Viabilidade Celular

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Viabilidade Celular
MTT
A avaliação da atividade metabólica celular é importante para avaliar a viabilidade e proliferação celular.
Para isso, utilizamos o MTT (metiltetrazólio), que é um ensaio colorimétrico que avalia a viabilidade
celular, citotoxidade e até mesmo a atividade citostática de agentes farmacológicos ou tóxicos. O
MTT é um composto orgânico heterocíclico sintético que possui uma cor amarela, porém é convertido em
um composto roxo chamado formazano quando sofre o processo de redução em células metabolicamente
ativas.
Esse processo de redução do MTT ocorre no interior das mitocôndrias, e é realizado pela enzima
oxidoredutase, que depende do pH, sendo assim um processo que necessita da atividade metabólica
celular. Células com baixa viabilidade são consideradas menos metabolicamente ativas, reduzindo menos
MTT. Através da concentração da cor, podemos inferir a viabilidade das células por colorimetria.
Esse ensaio pode ter várias aplicações como, por exemplo: testar a sensibilidade à drogas, verificar a
resistência cruzada, medir o efeito da combinação de drogas, a taxa de proliferação celular diante de
fatores de crescimento, avaliar a citotoxidade de medicamentos e determinar IC50 de uma droga. Ele é
extremamente vantajoso, por ser rápido, versátil, quantitativo, reprodutível e barato. Porém, como toda
técnica laboratorial, pode apresentar limitações. Apenas células vivas com mitocôndrias e membrana
celular intactas podem catalisar a reação.
● Célula viável = desidrogenase mitocondrial em funcionamento
● Célula morta = não é capaz de reduzir o MTT a formazan
*Células viáveis formam longos cristais de Formazan ao redor de si mesmas durante o ensaio. Para leitura,
esses cristais precisam ser solubilizados!
Etapas
1. Colocar as células em uma placa de 96 poços.
2. Incubar a 37°C por 24h.
3. Adicionar 20 microlitros de 5mg/ml de MTT em cada um dos poços.
4. Incubar a 37°C por 4h.
5. Remover cuidadosamente metade da solução de cada poço.
6. Adicionar 200 microlitros de DMSO a cada poço.
7. Ler à 595nm.
Contagem Celular em Câmara de Neubauer
Materiais
● Corante azul de Trypan a 0,4%
● Cultura uniforme de células em suspensão
● Frasco vazio
● Micropipeta
● Suporte para frascos
● Pontas de pipeta
● Câmara de Neubauer
● Lenço de papel
● Frasco com água
● Spirit (? Coiso de limpar mas n entendi se tem tradução ou não)
● Lamínula de vidro
Etapas
1. Todos os materiais devem ser organizados e postos dentro da capela de fluxo laminar
2. Ajustar a micropipeta na escala dos 10 micrômetros.
3. Inserir uma nova ponta na micropipeta.
4. Abrir a cultura de células e misturar três vezes com a micropipeta, para conferir uniformidade.
5. Transferir 10 microlitros de líquido da cultura para um frasco vazio, o fechar e mantê-lo no suporte
para frascos.
6. Descartar a ponta utilizada na micropipeta e inserir uma nova.
7. Abrir o azul de Trypan e misturar três vezes com a micropipeta, para conferir uniformidade.
8. Transferir 10 microlitros de líquido do corante para o frasco já contendo os 10 microlitros da cultura
de células
9. Misturar o conteúdo do frasco, o fechar e mantê-lo no suporte para frascos por de 5 a 15min.
10. Alocar a câmara de Neubauer em cima de um papel branco.
11. Higienizar a superfície da câmara com o lenço de papel.
12. Colocar uma nova ponta na micropipeta
13. Coletar uma pequena quantidade de água para pipetar algumas gotas na superfície da câmara, isso
confere estabilidade para a colocação do próximo item.
14. Limpar a lamínula de vidro e a posicionar na câmara de Neubauer.
15. Colocar uma nova ponta na micropipeta.
16. Abrir o frasco onde há cultura de células colorida com o azul de Trypan e coletar 10 microlitros, após
misturá-la.
17. Colocar essa solução cuidadosamente sob a câmara de Neubauer, sem encostar a ponta da pipeta
na borda da lamínula de vidro.
18. Observar no microscópio e fazer a contagem em cada um dos quatros quadrantes externos.
Resultado
Células vivas não apresentam cor, mesmo sob contraste, enquanto células mortas permanecem azuis. É
importante manter uma contagem diferente para as células viáveis e as não-viáveis. Para descobrir o
resultado final, realizamos os seguintes cálculos.
viabilidade celular total = viabilidade celular/ml x volume original de onde a amostra foi retirada
Dicas Para Uma Boa Contagem
● Realizar a diluição adequada e contar de 100 a 150 células nos 4 campos
● Limpar a câmara e passar água nos pilares para prender
● Não perder volume do líquido na câmara ou na ponteira
● Preencher todo o retângulo sem fazer bolhas
● Contar adequadamente em L
● Sempre homogeneizar os líquidos