Análise de Ácidos Graxos de Cadeia Curta em amostras fecais por Headspace - Cromatografia em fase gasosa

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Centro de Educação Superior do Oeste
Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos – PPGCTA 
Disciplina: Análise Instrumental de Alimentos
Análise de Ácidos Graxos de Cadeia Curta em amostras fecais por Headspace - Cromatografia em fase gasosa
Introdução
AGCC – 1 a 6 carbonos
Também são chamados de voláteis
Resultam da fermentação bacteriana de CHO não digeridos e fibras.
95% dos AGCC produzidos são rapidamente absorvidos pelos colonócitos, e os resíduos são excretados nas fezes .
ÁCIDO ÁCETICO
Absorvido por bactérias
Rendendo 10% do total de energia diária do corpo humano
ÁCIDO PROPIÔNICO 
Participa da transformação inversa da glicose do piruvato.
Enquanto possivelmente inibe a síntese de gordura
ÁCIDO BUTÍRICO 
Usado principalmente pelas células epiteliais como sua principal fonte de energia 
Importância para a saúde: 
Tratamento de  síndrome metabólica, distúrbios intestinais, e certos tipos de câncer 
Métodos de Análises: 
Cromatografia Gasosa(CG)
Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS)
Cromatografia Líquida ( CL)
Eletroforese Capilar (EC)
Cromatografia liquida por troca iônica(CI)
Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
A injeção direta do sobrenadante extraído das suspensões fecais aquosas no GC é prejudicial para os instrumentos do GC 
Jacqueline Ferreira (JF) - o pré-tratamento antes da determinação directa de amostras biológicas conduz a alta precisão e sensibilidade do a análise. A sensibilidade distinta é provavelmente devido às diferentes técnicas de preparação de amostra e condições analíticas. LC, CE e IC envolvem pré-tratamento rápido da amostra, 
Técnicas de preparação da amostra
extração com solventes orgânico
destilação
ultra- filtração,
microextracção em fase sólida (SPME) 
 HS Salting-out    
1. incubação
2. equilíbrio
3. Um volume fixo de vapor é amostrado e introduzido para dentro do GC
A adição de agente salting-out aumenta a força iônica da solução e diminui a solubilidade dos AGCC.
HS envolvendo pré-tratamento de amostra menor e maior sensibilidade seria desejável para analisar AGCC em amostras biológicas . 
Este trabalho tem como objetivo desenvolver um método HS-GC para rápida identificação e quantificação de AGCC em fezes de ratos.
Produtos Químicos e Reagentes
Ácido acético (C2 )
Ácido propiônico (C3 )
Ácido isobutírico ( iC4 )
Ácido butírico (C4)
Ácido isovalérico ( iC5 )
Ácido valérico (C5 ) 
Ácido 4-metil valérico ( padrão interno )
NaH2PO4  (Fosfato monossódico)
(NH4)2 SO4  (Sulfato de amônio)
H3PO4  (Ácido fosfórico)
Amostra
10 do ileocecal
17 fecais
ratos machos
pesando 160 -200 g
Procedimento de preparação de amostra
100 mg
(amostra)
5 mL 
(solução salina)
pH de 2,5 
Armazenadas
 a - 20 ° C 
882 g.L-1 de (NH4 )2 SO 4 
238 g. L-1 deNaH 2PO 4 
Ácido 4-metil valérico 200 µg. L-1   
H3PO4 
Protocolo HS
As amostras foram colocadas no injetor HS com as seguintes condições:
Pressão do frasco de 14 psi
Agitador de amostra ajustado para alta velocidade, duas extrações por frasco
Temperatura do forno de 50 ° C
Tempo de equilíbrio do frasco de 30 min
Tempo de pressurização do frasco de 0,1 min
Ciclo de 0,15 min tempo de preenchimento
Tempo de equilíbrio de loop de 0,05 min
Tempo de injeção de amostra de 1 min
Temperatura de loop de 75 ° C
Temperatura da linha de transferência de 85 ° C
Tempo de ciclo do GC de 15 min.
Os dados e o processamento da operação foram conduzidos usando o software ChemStation (versão B.0403).
Análise GC
Cromatógrafo de gás Agilent 7890A 
Equipado com um injetor G1888 HS 
Detector de ionização de chama (FID)
Coluna capilar HP-inno-cera com polietilenoglicol como fase estacionária (30 m × 0,32 mm id × 0,50 µm espessura do filme - FE
Gás transportador: nitrogênio  - FM
A temperatura do detector era de 250 ° C.
A injeção foi realizada no modo splitless e a 
temperatura da porta de injeção foi ajustada para 200 °C. 
A temperatura do forno foi inicialmente a 150 °C, aumentada para 190 °C a 5 °C min -1 e, finalmente, a 210 ° C a 20 ° C min-1 e mantida durante 1 min.
Linearidade e Sensibilidade
As soluções padrão de AGCC foram preparadas em gradiente concentrações de 1, 5, 10, 20, 50 e 200 μg L-1 
4,13 
4,13
4,795
5,009
5,615
6,018
6,802
7,248
Amostra ileocecal de rato
Amostra fecal de ratos
O limite de detecção (LOD) e o limite de quantificação (LOQ) de cada composto foram obtidos quando a relação sinal-ruído (S/N) é cerca de 3 e 10, respectivamente.
Resultados e discussão
Melhoramento da extração por adição de um agente salting-out.
A linearidade de todas as curvas de calibração foi boa na faixa de detecção e o coeficiente de correlação linear foi> 0,99.
área
Concentração do analito
Resultados das Concentrações de AGCC em amostra do ileocecal e nas fezes de ratos: 
Conclusões
Método HS-GC sensível e específico, que podiu identificar e quantificar com precisão AGCC em amostras fecais.
O protocolo HS é simples, seguro, pois nenhum solvente é necessário.
A tecnologia de salting-out melhora a sensibilidade.
A análise total levou apenas 10 minutos.
Referência
Zhang, C., Tang, P., Xu, H. et al. Análise de ácidos graxos de cadeia curta em amostras fecais por cromatografia gasosa por headspace. Chromatographia 81, 1317–1323 (2018). https://doi.org/10.1007/s10337-018-3572-7.
Obrigada!!!