo et al., 2010, a coleta do sêmen é realizada com 150 a 170 dias de idade, quando os animais chegam às granjas. O ideal é que se estipule horários e dias específicos para a coleta, evitando os períodos mais quentes do dia. Além disso, uma alta frequência de coleta pode afetar a motilidade, concentração e contagem total dos espermatozoides, contribuindo para espermatozoides com morfologias anormais (STRZEZEK et al., 1995). De acordo com alguns autores, a produção e qualidade do sêmen pode ser influenciada por fatores ambientais, raça, idade, fotoperíodo, ambiente, temperatura, alimentação e tamanho do testículo (COLENBRANDER et al., 1993). De acordo com Toniolli, 2010, a coleta em suínos jovens de até 12 meses de idade, pode ser feita de uma a três vezes por semana. Já em machos maiores de 12 meses, a coleta poderá ser feita duas vezes por semana. Para a coleta do sêmen, é importante que o animal e o coletador possuam uma boa relação, além disso, a condução do animal para a sala de coleta deve ser feita de forma tranquila para obtenção de um bom ejaculado. A técnica da mão enluvada é a mais empregada, com a estimulação mecânica do pênis (Toniolli, 2010), conforme a imagem 1. Imagem 1. A) Área de coleta de sêmen; B) Método de “mão enluvada” para coleta de sêmen. 9 Fonte: SOUSA, 2020. Após a coleta, a fração gelatinosa retida no filtro na borda do recipiente de coleta deve ser removida, e o ejaculado deve ser encaminhado para o laboratório para a análise macro e microscópica do sêmen, conforme a tabela 2. O sêmen, após pesagem, é acondicionado em um copo térmico para manter a temperatura. Após isso, é feita a retirada de 200 μL de sêmen puro e diluído em 2.000 μL de solução fisiológica a 0,9%, sendo a amostra analisada no microscópio óptico. Após a análise, ocorre o envasamento, onde o sêmen é inicialmente misturado a um diluente na proporção de uma parte de sêmen para dez partes de diluente. A composição do diluente contém gluconato, bicarbonato de sódio, estabilizantes de membrana e antibióticos, sendo que seu preparo é de acordo com as recomendações do fabricante. Para a homogeneização de ambos, é necessário ajustar a temperatura do diluente à temperatura do sêmen. Acrescenta-se o sêmen puro lentamente a solução diluente até que todo o volume fosse adicionado (Sousa, 2020). Tabela 2: Exames macro, microscópicos e complementares do ejaculado. EXAME MACROSCÓPICO EXAME MICROSCÓPICO EXAMES COMPLEMENTARES Volume Motilidade espermática Coloração supravital Cor Vigor Teste de resistência osmótica Odor Aglutinação Exame bacteriológica Aspecto Concentração espermática Acompanhamento da motilidade espermática durante o armazenamento Morfologia espermática 10 3. ANÁLISES MACROSCÓPICAS 3.1 ASPECTO O aspecto do ejaculado oferece informações sobre contaminações, avaliando cor e a presença de sangue ou urina, e, no caso de contaminações, o ejaculado deverá ser descartado, conforme a tabela 3. Tabela 3. Aspectos do ejaculado. Cor Presença Recomendação Avermelhado Presença de sangue Descarte Amarelado Presença de urina Descarte Branco Normal Aprovado 3.2 VOLUME O volume do ejaculado de um macho suídeo varia conforme uma gama de fatores, como sua raça, idade, número de coletas já realizadas e época do ano, chegando a valores entre 125 a 500ml. cada 1 grama corresponde a 1 ml. A determinação do volume do ejaculado é muito importante para a produção de doses de semen. 3.3 COLORAÇÃO A cor do ejaculado suíno também é variável conforme os fatores já citados, podendo apresentar-se branco-acinzentado ou marfim. Normalmente a cor é também um indicativo da concentração espermática, bem como parâmetro para identificação de alterações inflamatórias (presença de sangue pode avermelhar o sêmen). 3.4 ODOR O odor do ejaculado suíno, bem como da maioria das espécies é sui generis, ou seja, odor característico. Dessa maneira, a detecção de contaminação da 11 amostra seminal por urina ou outras secreções prepuciais se dá por meio da análise sensorial. 3.5 CONCENTRAÇÃO É possível estimar a concentração de forma subjetiva macroscopicamente, porém, devido a qualidade e a acessibilidade de métodos mais precisos como fotômetro, espermiodensímetro de Karras, câmara de Neubauer ou o próprio Sistema Computadorizado de Análises (CASA) se mostram ferramentas mais apropriadas. 4. ANÁLISES MICROSCÓPICAS As avaliações microscópicas definem se a amostra em questão tem potencial ou não de ser envasada. É a partir desta análise qualitativa que se pode atribuir os níveis de motilidade, patologias morfológicas e aglutinação espermática. 4.1 MOTILIDADE ESPERMÁTICA Consiste na quantificação de células espermáticas móveis, variando em uma escala de 0 a 100%. Neste exame verifica-se também a qualidade do movimento em uma escala de 0 a 5, onde 0 os espermatozoides estão mortos e imóveis e 5 os espermatozóides se mantém em movimento progressivo muito rápido. O percentual de motilidade é um critério com alta correlação ao percentual de células vivas e viáveis. O critério pré-estabelecido de motilidade é de 70%. A motilidade é importante na avaliação do deslocamento do espermatozóide até o oócito, e por ser um exame fácil e de baixo custo, é um bom indicador da integridade e funcionalidade dos espermatozóides (Braundmeier et al.; 2004). 4.2 VIGOR ESPERMÁTICO Esta característica estima a qualidade do movimento do espermatozóide e deve ser analisada em paralelo à motilidade. O valor de referência para o vigor espermático varia entre 0 (onde não há movimentos) a 5 (100% dos 12 espermatozóides com movimentos progressivos), devendo a amostra atingir no mínimo vigor 3 para não ser excluída. A variabilidade do escore de vigor pode ocorrer conforme a diluição do ejaculado ocorrer. Após a diluição, a amostra deve ser reservada por no mínimo 10 minutos a fim de neutralizar o efeito do choque osmótico que acontece no período inicial da diluição. 4.3 AGLUTINAÇÃO ESPERMÁTICA A aglutinação espermática consiste na aderência das cabeças dos espermatozóides umas nas outras. Esta característica pode ser classificada de 0 a 3, dependendo do número de grumos aglutinados. O ejaculado que apresenta mais de 30% de espermatozóides aglutinados deve ser descartado. 4.4 CONCENTRAÇÃO ESPERMÁTICA A concentração espermática associada ao volume do ejaculado determina o número total de espermatozóides e consequentemente o número de doses a serem produzidas. Esta característica pode ser determinada de forma direta pela câmara de Neubauer e CASA ® e indiretos com fotocolorimetria e espermiodensímetro de Karras. Existem alguns equipamentos para avaliação da concentração em suínos: a. Câmara de neubauer: avalia a concentração espermática através da contagem de células. b. Espermiodensímetro: avalia a concentração espermática através da opacidade, porém, a margem de segurança é menor em comparação com outros equipamentos. c. Espectrofotômetro ou fotocolorímetro: avalia a concentração através da passagem de ondas luminosaspela amostra, possuindo boa segurança na sua utilização. 4.5 MORFOLOGIA ESPERMÁTICA Esta característica é muito importante durante a avaliação espermática. Nela são avaliadas as proporções entre espermatozóides viáveis e inviáveis, permitindo predizer a fertilidade do macho. Habitualmente, defeitos estruturais acometendo 13 mais de 20% dos espermatozóides indica baixa fertilidade. Neste exame são avaliadas qualitativamente morfologias de acrossoma, cabeça, colo, peça intermediária, gota citoplasmáticas (proximal e distal) e a cauda. A tabela 4 indica as alterações morfológicas e também o limite máximo tolerado em percentual para cada característica. a. Cabeça: alterações de cabeça se dão pela forma, tamanho e destacada. Estas alterações estão normalmente relacionadas a defeitos no material genético e por isso devem ser avaliadas. Defeitos comuns encontrados na cabeça são cabeça reta, invertida, estreita, larga, piriforme, globosa, microcefalia e cabeça estreita na base. b. Acrossoma: o acrossoma é peça fundamental na fecundação e desta forma é necessário se atentar às alterações, como o acrossoma difuso, deformado, de contorno irregular e destacado. c. Gota citoplasmática: a gota citoplasmática reflete no estágio de maturidade espermática. Tabela 4. Alterações avaliadas durante o exame morfológico do sêmen e limites máximos aceitáveis. Alteração morfológica Limite máximo tolerado (%) Cabeça 5 Acrossoma 5 Colo 5 Formas teratológicas 5 Peça intermediária 10 Gota citoplasmática proximal 10 Cauda 10 Total de alterações 20 Fonte: Fonseca et al. (1992). 14 5. ARMAZENAMENTO A temperatura é um método utilizado para prolongar a viabilidade dos espermatozóides ejaculados devido ao efeito da desaceleração dos processos metabólicos celulares. Nos suínos os espermatozoides são sensíveis a menos de 15 C e como consequência diminui a taxa de sobrevivência espermática, sendo considerada a temperatura ideal entre 16 a 17 C em estufas ou refrigeradores. É sugerido a homogeneização duas vezes ao dia, o tempo máximo de armazenamento não deve ser superior a 72 horas, podendo comprometer a qualidade. 15 6. CONCLUSÃO Conforme o exposto, a avaliação do sêmen é de fundamental importância para identificar problemas de infertilidade em suínos, principalmente pelo fato do macho possuir uma maior importância na cadeia reprodutiva em comparação à fêmea. Os métodos da avaliação dos espermatozoides auxiliam na observação do potencial fecundante do animal, bem como as características espermáticas e seu desempenho reprodutivo. 16 Referências Bibliográficas BORTOLOZZO, F. P. WENTZ, I. Exame do ejaculado. In: BORTOLOZZO F. P. WENTZ I. FERREIRA F. M. BENNEMANN P. E.BERNARDI M. l. Inseminação artificial na suinocultura tecnificada, Porto Alegre. Pallotti, v. 2, p. 69-90, 2005a. BROEKHUIJSE, M. l. W. J.; FEITSMA h., GADEIA, B. M. Additional value of computer assisted semen analysis (CASA) compared to conventional mo-tility assessments in pig artificial insemination. Theriogenology 2011; 76:1.473-86. COLENBRANDER,B.;FEITSMA,H.;GROOTEN,H.J. Optimizing semen production for artificial insemination in swine. 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