Aula 04 - Ferramentas

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Aula 04 – Genética
DNA pode estar na forma de cromossomo (na fase metáfise) ou não. 
Estrutura do DNA é uma dupla hélice com bases nitrogenadas ( A-G, T-C), entre as fitas a ligação é fraca (ponte de hidrogênio), na fita é uma ligação forte (fosfodiéster). Sentido 5’ > 3’; 
DNA duplica seu material genético para crescimento, com essa informação sendo representada através transcrição e da tradução da proteína.
Contituição de um gene: ocupa um locus no genoma, e possui exons (regiões codificantes) e introns (região não transcrita). RNAm só tem éxons pelo processo de splicing (retirada dos íntrons e união dos éxons). Se intron estiver alterado, splicing não funciona e RNAm pode estar alterado.
Tod proteína tem diversos aminoácidos, se trocar um aminoácido, a proteína não será a mesma.
Código genético: saber dos códons. Várias trincas podem dar a mesma coisa.
MUTAÇÃO: alteração do DNA que gera fenótipo diferente.
TIPOS DE MUTAÇÕES:
Silenciosas: muda base, mas não troca aminoácido, não confere prejuízo
Missense: única troca de nucleotídeo, alterando aminoácido. As mais frequentes,
Nonsense: mutação STOPcódon, troca de nucleotídeo troca aminoácido, fazendo parar. Gera códon de parada prematura.
Mutação frameshift: muda frame de leitura da proteína. Ex.: deleções ou inserções de base, que fazem com quem em determinado ponto o frame de leitura da proteína mude. Alterando todas as trincas a partir dali.
Alterações no mecanismo de splicing: antes no exons tem regão doadora de splicing e depois tem região aceptora. (sempre 50 nucleotideos antes ou depois do exons).
Todas podem ser investigadas por técnicas.
“O padrão de herança mendeliano apresenta um mecanismo rígido e invariável seguindo sempre regras fixas e preestabelecidas? ”
A reposta pode ser não, pois existem fatores como a penetrância incompleta, pleiotropia, mutações novas.
A reposta pode ser sim em caso de padrão autossômico dominante, em que a chance de afetação será de 50%. E no caso de padrão autossômico recessivo será de 25%.
Os distúrbios monogênicos podem ser localizados em cromossomos autossômicos e cromossomo X. Pode ser no Y, mas é muito pequeno. Pode se ter genes do cromossomo autossômico, do cromossomo Y ou do cromossomo X, que vão apresentar-se com suas características na hora da segregação.
Só que se fosse invariável, e não houvessem variações, seria muito fácil de se entender todos os distúrbios. O que impede e dificulta a resposta dessa questão? Mutação nova, penetrância, expressividade variável, pleiotropia, imprint (duas cópias do alelo proveniente de um dos genitores, exemplo: um pai tem um alelo mutante para fibrose cística -é heterozigoto- e a mãe é normal, e o filho é afetado. Mas como, se precisa de um alelo afetado da mãe? A explicação é o imprint parental, tem duas cópias do pai para o filho e ele se torna afetado). Isso é muito complexo, por isso não estudamos.
Quais são os fatores de risco dos distúrbios monogênicos?
 Consanguinidade (favorece mutações de padrão autossômico recessivo)
 Idade do pai > 40 anos (favorece mutações de padrão autossômico dominante)
 Idade materna > 35 anos (afeta em padrões cromossômicos, como o caso da trissomia do 21)
 Recorrência familial (não é um fator de risco populacional, mas sim para a família que a possui; se tem uma recorrência, o alelo está presente, podendo se manifestar)
 Origem étnico-geográfica também (anemia falciforme pode ser um exemplo)
FERRAMENTAS MOLECULARES APLICADAS AO DIAGNÓSTICO
Existem inúmeras ferramentas para o diagnóstico. Exemplo: teste do pezinho, em que são feitos alguns testes. Na fibrose cística, por exemplo, em que se faz o teste do suor. Isso possibilita uma previsão de se há presença de determinado distúrbio ou não. Mas, quando se trata de um distúrbio monogênico, o melhor de todos os testes é o sequenciamento automático. Porque com o sequenciamento você vai observar cada base nitrogenada do seu gene. Se você já suspeita de um gene, pode ir diretamente para aquele gene e ver base por base, comparando com o normal e vendo o que está certo e o que não está. Isso se faz no sequenciador.
O que será sequenciado é o ácido nucleico, que pode ser tanto DNA quanto o RNA. O RNA é terrível para se trabalhar. O DNA é ótimo, você extrai, deixa na bancada, na geladeira, em qualquer local, ele é estável é dupla fita. Se você faz uma extração de DNA bem-feita, você tem material para ser usado por décadas. Professor diz que trabalhou em um laboratório que tinha DNA de 30 anos, e ele ainda usou por mais 10, sendo que estava ainda em plena integridade. O RNA é muito trabalhoso, muito chato, degrada muito fácil, tem que deixar ele no menos 80 (temperatura), ele é muito instável. Por isso que todos os grupos, todos os diagnósticos, tem suas ferramentas desenhadas para se trabalhar no DNA. DNA e cromossomo: são a mesma coisa? Sim, só muda a forma de apresentação. São formas diferentes de apresentação dependendo do ciclo da célula. Se é uma divisão, estará na forma de cromossomo; se é na interfase, ele vai estar na forma descondensada, desespiralizada. O cromossomo se separa por etiologia. O monogênico é em um único gene, no pedaço do genoma, que tem começo, meio e fim. Que será responsável por uma proteína. Os distúrbios cromossômicos, são distúrbios grandes, como faltar um braço, faltar um pedaço do cromossomo, ter uma deleção, ter cromossomo a mais. Ou seja, tem um material genético a mais, tem DNA sobrando ou DNA faltando. Tudo é a mesma coisa. Com a descoberta do DNA, tudo se tornou mais claro e com isso foi possível o desenvolvimento de técnicas e ferramentas (aparelhos) para se estudar esses distúrbios.
O conhecimento do mecanismo celular também tornou tudo mais claro: o DNA se replica, ele se transcreve e depois traduz em uma proteína. Ou seja, uma informação guardada pode sofrer algumas alterações, pode ser replicada e pode ser responsável por uma informação, uma proteína. Então, isso tem que estar bem claro, quando se vai estudar o distúrbio. Que é: o distúrbio em determinado gene que vai causar distúrbio em uma determinada proteína. Sendo que essa proteína pode ser uma enzima, por exemplo. Na hiperplasia por exemplo, há uma alteração que produz uma enzima defeituosa, não efetuando sua função como deve.
Os genes foram esmiuçados depois da descoberta do DNA, e em conjuntura com o projeto genoma. Então hoje está claro o número de genes e a posição de cada um deles (se sabe o local que cada um ocupa dentro do cromossomo). Essa localização foi depois de muito estudo conhecendo o material genético. Então, para que nós possamos identificar a alteração na proteína e qual o efeito de uma mutação, o que fazemos? Para essa resposta, eu tenho que saber exatamente a localização do gene, quantos éxons, quantos íntrons.
Um gene tem uma região promotora, conhecida como 5’UTR depois existem éxons e íntrons (regiões do gene) e a região 3’UTR. Então temos partes não traduzidas no começo e no final: 5 e 3 não são. Seria correto dizer que somente os éxons são importantes? Não, todas as regiões são importantes. Sem a parte 5’/3’, por exemplo, não há proteína. Regiões no começo de um éxon e no final dele, até 100 pares de base antes e depois; e no meio do íntron, o splicing passa.
O processo de splicing reconhece e excisa (retira), para que o RNA mensageiro possa ser sintetizado. Você conhecendo tudo isso, pode propor uma estratégia para estudar esses fragmentos. Atualmente, existe n técnicas, mas a melhor e mais eficaz é o sequenciamento. O éxon começa em um ATG, que é um star códon (códon de iniciação), e vai até um stop códon.
A cada 3 bases nitrogenadas (a cada códon), forma um aminoácido. cDNA é o DNA codificante, sem íntron, só éxon. Ele tem as trincas que correspondem ao aminoácido. Vai passar o RNA transportador ali, depois virá o RNA mensageiro e vai formando a cadeia polipeptídica, que vai formar a proteína.
Então, toda essa introdução foi feita para que nós possamos tratar do sequenciamento. Nós precisamos saber tudo isso para cada gene. Precisamos saber: o tamanho do gene,a função dele, qual é a proteína produto. Isso é feito para que se possa propor estratégias de estudo. Então sabemos que a cada trinca se forma um aminoácido. Com isso, você vai sequenciar seu fragmento, vai ver a base alterada e vai ver se essa base alterada vai alterar o aminoácido.
O código genético é degenerado. Então dependendo as trocas não terá problema nenhum, pois o aminoácido não será alterado. Mas quando ele é alterado irá promover modificações, pois a composição bioquímica dos aminoácidos tem toda a importância da função da proteína. Quando a gente pega um distúrbio para fazer uma análise molecular um pouco mais aprofundada, primeiro a gente faz toda a averiguação, de qual o tamanho do éxon, quais as mutações descritas.
Por exemplo: tem um gene com mais mutações no éxon 5. Então qual a estratégia? Começar pelo éxon 5, pois ele pode ser um hot spot (muitas mutações naquele gene). Começa do éxon 5, fazendo um estudo das mutações e vai traçando a estratégia. Se um gene tem 1000 mutações, por exemplo, não há diferença de onde vai começar. Se começa do começo e sequencia tudo, um por um.
O sequenciador só dá a sequência bruta das bases. A análise é feita pelo profissional, com auxílio dos programas de software, onde se comparam as sequências obtidas com as normais (banco de dados). Através dessa comparação eu vejo se está normal ou alterada, se as alterações são mutações ou polimorfismo. Tudo isso eu consigo no banco de dados. Se eu acho uma mutação nova, eu vou e atualizo o banco de dados. Eu publico a alteração e posso acessá-la no banco de dados.
Polimorfismo: se um gene é rico em polimorfismos, ele pode apresentar relações polimórficas entre um e outro (pessoas), e não vão alterar relação na produção. Exemplo: um gene para produção de insulina entre duas pessoas pode se apresentar de maneiras distintas, porém, o produto final continua sendo o mesmo. Podem existir muitas alterações e no fim nenhuma delas representar um distúrbio. Enquanto isso pode existir uma só alteração que irá abolir a função plena do gene.
Os polimorfismos genéticos são variações na sequência de DNA que podem criar ou destruir sítios de reconhecimento de enzimas de restrição e parecem estar associados a apenas uma base. A frequência de alelos heterozigotos para o polimorfismo genético ocorre em mais de 2% da população. Algumas dessas alterações ocorrerão em sequências não codificadoras do gene, que na maioria dos casos não terão efeito em suas funções; outras ocorrerão em sequências codificadoras, levando à produção de proteínas defeituosas.
Dentro de uma mesma família existe um perfil de vários polimorfismos, variações polimórficas. Quando eu tenho vários polimorfismos em um gene, como eu posso saber se isso não representa uma mutação? Isso se faz por análise estatística. Por exemplo: você tem uma alteração num determinado aminoácido, e nunca foi descrita. Só que fenotipicamente não se há uma característica específica que se possa atribuir a essa alteração. Então o que se faz? Uma análise funcional com modelos animais. Primeiramente se faz uma análise estrutural, da proteína. E depois uma análise funcional, em que se insere sua mutação no vetor e observa se a alteração influencia na função da proteína. E depois se faz no modelo animal. Também pode se buscar saber se essa alteração já foi encontrada em outros indivíduos, e se ela trouxe alguma alteração. As vezes a alteração encontrada não é nada de mais, apenas uma variação da normalidade. Pode ser uma mutação não patogênica.
A mutação silenciosa, por exemplo, pode não representar nenhuma modificação fenotípica. Isso porque o código genético é degenerado. Sendo assim, nem sempre a troca de uma base resultará em introdução de aminoácido distinto. Mais de uma trinca podem corresponder a um mesmo aminoácido.
Vários polimorfismos somados viram uma bola de neve, formando um efeito sinergístico, gerando um fenótipo. Isso se observa nos distúrbios multifatoriais. Existe a susceptibilidade para certos distúrbios, mas caso não haja o desencadeante ambiental a pessoa não expressa.
Qualquer troca com cysteina será muito prejudicial. A cysteina tem o enxofre em sua característica, e é o único amino ácido que tem enxofre. Qualquer alteração envolvendo cysteina será muito prejudicial a proteína, tanto ganhar essa cysteina, quanto perder essa cysteina, porque o enxofre tem função estrutural na proteína.
Se trocar por um stop códon, não terá função. Se a proteína tem 900 aminoácidos e o stop códon está no 800 e pouco, pode até ser que ainda tenha função. Para verificar isso eu faço analise funcional. Se for no início da proteína, a uma proteína será truncada, não terá função.
Nesse momento, o professor começa a falar dos tipos de mutações mas diz aos alunos para que não anotassem, dando a entender que não tem tanta importância.
Tipos de mutações:
 Misense ou mutação de ponto.
Uma troca de bases nitrogenadas, uma por outra.
 Nonsense.
Quando inserem um códon de parada prematura (stop códon).
 Frame shift, dois tipos: deleções e inserções.
Deleções, quando deleta e inserções, quando insere. São Frame Shift.
Frame Shift, é quando muda o frame de leitura da enzima: se você inserir uma base, dali para frente muda o frame de leitura. “Como se tivesse uma base sobrando ou faltando, mudando o tamanho”. Muitas vezes insere um stop códon, um códon de parada prematura logo a frente.
Deleções e inserções são frequentes. Quando vamos descrever ou publicar, chamamos de frame shift, ou uma inserção de tantos pares de base ou uma deleção de tantos pares de base.
DIAGNÓSTICO E PESQUISA
Diagnóstico e pesquisa trabalham juntos, sempre. Nós não somos um laboratório de diagnóstico, somos laboratório de pesquisa, que uma das funções é dar diagnostico para a família. Com diagnostico eu consigo verba para desenvolver a pesquisa, sem os pacientes, sem a casuística não se faz nada. Fazemos um TCLE para que ele possa ser convidado a aceitar ou não a participar de uma pesquisa. Se assim for, ele vai ter diagnóstico quando possível, pode demorar até 5 anos. É mais barato para sequenciar na China ou na Coreia do Norte e eles mandam em quinze dias, mais rápido e mais barato que no Brasil.
Primeiramente faz-se a triagem clinica dos pacientes, depois extração de DNA a partir de sangue total periférico. Por exemplo: ele tem hiperplasia, então vamos sequenciar o CYP21A2, para sequenciar preciso amplificar os fragramentos por PCR. Depois Sequenciamento. Depois resultados, que podem ser de sequencias normais ou de mutação/mutações.
SEQUENCIAMENTO DE DNA
1. Triagem Clínica dos pacientes.
2. Sequenciamento do DNA.
Mais ou menos é esse o esquema para se entender a rotina do laboratório.
Sequenciamento do DNA.
· Extração fenólica de DNA a partir de sangue periférico
· Amplificação dos fragmentos por PCR
· Sequenciamento
· Resultados (sequencias normais, mutação ou mutações.
Extração fenólica de DNA a partir de sangue periférico (leucócitos, pois são nucleadas): sangue para facilidade de extração e exposição das ´celulas. demorada, cerca de 2 dias, as chances de contaminação são altíssimas e os resíduos que se gera são muitos. Por isso, pode-se substituir por kit de extração, que é simples.
Esse DNA extraído por kit é uma porcaria, não dá para nada, é pouco e de péssima qualidade. Eu quero um DNA integro, que tenha um monte de DNA. Com a fenólica, consegue-se de 500 a 600 nanogramas por microlitro de DNA, consigo as vezes 1 mL de DNA bom. Com isso, eu tenho DNA para décadas.
Como é esse processo? Primeiro, a lise das membranas celulares e nucleares. Eu uso uma solução para lisar as membranas, solução tampão com detergentes chamado triton X, ele é um detergente poderosíssimo. Uma gota dele fica muito tempo na mão. Ele vai lisar todas as membranas lipoporteicas, onde tem lipídeos ali vai ser lisado. Tudo o que for lipídeo será lisado. Eu faço isso um dia a tarde e termino no outro dia a tarde, porque tenho que deixar overnight com uma proteinase K para digerir todas proteínas.
A proteinase K age 100% a 37%, eu deixoa 12h, para fazer a lise das proteínas. No outro dia eu tenho um volume de DNA, proteínas lisadas e membranas (“sujeiras”). Eu uso o fenol, que tira todas essas sujeiras que tem no DNA (ptns), vai separar o DNA do resto. Você coloca o DNA e separa. Homogeniza o fenol por 5min, centrifuga e fica separado (mostra uma foto com o liquido no tubo separado em duas fases, como “óleo e agua”, DNA não é solúvel). Ali vai estar o seu DNA. Coleta isso, coloca o etanol absoluto gelado e o DNA vai precipitar.
Extraão 2 etapa: acetatp de sódio e etanol. Isso tudo é um resumo da técnica. Depois, retirasse o fenol dessa solução, para isso se uso fenol clorofórmio (inaudível o nome completo da substâcia). Depois, se coloca etanol gelado e pesca o DNA com uma varinha. Dessa forma extraise muito DNA.
Proximo passo: quantificação do DNA, quantos nanogramas por microlitros tem o DNA? Muito ou pouco concentrado? Através do espectrofotômetro, você consegue fazer os cálculos para concentração do DNA. Após, o gel de agarose serve para ver a integridade do DNA. Você extraiu o DNA, está bom, concentrado, se faz o PCR (reação em cadeia da polimerase). Se amplifica os fragmentos. Se vai replicar fragmentos específicos do DNA, então, juntamente com alguns reagentes (taq, dntps (nucleotídeos, porque se precisa de nucleotídeos sintéticos para amplificar o fragmento do DNA), íons, sais e enzimas) e leva até o termociclador. Se coloca no termociclador, fecha e coloca no ciclo. LA tem temperatura de desnaturção, anelamento e síntese. Por 30 vezes (35 ciclos, tem 34 O ciclo que vai desnaturar o DNA, no ponto das pontes de hidrogênio, vai ficar fita simples, depois se abaixa a temperatura até que os primers se anelem, cada primer tem sua temperatura, e depois acontece a síntese, a polimerase vem e sintetiza. Isso é PCR, se faz no laboratório da UFAL.
Então, desnatura, os primers anelam, a polimerase entra e fecha o fragmento. Precisa fazer esse processo para o sequenciamento. Isso se repete geralmente 30x, então, no final, você tem milhões de fragmentos do seu fragmento de interesse. Os primers são os iniciadores, então por exemplo, eu quero amplificar determinado exon e determinado gene. Eu reseto os primers para que ele se anele naquela região e depois se estenda.
Feito isso se testa em gel de agarose, para ver se o fragmento de interesse, se usa um neder (pouco audível esse nome). Se faz um gel, faz um PCR, aí esse gel, esse rastro são bandas inespecíficas. Para o sequencialmente isso não pode. No gel é cortada a banda de interesse, purificando-a, deixando somente essa banda.
Por fim, cora-se com o brometo de etídio, fotografa e salva no computador. Isso tudo é o processo feito para o sequenciamento. Por isso é caro e demorado. Com o sequenciamento eu consigo as bases do gene, todas bonitas, como deve ser.
Encontrada a alteração vamos para o banco de dados para ver se foi publicada ou não. Temos todas as mutações de todos os genes catalogadas.
Tipos de PCR:
PCR convencional (amplifica DNA do paciente, tomar cuidado com todas etapas para ser só indivíduo XX em casos de DDP para não contaminar)
PCR AS (alelo específico, para identificar alterações específicas. Ex: numa família tem determinada mutação, ver se parentes tem alelos. Faz um primer para identificar só esse alelo)
PCR multiplex (verifica vários fragmentos ao mesmo tempo)
PCR nested (PCR da PCR, para amplificar, principalmente em síndrome de Turner)
RT PCR (transcriptase reversa, feita a partir do RNA, sintetizando cDNA)
PCR em tempo real (já vai vendo os picos, 
PCR HOT START (coloca enzima na hr q fita está aberta, na temperatura de desnaturação, abre a máquina e coloca enzima, assim ela pega DNA com fita aberta)
PCR TOUCHDOWN (diminui temperatura para amplificar todos fragmentos),
*** toda reação tem controle branco sem DNA, para verificar se não foi contaminado. Pode ter alelo normal ou mutante amplicado, se tiver os dois é heterozigoto.
SEQUENCIAMENTO É o que há de melhor para diagnóstico de distúrbios monogênicos. Princípio é igual ao da PCR, mas usa nucleotídeos finalizadores, em que cada nucleotídeo tem uma cor. Antigamente era feito com fósforo 32 (ACTG)
Análise dos resultados: faz sequenciamento da fita sense e antisense em poços diferentes, para conferir. Programa: Chromas Lite. CLC Seuqence Viewer (bota seuqencia normal, sense e antisense, para ver se tem alteração e se essa alteração já foi descrita ou não. Onde se vê as alterações: Ensembl Genome Browser; confirma alteração no The Human Gene Mutation Database. Se não foi descrita, fazer analise preditiva e in vivo em modelo animal
Resumo do sequenciamento genético:
1. Lise das membranas com detergente.
2. Lise das proteínas, proteinase K.
3. Separação do DNA, fenol.
4. Coleta do DNA.
5. Quantificação do DNA.
6. Ampliação dos fragmentos de interesse do DNA, método PCR.
7. Coloca em gel de agarose, e faz a separação.
8. Cora com Brometo.
9. Fotografa.