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Microbiologia Geral Primeiras células vivas no planeta Existem a bilhões de anos Antes do surgimento de plantas e animais Diversidade genética e fisiológica Paul Ehrlich (1854-1915) “Pai da quimioterapia” Conceito de “bala mágica” combater e destruir o Patógeno sem prejudicar o hospedeiro. Salvarsan = derivado do arsênico Salvação contra a sífilis Prevenção Tratamento Diagnóstico Controle 99% das bactérias são benéficas, a maioria dos micro-organismos contribui de modo essencial na manutenção do equilíbrio dos organismos vivos e dos elementos químicos no nosso ambiente. Base da cadeia alimentar marinha; Papel fundamental na fotossíntese; Degradação de matéria orgânica e incorporação de nutrientes no solo; Reciclagem de elementos vitais: conversão de C, N, O2, S e F; Biorremediação: eliminação de poluentes e resíduos tóxicos; Tratamento de efluentes (esgotos, dejetos); Controle de pragas: “inseticidas biológicos”; Melhoramento vegetal: inserção de genes microbianos; Digestão e síntese de vitaminas no intestino de animais e seres humanos; Microbiota da pele de animais e seres humanos; Indústria de alimentos: chucrute, picles, azeitona, molho de soja, manteiga, Vinagre, bebidas alcoólicas, queijos, iogurte, pão, dentre outros; IMPORTÂNCIA DOS MICRO- ORGANISMOS Síntese de produtos químicos: vitaminas, ácidos orgânicos, álcoois, drogas, etc.; Produção de compostos: antibióticos, enzimas, vacinas, hormônios, dentre outros. Existem mais micro-organismos em nosso corpo do que células humanas (100 trilhões). Existem mais micro-organismos em nosso corpo que toda população do planeta. Micro-organismos inativados ou atenuados são usados para fazer vacinas. Estima-se que os micro-organismos produziram aproximadamente a metade do oxigênio encontrado na atmosfera Cada grama de fezes contém 10 bilhões de micro-organismos Estudo da diversidade dos organismos e suas relações. FILOGENIA: Relações evolutivas entre os organismos. TAXONOMIA: (taxis = arranjo, ordem; nomos = lei). Caracteriza, nomeia e posiciona os organismos em grupos, de acordo com suas relações naturais. Espécie Gênero Família Ordem Classe Filo Reino Subespécies Subgênero Subfamília Superfamília Subordem Superordem Infraclasse Subfilo Espécie eucariótica: Grupo de organismos intimamente relacionados que se reproduzem entre si. Gênero eucariótico: Espécies que se diferem entre si em certas características, mas são relacionadas pela descendência. Espécies procariótica: Micro-organismos se reproduzem assexuadamente. População de células com características similares. Distintas de espécies de outros gêneros 1) Como determinar a que espécie, gênero e família pertence uma bactéria? É difícil definir o que constitui uma espécie bacteriana. Muitas vezes são muito semelhantes dificultando essa identificação. 2) Qual o critério usado para definir espécie bacteriana? Existe limitações práticas para a identificação Bactérias não possuem características morfológicas distintas, como eucariotos. A definição de espécies procariotos é problemática, pois: É difícil definir o que constitui uma espécie bacteriana; Existem limitações práticas para a identificação. Bactérias não possuem características morfológicas distintas, como eucariotos. A reprodução é assexuada e existe promiscuidade genética entre cepas. Acontece mutação ou recombinação genética nessa multiplicação de bactérias. Não há nenhum consenso sobre definição de espécies bacterianas. Duas cepas pertencem à mesma espécie quando apresentam 70% de hibridação DNA-DNA. Corresponde a 95% de identidade nucleotídica média entre as cepas. 99% das espécies procarióticas presentes em ambientes naturais não são cultiváveis em laboratório. 1. Como determinar a que espécie, gênero e família pertence uma bactéria? Taxonomia “polifásica” Método fenotípico: Características morfológicas, metabólicas, fisiológicas e químicas. Método genotípico: Aspectos comparativos no que se refere ao genoma (Proteínas< DNA, RNA). Método filogenético: Relações evolutivas utilizando dados de sequências moleculares. OBS: Bactérias Fastidiosa, bactérias de difícil cultivo. Amostras: matéria coletada Coleta de fezes, sangue, urina... CULTURA: micro-organismo que cresce e se multiplica em um recipiente contendo meio de cultura. COLÔNIA: massa visível de células microbianas que formam partir de uma única célula / grupo de células do mesmo micro- organismo. CLONE / LINHAGEM: micro- organismos da mesma origem clonal (geneticamente idênticos). ESTIRPE / CEPA: isolado que já foi bem caracterizado e sobre o qual já se possui certo conhecimento. ISOLADO Cultura pura: quando é só um micro-organismo Cultura mista: quando há mais de um micro-organismo na mesma placa. Colônias coalescentes, quando há uma quantidade muito grande e as bactérias se juntam, e é necessário fazer uma separação. Cultura proveniente de uma coleção de culturas reconhecida nacional ou internacionalmente, acompanhadas de um certificado contendo a descrição de suas características fenotípicas e genotípicas e outras informações relevantes. PATOTIPO: grupamento de micro- organismos que tem um poder patogênico similar. SOROTIPO / SOROVAR: cada um dos tipos antigênico que, apesar de diferentes, pertencem a mesma espécie. BIOTIPO: subgrupo de um sorotipo/ sorovar baseado em propriedades bioquímicas ou fisiológicas. Diversidade taxonômica é igual a diversidade genética? Taxonômica: Família, espécie, classe e ordem. Genética: Cepas, sorotipos, variantes dentro das mesmas espécies. Não são compostos por células Não se reproduzem independentemente Não se desenvolvem no meio de cultura Patogenicidade: capacidade de causar doenças. 1. Como determinar a que espécie, gênero e família pertence um vírus? Tipo de ácidos nucleico DNA – RNA Organização do genoma Estratégia de replicação Estrutura do vírion 2. Qual o Critério usado para definir espécie viral? Sequência do genoma: Ex.: (AAAGGTA) Hospedeiros naturais Tropismo de tecidos e células, pré-direção, para determinados órgãos. Forma de transmissão, oral, nasal, ocular... Propriedades físico-químicos, (alguns testes). Propriedades antigênicas: tudo que é reconhecido pelos anticorpos, membrana, espiculas... Critérios práticos para classificação em espécies: Epidemiológicos e/ou clínico-patológicos Respiratórios (ex: rinovírus, calicivírus) Entéricos (ex: coronavírus, rotavírus) Arbovírus (ex: vírus da febre amarela, vírus da dengue) Oncogênicos (ex: retrovírus, papilomavírus) Grupos de vírus muito semelhantes entre si, mas que apresentam algumas diferenças que justificam a sua classificação como vírus diferentes. Distintos de espécies de outros gêneros. “Espécie de vírus é uma classe polythetic de vírus que constitui uma linhagem replicativa e ocupa um nicho ecológico particular”. Classe polythetic: amplo grupo de critérios, sendo que nenhum dos critérios isoladamente é necessário ou suficiente. “A classificação em subespécies, cepas, variantes e isolados não existe de forma oficial, embora sua importância seja reconhecida para o diagnóstico, para estudos biológicos e moleculares e também para a produção de vacinas. ISOLADO: vírus que foi obtido por isolamento de uma determinada fonte de infecção. CEPA: isolado que já foi bem caracterizado e sobre o qual já se possui certo conhecimento. OBS: Podem apresentar pequenas variações sem deixar de pertencer às mesmas categoriastaxonômicas. Exemplo: Vírus da doença de Newcastle (NDV) Cepas lentogênicas ou vacinais: baixa virulência; Cepas mesogênicas: virulência moderada, sinais respiratórios e nervosos; Cepas velogênicas: alta virulência, devastadoras Escrito em latim ou latinizado Exemplo: Homo sapiens Homem sábio Nome sublinhado ou itálico: Sistema Binomial: Em textos quando for a primeira vez mencionado é necessário escrever o nome completo depois podendo abrevia- los. Abreviações dos vírus: Bovino herpesvirus type 1 BOHV - 1 Aphtovirus FMDV Flavovirus Flavovírus Introdução a bacteriologia Tamanho Forma Estrutura Arranjos Diâmetro: 0,2 a 2,0 micrometros (µm); Comprimento: 2,0 a 8,0 micrometros (µm). Pleomórficas: Não possuem formas definidas, pode acontecer devido ao envelhecimento do meio de cultura. E algumas já são pleomórficas. O que determina a forma de uma bactéria é a hereditariedade, isso já faz parte do genoma dela. Diplococos Estreptococos Tétrade Sarcinas Estafilococos Estafilococos Arranjo Staphylococos spp. Gênero Bacilo isolado Diplobacilo Estreptobacilos Cocobacilos Bacíl Arranjo Bacillus anthrois Gênero Vibrião Espirilo Espiroqueta Vibrião Arranjo Vibrio Cholerae Gênero Capsula Parede celular Membrana plasmática Capsula Citoplasma Ribossomos Nucleoide contendo DNA Plasmídeo Flagelos Fimbrios : Divide o que está dentro da célula e fora; Proteínas, lipídeos e carboidratos; 60% proteínas (periféricas e integrais) funciona como um poro para a célula, para a entrada e saída de moléculas na célula. 40% Fosfolipídios, parte interna apolar, repele água, e a parte externa é polar. Glicoproteínas e glicolipideos. Como se fosse um gel (como um mosaico). Esteróis para deixá-la mais rígida. Ex.: Micoplasma. Função: Permeabilidade seletiva: regular a passagem de água, moléculas e elementos; Limitar o meio externo e o meio interno; Manter a estabilidade do meio intracelular; Produção de energia; Biossíntese de componentes da parede celular; Duplicação do DNA; Secreção (enzimas, toxinas, bacteriocinas, β-lactamases). Processo passivo: A favor do gradiente de [ ] sem gasto de energia (ATP) de concentração. Difusão simples: através da bicamada lipídica. Difusão facilitada: Facilitada através de um transportador não especifico. Osmose: Através de uma bicamada lipídica (esquerda) e uma aquaporina (direita). Processo ativo: Contra o gradiente com gasto de energia (ATP) concentração. Uniport: Passagem de um cátion de dentro para fora; Simport: 2 moléculas ao mesmo tempo para dentro da célula; Antiport: Entra uma e saí outra. Ex: H+ H+ Na+ Na+ Translocação de grupo: Acontece uma alteração na célula e ela não consegue mais sair e permanece lá dentro. Glicose Glicose 6 – P 1. Porque um dano físico à membrana é potencialmente letal para a célula bacteriana? Quando lesiona ela perde a sua função como se fosse um pneu perde a sua função. Ela não tem uma função definida, acredita-se que ele auxilia na divisão. Reveste a membrana plasmática, podendo ser gram positiva ou gram negativa. Características: Estrutura semirrígida Manutenção da forma celular Presente em quase todos os procariotos (exceto micoplasma). Reveste a membrana citoplasmática das bactérias. Função: Proteger contra ruptura; Mantem a forma e confere a rigidez; Ponto de ancoragem dos flagelos Divisão celular; Patogenicidade Local de ação de alguns antimicrobianos; Diferenciação bacteriana: coloração de gram (positiva ou negativa). 15 a 30 camadas de peptideoglicana Ácido lipoteicoico: Álcool (glicerol ou ribitol) + fosfato. Especificidade antigênica – reconhecidos pelos anticorpos Crescimento celular Como se fosse uma rede de pesca. 1. Porque o peptideoglicano é tão resistente? Rede macromolecular, 90% da parede celular. Toda entrelaçada. É formado por carboidratos e proteínas. Lise osmótica – Quando ocorre o rompimento da parede celular, através de bactericidas. Características: Ausência de tecidos. Membrana plasmática + parede celular + membrana externa. Parede celular formada por pepdeosglicanos em poucas quantidades (! e 2). Entotoxina – Faz parte da parede, só é liberada quando se rompe. Exotoxina: Liberada para o meio externo. Proteína da membrana externa 6MP Polissacarídeos O, Lipídeo A Lipolissacarídeos (LPS). Qual é a mais suscetível a rompimento mecânico? Gram – negativa, porque o peptidoglicano é menos expeço. Hidróxido de potássio 3% Gram -: Forma um grude, como se fosse uma meléca. Gram +: Não forma grude. BAAR – Bactéria álcool ácido resistente. Ácido micólico. Corante (fucsina fenicada) Aquecimento (fixação) Descoloração (álcool, ácido) se for + não pode a cor Corante (azul metileno) Água destilada 1. Por que a célula bacteriana precisa de parede celular? Para não explodir. Micoplasmas: não possuem parede celular. Membrana citoplasmática, resistente – esteróis. Resistente à antimicrobianos que agem na parede. Substância polimérica extracelular (SPE) Glicocálice: Polímero viscoso e gelatinoso (polissacarídeos, polipeptídios ou ambos); Aderido fracamente à parede celular: camada viscosa/mucosa/limosa; Aderido fortemente à parede celular: cápsula Cápsula: Fatores de virulência: ligação às células do hospedeiro e evasão do sistema imune (fagocitose, pH estomacal); Formação de biofilme; Resistência à dessecação; Fonte de nutrientes. Exemplos: Bacillus anthracis, Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae Proteção do sistema imune Resistência à antimicrobianos Resistência à desinfetantes Bacilos e espirilos: comum Cocos: raro Longos e finos apêndices filamentosos (15 a 20 μm x 12 a 20 nm); Movimento celular: rotação; Velocidade muito elevada (100 μm/s); Distância superior ao seu comprimento (3.000 x/min). Atríqueas: não possuem flagelos Peritriqueo: Possuem flagelos por toda a volta. Monotriqueo e polar: 1 flagelo em 1 polo Lofotriqueo: Vários flagelos em 1 polo Anfitriqueo e polar: Ambos os polos Auxiliando no movimento dessas células bacterianas – fatores físicos e químicos. Vírus Virologia: Estudo dos vírus Vírus: Veneno ou fluido venenoso Adolf Mayer (químico): 1886 Doença do mosaico do tabaco (DMT) transmissível entre as plantas Dimitri Ivanovsky (botânico): 1892 Filtração da seiva de plantas doentes e inoculação em plantas sadias Plantas sadias contraíram a doença: agentes filtráveis Martinus Beijerinck (naturalista e botânico): 1899 Princípio infeccioso vivo, mas fluido (contagium vivum fluidum) Agente desconhecido: não cultivável em meios de cultura (≠ bactérias) “Pai da virologia”: conceito de vírus Microscopia eletrônica: 1939 Friedrich Loeffler e Paul Frosch: 1898 Primeiro agente filtrável dos animais: vírus da febre aftosa Teoria da Evolução Retrógrada Descendentes de parasitas intracelulares que teriam perdido sua autonomia metabólica durante o processo de evolução. Bagagem genética: manutenção da identidade e capacidade de replicação. Teoria da Origem Celular Componentes celulares (plasmídeos ou RNA) que por recombinação teriam adquirido um invólucro proteico, tornando-se independentes SERES NÃO VIVOS: não captam nutrientes e energia do ambiente, não tem metabolismo próprio, não se reproduzem e geram descendentes. SERES VIVOS: se replicam eevoluem em resposta ao ambiente. “ENCONTRAM-SE NO LIMITE ENTRE SERES VIVOS E NÃO VIVOS” Fora da célula: não se reproduzem de forma autônoma. Dentro da célula: adquirem capacidade de replicação. Composição molecular do genoma: DNA ou RNA Similaridade de sequências: homologia Expressão gênica: produção de proteínas virais Estrutura do capsídeo Presença ou ausência de envelope Gama de hospedeiros Patogenicidade A classificação em subespécies, cepas, variantes e isolados não existe de forma oficial, embora sua importância seja reconhecida para diagnóstico, estudos biológicos e moleculares, e para a produção de vacinas. ” 1. Oque é um vírus? Parasita intracelular obrigatório. Agente infiltráveis. Micro-organismos acelulares São visualizados em microscópio eletrônico. Estão entre os menores agentes infecciosos que existem Vírus: 12 a 400 nm Vírus gigantes: mimivírus e pandoravírus (400 a 750 nm) Bactérias intracelulares: rickettsias (300 a 600 nm) clamídias (200 nm) Esprecto do hospedeiro: Variedade da célula hospedeira que o vírus pode infectar. Tropismo: Predileção por células, tecidos ou órgãos. Interação especifica entre receptores presentes na superfície da partícula viral e da célula hospedeira. Usam a maquinaria metabólica da célula hospedeira. Induzem a síntese de estruturas especializadas na transferência do genoma para o seu metabolismo. Pouca ou nenhuma enzima própria para o seu metabolismo. Não se replicam sozinhos Não possuem trRNA e rRNA; Contém um único tipo de ácido nucleio: DNA ou RNA Vírus com DNA fita simples ou dupla: linear ou circular Vírus com RNA fita simples (polaridade + ou -) ou dupla: linear ou segmentado Contém as informações genéticas para sua propagação Função: rigidez, proteção e forma Composição: subunidades proteicas CAPSÔMEROS Organização dos capsômeros: característica para cada tipo de vírus ICOSAÉDRICO HELICOIDAL COMPLEXO Presente em alguns vírus: DNA ou RNA / icosaédrico ou helicoidal Constituição: lipídeos, proteínas e carboidratos Dupla camada lipídica: membranas celulares (fosfolipídios + colesterol) Proteínas: proteína matriz + proteínas de superfície (glicoproteínas). Projeções de glicoproteínas na superfície do envelope: ESPÍCULAS Conjunto de glicoproteínas: peplômeros Interações entre o vírion e a célula hospedeira Ligação, penetração, fusão e disseminação “Ancoragem” da célula hospedeira Liberação do vírion da célula Importantes antígenos virais Ex.: Influenzavirus: alterações constantes nas espículas por mutações, dificultando a imunização permanente Proteínas estruturais: estrutura física (capsídeo e envelope) Proteínas não-estruturais (enzimas): processo de infecção e replicação Transcrição do genoma Processamento de proteínas Regulação da expressão gênica celular e viral Regulação do ciclo replicativo do vírus Neutralização de mecanismos de defesa do hospedeiro Transformação celular. Algumas enzimas importantes: Lisozima: digestão de carboidratos de alto peso molecular, presentes em alguns bacteriófagos; Polimerases de ácidos nucleicos: replicação do genoma viral e transcrição de RNA viral; Neuraminidases: liberação das partículas virais da célula hospedeira. Enzima transcriptase reversa: transcrição de uma cadeia de DNA a partir de um molde de RNA. Podem ser classificados em tipos morfológicos diferentes, com base na arquitetura do capsídeo. Vírus icosaédrico, helicoidal ou complexo. O capsídeo tem forma de um icosaedro (20 faces triangulares e 12 vértices) Os capsômeros de cada face formam um triângulo equilátero Rompimento do envelope aparência típica de “ovo frito” Lembram bastões longos, que podem ser rígidos ou flexíveis O genoma viral está no interior do capsídeo cilíndrico e oco Ex.: Influenza Possuem estruturas adicionais e complexas Adsorção: Interação espeficica entre proteínas presentes na superficie viral e receptores da célula hospedeira. Penetração: entrada da partícula viral na célula hospedeira; Desnundamento: liberação do ácido nucleico viral por meio da desnaturação de proteínas do capsídeo; Biossíntese: material genético viral reprograma a célula hospedeira para fabricar componentes virais (transcrição, tradução e replicação); Montagem/ maturação: as novas partículas virais são montadas após replicação do ácido nucleico e síntese de proteínas virais; Liberação: as novas partículas virais são liberadas para infectar novas células e produzir mais partículas virais. 1. Adsorção 2. Penetração 3. Desnudamento 4. Biossíntese: transcrição/tradução 5. Biossíntese: replicação 6. Montagem/maturação 7. Liberação Adsorção: Ligações nas células. Penetração: Fusão da membrana: vírus envelopado (proteína de fusão). Endocitose: Vírus envelopados e não envelopados. Pinicitose: Não envelopados e bacteriófogos. Translocação: não envelopados e bacteriófogos. Não envelopados: Envelopados: Separação do ácido nucleico viral de seu envoltório proteico. TRANSCRIÇÃO: produção de mRNA TRADUÇÃO: leitura da informação genética contida no mRNA Proteínas reguladoras da expressão gênica Proteínas estruturais Proteínas funcionais (enzimas) REPLICAÇÃO: produção de novos ácidos nucleicos Vírus de DNA: no núcleo Vírus de RNA: no citoplasma Classificação de vírus baseada na relação entre o genoma viral e seu RNAm. Local: Citoplasma Retículo endoplasmático Aparelho de Golgi Próximo a membrana dentro do núcleo Lise: o vírus rompe a membrana celular. Passagem para células vizinhas: atravessam a membrana de uma célula para a outra (tecidos epiteliais). Formação de sincício: fusão da membrana plasmática de várias células formando uma célula gigante multinucleada (proteína de fusão viral). Brotamento: o vírus brota da célula carregando a membrana. Local: Membrana plasmática Membrana nuclear RER Aparelho de Golgi Utilizados como vetores de clonagem para inserir sequências de DNA. Alternativa aos antibióticos para tratar infecções Controle de infecções bacterianas em animais de produção. Matar bactérias é o que os fagos fazem de melhor Importância: Bacteriófagos Utilizados como vetores de clonagem para inserir sequências de DNA Alternativa aos antibióticos para tratar infecções Controle de infecções bacterianas em animais de produção Matar bactérias é o que os fagos fazem de melhor Terapia gênica: tecnologia do DNA recombinante, vírus como vetores de informações genéticas. Terapia oncológica: capacidade que alguns vírus têm de destruir preferencialmente células cancerosas e de poupar células normais. Produção de vacinas Cultivo de vírus animais em laboratório (in vivo /in vitro) Em animais vivos Em ovos embrionados Em culturas de células Cultivo de bacteriófagos em laboratório Em meio líquido e sólido Método da contagem da placa de lise: detecção e quantificação : Isolamento e identificação de vírus Inoculação em camundongos, coelhos e cobaias; Observação de sinais clínicos; Sacrifício; Coleta e análise de tecidos; Identificação de partículas virais. Isolamento e identificação viral Perfuração com injeção de suspensão viral ou tecido suspeito; Morte do embrião, danos às células embrionárias ou formação de lesões típicas nas membranas. Produção de vacinas Ovo embrionado de galinha SPF Livre de patógenos específicos Destruição da monocamada celular (efeito citopático – ECP) Linhagem celular. Fezes Fluidos (sangue,leite, sêmen, fluidos fetais, fluidos de lavados, fluidos vesiculares, descargas uterinas) Swabs (cavidade bucal, cavidade nasal, olho, pele, vagina, pênis, cotilédones) Tecidos (fígado, pulmão, rim, baço, linfonodos, coração, cérebro, músculo, intestino, pele) Avaliação de lesões macroscopicamente e por histopatologia Detecção de vírions ou ácido nucleico viral Sorologia Partículas proteicas infecciosas: NÃO SÃO VÍRUS Glicoproteína PrPc convertida em PrPSc Não contem ácido nucleico (sem material genético) Causam doenças neurodegenerativas, fatais, de progressão lenta Carneiros: scrapie (doença da coceira) Bovinos: encefalopatia espongiforme bovina (EEB ou BSE) Humanos: doença de Creutzfeld-Jacob (CJD) e kuru
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