Imunologia- Imunodiagnóstico

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4º Semestre 
Imunologia 
 
 
IMUNODIAGNÓSTICO 
São testes que dependem da ligação 
de Ag com Ac específicos. 
 
Toda vez que se fala de um ensaio 
diagnostico que utiliza um antígeno na 
busca de um anticorpo, ou vice-versa, 
estamos falando de um 
imunodiagnóstico. 
A interação Ag-Ac é um tipo especial 
de reação química e, como tal, sujeita 
a vários tipos de forças. 
 
Doenças infecciosas: Quando se trata 
de doenças infecciosas existe algumas 
possibilidades de diagnóstico 
1- Detectar o agente- através do 
isolamento (cultura do agente), ou de 
ensaios moleculares (PCR). 
 
 
 
 
2- Detectar a resposta do 
organismo contra o agente. 
 
APLICAÇÕES CLÍNICAS 
-Finalidades de pesquisa. 
-Diagnóstico. 
-Inquéritos epidemiológicos. 
-É mais barato que fazer o isolamento 
do microrganismo. 
 
Exemplos: 
Teste de biologia molecular: Visa 
detectar o material genético do vírus. 
Coleta-se uma amostra e procura-se 
por amplificação do material genético 
a presença do agente. 
 
Teste rápido e sorológico: Procuram 
anticorpos. O sorológico realizado em 
laboratório consegue diferenciar a 
presença de IgM ou a presença de 
IgG. 
Se o paciente tiver alta concentração 
de IgM quer dizer que ele está no 
período agudo da doença. Se for 
detectado maiores concentrações de 
IgG do que de IgM quer dizer que o 
paciente já está na fase de proteção 
transitória. 
A grande maioria dos testes rápidos 
são detectores de IgG, alguns 
detectam IgM também. O teste é 
realizado através de uma gota do soro 
do paciente que é colocado no 
dispositivo para ver se ocorre a 
interação entre antígeno e anticorpo, 
se houver, uma linha será formada. 
 
TIPOS DE 
IMUNODIAGNÓSTICOS 
Precipitação 
Foram as primeiras a serem utilizadas. 
Está baseada no fato de que os 
complexos Ag-Ac formam uma malha 
de grandes agregados insolúveis, que 
são possíveis de serem visualizados, 
muitas vezes a olho nu. 
É um método com baixa sensibilidade, 
(necessita grande quantidade de 
anticorpos circulantes), apesar de ter 
boa especificidade. 
Sensibilidade: Detecta mesmo 
quantidades muito pequenas daquilo 
que você está procurando. 
Especificidade: Teste que reações 
falso positivo quase não existem. 
 
Vantagem: Teste barato e com boa 
especificidade. 
Desvantagem: Existem vários fatores 
físicos, químicos e biológicos que 
interferem no resultado. 
 
Portanto, tenta-se sempre chegar 
numa zona de equivalência, em que se 
consegue visualizar a olho nu, sendo a 
precipitação máxima. 
É um diagnóstico lento, demora 
aproximadamente 48 horas. 
 
As reações de precipitação são: 
-Imunodifusão: Processo pelo qual a 
substância é transportada de uma 
parte para outra, como resultado do 
movimento molecular ao acaso. 
 Isso acontece ou em meio líquido, ou 
em meio semissólido. Pode se ter um 
ensaio simples em que se fixa um dos 
reagentes no suporte e difunde-se o 
outro, ou, um ensaio duplo em que 
ambos se movem. 
É utilizado no diagnóstico de anemia 
infecciosa equina, mas está sendo 
substituído pelo ELIZA. Também é 
utilizado na detecção de influenza em 
aves e artrite infecciosa caprina. 
 
-Imunodifusão dupla. 
 
 
-Imunoletroforese: Processo de 
separação de proteínas pela migração 
dessas proteínas em um gel. 
Identificação de misturas complexas 
de Ag que são separados em gel de 
agarose, pela aplicação de uma 
corrente elétrica. 
 As moléculas migram, distribuindo-se 
no gel de acordo com os seus PM e 
cargas elétricas. 
Teste de “Western Blotting”. No Brasil 
não é utilizado. 
 É utilizado um anticorpo secundário 
marcado contra o anticorpo procurado 
para ser possível a visualização e 
detecção. 
 
Aglutinação 
Teste bastante simples, baseado na 
formação de grandes agregados de 
imunocomplexos. 
Os agregados se formam porque os 
anticorpos se ligam em sítios 
antigênicos iguais e em partículas 
diferentes, formando grandes 
agregados visíveis a olho nu. 
O problema é que nem todos os 
anticorpos formam esses agregados, 
apenas algumas enfermidades. Ex: 
Brucelose. 
Também é um teste utilizado para 
saber a compatibilidade sanguínea. 
 
Vantagens: Baixo custo, leitura visual 
e facilidade de execução. 
Desvantagens: A temperatura 
interfere no resultado. 
 
Reações de aglutinação: 
Ocorre quando se formam agregados 
grandes de partículas com múltiplos 
determinantes antigênicos 
interligados por pontes moleculares 
de anticorpos. 
■ Ligam-se em dos sítios antigênicos 
iguais em partículas diferentes; 
■ Presença de IgG e IgM; 
■ A visualização depende dos 
agregados formados. 
■ Pode ser realizada em placas, tubos 
ou em lâminas. 
 
 
Imunoensaios 
Utilizam sinalizadores de interação Ag-
Ac com conjugados ligantes. 
Eles só funcionam porque existe uma 
alta afinidade do anticorpo com o 
antígeno que estimulou a sua síntese. 
Existe uma contraindicação no uso 
desse diagnostico pois, não se deve 
utilizá-lo em pacientes vacinados já 
que a vacinação estimula a produção 
de anticorpos assim como a infecção. 
Bactérias podem levar a reações 
cruzadas pois, os microrganismos 
serem muito parecidos. 
 
Imunocromatografia 
“Teste rápido” 
Em uma membrana de nitrocelulose, é 
inserido, ou o antígeno ou o anticorpo 
referente á aquilo que se quer 
diagnosticar. 
Pode ter ou o ac ou o ag marcado, 
depende do que se quer detectar. 
Toda vez que for realizar um teste 
desse, tem que saber se o teste é de 
antígeno ou de anticorpo. 
Pois, se houver busca por anticorpo e 
o animal for vacinado, poderá 
aparecer um falso positivo. Testes que 
procuram o ag também podem dar 
falsos positivos. 
■ Duas fases 
■ Na primeira fase 
– SORO TESTE (anticorpo) + o 
antígeno + complemento são 
misturados e incubados. 
– Se TIVER AC, o complexo antígeno-
anticorpo é formado e o complemento 
é fixado. 
Exemplo: Teste de gravidez- nesse 
teste se detecta o hormônio beta-Hcg, 
produzido pela fêmea gestante. Então 
na membrana se coloca um anticorpo 
anti-beta-Hcg, se houver o hormônio 
ele irá migrar através da membrana e 
entrará em contato com o anticorpo 
marcado, aparecendo a linha. 
 
Fixação de complemento 
Também é um teste que está caindo 
em desuso, era o exame mais 
realizado para o teste do mormo e vem 
sendo substituído pelo ELIZA. 
Este teste vai utilizar algumas funções 
das proteínas do sistema completo, 
que são: 
1- Lise direta da célula. 
2- Opsonização e auxílio ao 
anticorpo. 
3- Auxiliar a diapedese. 
4- Ajudar na limpeza imune. 
Esse teste se baseia na função lítica do 
sistema complemento, quando se liga 
a um complexo Ag-Ac. 
 
 
 
É um ensaio feito em 2 fases: 
Fase 1– SORO TESTE (anticorpo) + o 
antígeno + complemento são 
misturados e incubados. 
– Se TIVER AC, o complexo antígeno-
anticorpo é formado e o complemento 
é fixado. 
-Se não tiver Ac, o complemento vai 
ficar livre (disponível). 
 
Fase 2- Um complexo formado por 
hemácia (de carneiro) +anticorpo anti-
hemácia – o qual funciona como um 
complexo revelador, é adicionado à 
mistura. 
– Se o complemento foi fixado na 
primeira fase - não estará mais ativo ou 
disponível para atuar no complexo 
hemácia-anticorpo e, assim, as 
hemácias permanecerão intactas e não 
serão lisadas – Positivo 
-Se o complemento não for fixado, 
estará disponível e as hemácias 
sofrerão lise- Negativo. 
Desvantagens: Pode ter resultados 
inconclusivos e a dificuldade de se 
conseguir o sangue de carneiro. 
 
Teste de neutralização 
Bastante utilizado para cinomose. 
Usado para identificar e mesurar 
toxinas. 
▪ Estimam a habilidade de anticorpos 
em neutralizarem, a atividade 
biológica do Ag quando misturados in 
vitro. Esse ensaio só funciona em 
doenças que provocam efeitos 
citopáticos nas células. 
▪ Identificar toxinas bacteriana. 
▪ Impedimentode vírus de infectar 
células após Ac específico ter se 
combinado e bloqueado seus sítios 
críticos de ligação. 
▪ Mensuração de Ac antivirais. 
Vírus infeccioso – neutralizado por 
anticorpos específicos - perde a 
capacidade de infectar células 
permissivas. 
Duas etapas 
1.Vírus infeccioso + amostra do 
paciente - incubados para que ocorra 
a interação vírus-anticorpo. 
2.Alíquotas da mistura vírus-anticorpo 
– inoculadas num hospedeiro 
permissivo, geralmente cultura de 
células. Após a incubação, a cultura é 
observada para visualizar se houve 
efeito citopático. 
Se os anticorpos se ligaram ao vírus na 
primeira etapa – neutralizado e não irá 
infectar a cultura de células. 
Consequentemente, não haverá 
Efeitos citopáticos. POSITIVO. 
Como o paciente tinha anticorpos, 
bloqueou a ação do vírus (positivo). 
 Se os anticorpos não se ligarem ao 
vírus na primeira etapa – vírus 
permanecerá infeccioso e irá infectar a 
cultura de células. NEGATIVO. 
Produzindo efeitos citopáticos. 
 
 
 
 
 
 
Imunohistoquímica\Imunocitoquí
mica 
É um teste imunológico que utiliza uma 
reação química nos tecidos ou nas 
células. Nesse teste se procura o 
agente e não o anticorpo. 
Localiza-se o epítopo de interesse em 
cortes de tecido, o tecido é do ser vivo 
e conservado/ fixado por 
congelamento ou por métodos 
químicos (formaldeído) e embebido 
em parafina. Depois, são obtidas 
secções muita finas, que são colocadas 
em laminas de vidro. 
Encuba-se o material contra os 
agentes que se quer identificar. 
Ex.: Se estiver procurando 
toxoplasma, encuba a lamina com 
anticorpo anti-toxoplasma. A reação 
vai aparecer pois o anticorpo está 
marcado com algum substrato 
químico. 
É possível localizar os Ag nos 
componentes histológicos e celulares, 
mantendo a arquitetura original do 
tecido circundante, 
É utilizado não só para identificar o 
agente, mas também tumores, 
estadiamento e malignidade. É um 
método de análise dos tecidos via 
microscópio, que permite a 
visualização de características 
moleculares das doenças 
(inflamatórias, infecciosas e 
neoplasias). 
Pode analisar biopsias e aspirações. 
 
 
 
 
Imunofluorescência 
Baseia-se na capacidade das 
moléculas de anticorpo se ligarem 
covalentemente a fluocromos (Ac 
marcados), mantendo a especificidade 
contra o antígeno. 
A imunofluorescência possui o mesmo 
processo que a Imunohistoquímica, só 
que está marcada com uma substância 
que resultará em uma fluorescência. 
É um diagnóstico 100% confiável. 
Se o paciente for negativo, a reação 
não apresentará cor. 
A desvantagem da imunofluorescência 
é a necessidade de se ter um 
microscópio de fluorescência 
(bastante caro). 
 
 
 
 
 
ELISA- Enzyme Linked Immuno 
Sorbent Assay 
Objetivo: Detectar a presença de 
antígenos e anticorpos. 
Realiza a quantificação da 
concentração da amostra em análise 
ou relato dos valores das absorbâncias 
(expressão do resultado em 
unidades). 
 
Detecção de anticorpo: Fixa-se 
antígeno na placa. 
Detecção de antígeno: Fixa-se 
anticorpos na placa. 
 
Vantagens: - Sensibilidade, 
especificidade e simplicidade da 
técnica; 
-Cuidados com interferentes, reações 
cruzadas 
– Versatilidade, rapidez, baixo custo e 
objetividade da leitura. 
-Quantificação. 
 
Desvantagens - Erros operacionais, 
variáveis analíticas 
-Adaptação a diferentes graus de 
automação. 
- Instabilidade dos reagentes. 
- Influência em manipulações e do 
equipamento. 
O kit manda o antígeno secundário 
marcado que vem de uma outra 
espécie sem ser a analisada. 
Se for positivo vai ficar marcado e 
aparecerá uma cor, se for negativo não 
vai ter cor nenhuma. 
 
 
Titulação 
É a diluição, significa o tanto de vezes 
que o soro do paciente é diluído e 
continua apesentando anticorpos 
contra determinado agente. 
Quanto maior a quantidade de 
anticorpo circulante, maior a chance 
de se estar diante de uma doença e não 
de uma vacinação. 
Titulação ou sorologia pareada: repte 
o procedimento após 15 dias. 
Curva padrão: Você faz a diluição e 
conhece o que tem dentro de cada 
parte da placa. 
 
 
Citometria de fluxo 
 
Separa as células pelo seu tamanho, 
granulosidade e fluorescência de 
acordo com o anticorpo utilizado. 
É um equipamento muito sensível. 
 
Desvantagem- Extremamente caro. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Júlia Marcello- Universidade de 
Sorocaba 2020.