Aulas Práticas de Bacteriologia

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AULAS PRÁTICAS
BACTERIOLOGIA
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MEIOS SELETIVOS E DIFERENCIAIS
Adicionar 25g da amostra em 225 mL do caldo de pré-enriquecimento (caldo lactosado);
Homogeneizar por 60 segundos;
Incubar a 35°C por 24 horas; 
Pré-enriquecimento
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Ágar 
Salmonella Shiguella 
SALMONELLA 
Todas as espécies do gênero são consideradas potencialmente patogênicas para o homem;
A única via de entrada destes microrganismos no corpo humano é a oral, por isso é de suma importância a análise dos alimentos para detectar sua presença.
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Agitar o tubo de enriquecimento e estriar uma alçada do caldo lactosado em placas do ágar SS;
Incubar as placas a 35°C por 24 horas; 
Verificar se há colônias típicas de Salmonella sp.
Objetiva promover o desenvolvimento de colônias de Salmonella com características típicas que as distingam dos competidores, pra posterior confirmação sorológica e bioquímica.
ÁGAR SS 
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ÁGAR SS 
É um meio seletivo e inibe microrganismos gram-positivos e outras Enterobacteriaceae que não a Salmonella e a Shigella ;
A diferenciação de organismos entéricos consegue-se através da incorporação de lactose no meio; 
Os organismos que fermentam a lactose produzem ácido que, na presença do indicador vermelho neutro, resulta na formação de colônias vermelhas. 
Essa inibição ocorre devido ao seu teor de sais biliares, corante verde brilhante e citratos;
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Os organismos não fermentadores da lactose (Salmonella e Shigella) formam colônias incolores;
O tiosulfato de sódio e o citrato férrico permitem a detecção da produção de sulfeto de hidrogênio pelo crescimento de colônias com centros pretos. 
ÁGAR SS 
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ÁGAR SS (Diagnóstico Presuntivo) 
Salmonella sp.
Shigella sp.
Escherichia coli
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Ágar 
MacConkey
ÁGAR MACCONKEY 
É um meio seletivo para enterobactérias destinado à detecção, isolamento, contagem de coliformes e patógenos intestinais da água, laticínios e materiais biológicos;
Organismos que fermentam lactose, produzem pH localizado, o qual, seguido pela absorção do vermelho neutro contido no meio, confere uma coloração vermelha ou rósea à colônia, enquanto que colônias não fermentadoras de lactose permanecem incolores ou transparentes; 
Bastonetes Gram-positivos têm seu crescimento inibido pela presença de sais biliares e cristal violeta. 
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ÁGAR MACCONKEY 
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Ágar 
VRB
(Violet Red Bile)  
ÁGAR VRB 
É utilizado para a contagem de coliformes em alimentos;
As colônias de coliformes apresentam uma coloração vermelha das mesmas e a precipitação dos sais biliares. 
A Mistura de Sais Biliares e Cristal Violeta inibem a maioria das bactérias Gram-positivas. 
A Lactose é a fonte de carboidrato. 
O Vermelho Neutro é o indicador de pH. 
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Ágar 
CLED
(Cystine Lactose Eletrolyte Deficient)  
ÁGAR CLED 
É um meio de cultura, destinado ao isolamento, quantificação e identificação presuntiva de diversos microrganismos em amostras de urina;
Possui coloração verde clara onde apresenta coloração azul para colônias de microrganismos lactase negativos e amarelada para lactase positivos;  
Permite a cultura e contagem de bactérias gram- positivas, gram-negativas e leveduras, impedindo o crescimento de Proteus spp.
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COLORAÇÃO DE GRAM
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COLORAÇÃO DE GRAM
A coloração é um dos passos mais importantes para a identificação bacteriana;
A finalidade é facilitar a observação microscópica das bactérias e diferenciá-las quantos às suas características morfotintoriais .
A Coloração de Gram é uma das mais importantes e rotineiras em Microbiologia;
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PREPARO DO ESFREGAÇO
Colocar no centro da lâmina, com a alça de platina estéril uma alçada do material a ser examinado;
Espalhar cuidadosamente com movimentos circulares;
Se o material estiver em meio sólido, colocar previamente uma gota de água no centro da lâmina e sobre esta colocar uma alçada do material. Misturar e espalhar;
Esperar o material secar;
Fixar o esfregaço pelo calor, passando a lâmina três vezes pela chama do bico de Bunsen ou lamparina. O aquecimento fixa e mata as bactérias;
Deixar a lâmina esfriar
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Cobrir o esfregaço com violeta de genciana durante 1 minuto;
Escorrer o corante e lavar rapidamente em água corrente (do lado contrário ao esfregaço);
COLORAÇÃO DE GRAM
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Cobrir a preparação com lugol, durante 1 minuto;
Escorrer o corante e lavar em água corrente;
COLORAÇÃO DE GRAM
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Diferenciar com álcool etílico a 95% por 30 segundos;
Lavar em água corrente;
COLORAÇÃO DE GRAM
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Cobrir a lâmina com fucsina diluída durante 30 segundos;
Lavar em água corrente;
COLORAÇÃO DE GRAM
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COLORAÇÃO DE GRAM
Secar o lado da lâmina aposto ao esfregaço com papel toalha;
Deixar a lâmina secar ao ar e/ou próximo da chama do bico de Bunsen; 
Examinar em microscópio de luz utilizando a objetiva de imersão (100x). (Colocar uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço).
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1 minuto
1 minuto
30 segundos
30 segundos
O tratamento com álcool extrai os lipídeos, resultando em uma porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das bactérias Gram-negativas.
O complexo cristal violeta-iodo (CVI) pode ser retirado e as bactérias Gram-negativas são descoradas. 
COLORAÇÃO DE GRAM
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A parede celular das bactérias gram-positivas, torna-se desidratada durante o tratamento com álcool, a porosidade diminui, a permeabilidade é reduzida e o complexo CVI não pode ser extraído.
COLORAÇÃO DE GRAM
        Outra explicação baseia-se também em diferenças de permeabilidade entre os dois grupos de bactérias. Nas Gram-positivas, o complexo CVI é retido na parede após tratamento pelo álcool-acetona, o que causa, provavelmente, uma diminuição do diâmetro dos poros da camada de glicopeptídeo ou peptideoglicano da parede celular. A parede das bactérias Gram-negativas permanece com porosidade suficientemente grande, mesmo depois do tratamento com álcool acetona, possibilitando a extração do complexo CV-l.
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